梅花HD-Zip III 轉(zhuǎn)錄因子PmHB5克隆與表達(dá)模式分析

鄭唐春，李璐璐，王 佳，程堂仁，張啟翔

（花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家花卉工程技術(shù)研究中心，城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室，園林環(huán)境教育部工程研究中心，林木花卉遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院，北京100083）

植物豐富多樣的株型是經(jīng)過長期進(jìn)化和自然選擇的結(jié)果，是遺傳與環(huán)境互作的復(fù)雜調(diào)控過程［1］。木本植物按照枝型可以分為直枝、垂枝、曲枝等［2］。多樣的植物株型性狀在豐富園藝作物品種與促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。植株株型是由頂端分生組織（SAM）形成的分枝決定的。因此，枝條的數(shù)量和形態(tài)特征對(duì)園藝植物的株型至關(guān)重要。莖頂端分生組織和腋生分生組織（AM）的衍生物，產(chǎn)生植物除子葉以外的所有器官。植物新梢發(fā)育經(jīng)歷3 個(gè)階段：腋生分生組織起始、葉芽初生生長和莖次生生長［3］。眾所周知，芽的發(fā)育是一個(gè)由許多基因精心調(diào)控的生物過程，如腋生分生組織形成相關(guān)的Cup-shaped cotyledon(CUC)、Like Aux(LAX)、HD-Zip III 亞家族基因［4-5］，側(cè)芽形成相關(guān)的Wuschel(WUS)和Clavata(CLV)等基因［6-8］，以及側(cè)芽生長相關(guān)的More axillary branching(MAX)基因［9］。

HD-Zip III 轉(zhuǎn)錄因子是高等植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與植物生長和發(fā)育進(jìn)程。在擬南芥中有5 個(gè)HD-Zip III 亞家族成員，包括Revolula（REV）、Phabulosa（PHB）、Phavolula（PHV）、ATHB8和Corona（CNA、ATHB15）［10-11］。 除 了ATHB8基因外，REV、PHB、PHV和CAN基因均在頂端分生組織中表達(dá)［12］。HD-Zip III 基因也在葉原基的近軸側(cè)表達(dá)，并可調(diào)節(jié)葉片極性建立。REV基因在擬南芥中過量表達(dá)表現(xiàn)出遠(yuǎn)軸側(cè)扁平葉和維管束的產(chǎn)生［11,13］。擬南芥rev突變體顯著降低腋生分生組織活性和花莖分枝［14］，而REV功能獲得突變體jba-1D 和avb1均表現(xiàn)出增大的頂端分生組織和增加的分枝表型，表明REV通過調(diào)節(jié)頂端分生組織活性來調(diào)節(jié)莖分枝［15］。在木本植物楊樹中，REV的同源基因PRE（PtrHB2）和PtrHB7在形成層細(xì)胞分裂激活和次生生長過程發(fā)揮重要作用，其microRNA 靶點(diǎn)突變導(dǎo)致產(chǎn)生異常維管組織［16-17］。

梅花是中國傳統(tǒng)名花，位居十大名花之首，有“花魁”之美譽(yù)，是我國著名的早春木本觀賞植物。梅花雖然品種豐富，但存在株型單一、株型育種周期長等問題，無法滿足市場多樣化、新穎性產(chǎn)品需求，嚴(yán)重制約了梅花產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。前期在梅花中共鑒定出32 個(gè)HD-Zip 轉(zhuǎn)錄因子，RNA-seq 和qRT-PCR 分析顯示HD-Zip III 亞家族基因在莖和葉芽中高表達(dá)［18］，推測HD-Zip III 在調(diào)節(jié)梅花分生組織分化和莖發(fā)育中起重要作用。本研究克隆出PmHB5基因和啟動(dòng)子序列并驗(yàn)證了PmHB5基因的時(shí)空表達(dá)和激素應(yīng)答模式，以期為系統(tǒng)解析PmHB5調(diào)控梅花莖發(fā)育形成機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與試劑

梅花‘飛綠萼’（P.mume‘Fei Lve’）1 年生枝條取自北京林業(yè)大學(xué)鷲峰國際梅園，采集后立即放入水中瓶插；用于RNA 提取的葉芽、莖段、葉片等材料液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中。擬南芥（Arabidopsis thaliana，Col-0）和本氏煙草（Nicotianabenthamiana）由本實(shí)驗(yàn)室保存。pBI121-mgfp、pBI121、pCAMBIA1300super 和pCAMBIA1301 載體均由本實(shí)驗(yàn)室保存。TB Green? Premix ExTaq?II、PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶、PrimeSTAR HS DNA Polymerase、T4DNA 連接酶、In-fusion 重組酶等均購自TaKaRa 寶生物（北京）有限公司。其它試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

利用少量高濃度NaOH 溶液溶解IAA、GA3、BR、KT、ZA 粉末配制母液，隨后用大量ddH2O 稀釋至使用濃度。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 梅花不同組織樣品收集、RNA 提取和cDNA合成 為了檢測梅花PmHB5基因在不同組織的表達(dá)水平，選取長勢(shì)健壯且一致的‘飛綠萼’3 株，收集葉片和不同發(fā)育階段的莖（LBS Ⅰ，發(fā)芽階段葉芽；LBS Ⅱ，展葉階段葉芽；S1-5，第1-5 節(jié)莖尖；S6-10，第6-10 節(jié)莖；S11-15，第11-15 節(jié)莖），以及伸長生長枝條的韌皮部、形成層和木質(zhì)部等液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中。

利用天根RNA 提取試劑盒RNAprep pure Plant Kit 提取梅花不同組織總RNA 并利用NanoDrop-1000 測定樣品RNA 濃度和質(zhì)量，進(jìn)一步使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品RNA 的完整性。參照PrimeScript RT reagent Mix with gDNA Eraser試劑盒操作流程將梅花總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.2 不同組織中PmHB5基因表達(dá)水平分析 利用IDT 在 線 軟 件（https://sg.idtdna.com/scitools/Applications/RealTimePCR/）設(shè) 計(jì) 梅 花PmHB5基因特異性引物（表1）。使用PikoReal PCR 系統(tǒng)和TB Green Premix ExTaqII 試劑盒按照操作流程進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)（qRT-PCR），PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min 預(yù)變性、95 ℃ 5 s 變性、60 ℃20 s 退火，設(shè)置為40 個(gè)循環(huán)。在60 ～95 ℃范圍內(nèi)記錄溶解曲線。以PmPP2A作為參考基因［19］（表1），設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。數(shù)據(jù)下機(jī)后利用采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量［20］。

1.2.3 外源激素處理下PmHB5基因表達(dá)水平分析 為了檢測梅花PmHB5基因?qū)Σ煌に靥幚淼捻憫?yīng)情況，選取長勢(shì)基本一致的‘飛綠萼’植株3株，分別取3 枝基部已木質(zhì)化的當(dāng)年生枝條插入100 μmol/L 的IAA、GA3、BR、KT、ZA 溶液中侵泡12 h，以ddH2O 處理為空白對(duì)照，取溶液面以上2 cm 的莖段用于提取總RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用qRT-PCR 檢測不同激素處理后PmHB5的表達(dá)情況。

1.2.4PmHB5基因和啟動(dòng)子克隆 根據(jù)梅花基因組中PmHB5基因的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物（表1）。以梅花嫩莖cDNA 為模板，通過PCR 反應(yīng)擴(kuò)增目的基因。PCR 程序?yàn)椋?8 ℃ 5 min；98 ℃ 30 s；57 ℃30 s；68 ℃ 3 min；68 ℃ 5 min；反應(yīng)35 個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠（w/v）電泳后，使用天根Universal DNA 純化回收試劑盒（DP214）回收目的片段連接至亞克隆載體pEASY?-Blunt Cloning Vector，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆并送生工生物工程(上海)股份有限公司（簡稱“上海生工”）測序。

使用多糖多酚植物基因組DNA 提取試劑盒提取‘飛綠萼’葉片DNA，并以此為模板，根據(jù)PmHB5基因上游2 000 bp 序列設(shè)計(jì)特異性引物（表1）擴(kuò)增啟動(dòng)子片段。PCR 產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收目的片段連入pEASY?-Blunt Cloning Vector 上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞后挑選陽性克隆送上海生工公司測序。

1.2.5 植物表達(dá)載體構(gòu)建 為驗(yàn)證梅花PmHB5基因的亞細(xì)胞定位情況，根據(jù)PmHB5基因堿基序列，去掉終止密碼子，根據(jù)pCAMBIA1300super 載體序列和PmHB5基因序列設(shè)計(jì)帶有載體同源臂的引物（表1）。通過PCR 擴(kuò)增反應(yīng)出擴(kuò)增目的條帶并利用Sma I酶切pCAMBIA1300super 載體，使用In-fusion 連接酶將純化后的PCR 產(chǎn)物連入pCAMBIA1300super 載體。進(jìn)一步轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 并挑選陽性克隆送上海生工公司測序。

為驗(yàn)證梅花PmHB5基因啟動(dòng)子時(shí)空表達(dá)模式，將梅花PmHB5基因啟動(dòng)子克隆純化后，利用Xba I和Kpn I限制性內(nèi)切酶連入到pBI121-mgfp載體上，構(gòu)建pBI121-PmHB5pro-GUS，驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因GUS基因表達(dá)。

1.2.6 亞細(xì)胞定位 選取測序正確的質(zhì)粒pCAMBIA1300super-35S::PmHB5-GFP轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101 感受態(tài)。將成功轉(zhuǎn)化目的質(zhì)粒的菌株在添加50 mg/L 卡那霉素和50 mg/L 利福平的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min 過夜培養(yǎng)至OD600值為0.4，5 000 r/min 離心5 min 收集菌體，使用重懸液重懸菌團(tuán)至OD600值為0.6 后加入200 μmol/L 乙酰丁香酮制作侵染液。

選取生長2 個(gè)月的本氏煙草植株，利用注射器將重懸后的農(nóng)桿菌菌液注射進(jìn)煙草葉片背面，暗培養(yǎng)24 h 后光照培養(yǎng)48 h。經(jīng)50 ng/mL 4',6- 二脒基-2- 苯基吲哚二鹽酸鹽（4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride，DAPI） 溶 液 染 色15 min 后，利用Leica TCS SP8 激光共聚焦顯微鏡（Leica, Wetzlar, Germany）觀察綠色熒光在細(xì)胞中的分布情況并拍照。

1 2.7 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化與GUS 組織染色 將構(gòu)建好的pBI121-PmHB5pro-GUS轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101 感受態(tài)，選取初花期擬南芥植株，利用花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥。將收獲的T0代種子播種在含有50 mg/L卡那的篩選培養(yǎng)基上，篩選陽性植株并提取葉片DNA 作為模板，利用GUS基因特異性引物（表1）驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因植株。

表1 本文使用的引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

將不同生長狀態(tài)的轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗和不同組織浸泡在GUS 染色液中，使用真空泵將氣壓維持在0.01 Pa 大約30 min 排出組織間氣體。隨后置于37 ℃培養(yǎng)箱中染色5 ～7 h，隨即利用卡諾固定液固定過夜，75%酒精浸泡2 ～3 d 完全褪色后，使用Leica ED4 體式顯微鏡拍照（Leica，德國）。

2 結(jié)果與分析

2.1PmHB5基因和啟動(dòng)子克隆與序列分析

利用梅花嫩莖cDNA 克隆獲得PmHB5基因序列，測序結(jié)果顯示PmHB5編碼區(qū)包含2 523 個(gè)核苷酸序列，編碼840 個(gè)氨基酸。相比于梅花參考基因組，‘飛綠萼’PmHB5基因編碼序列中存在3 個(gè)單堿基突變，蛋白序列無差異，包含18 個(gè)外顯子（圖1A）。通過ExPASY 網(wǎng)站在線分析，推測該基因含有保守的HOX 和START 結(jié)構(gòu)域，編碼蛋白的分子量為大約92.89 kD，等電點(diǎn)為5.83（圖1B）。PmHB5基因的啟動(dòng)子序列中存在大量光響應(yīng)元件，包括AE-box、Box 4、I-box、GT1-motif、G-box、GT1-motif、TCT-motif。同時(shí)，存在許多與激素響應(yīng)相關(guān)的順式元件（P-box、TATC-box、TCA element、ABRE、TGA-element、AuxRR-core、TGACG-motif、CGTCA-motif、ERF）和芽和分生組織特異性表達(dá)元素（as-2-box、CAT-box 和O2-site），推測PmHB5基因參與調(diào)控分生組織和莖的發(fā)育（圖1C）。

圖1 梅花PmHB5基因和啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)及生物信息學(xué)分析Fig. 1 Structure and bioinformatics analysis ofPmHB5gene and promoter sequences

2.2PmHB5表達(dá)模式分析

利用qRT-PCR 方法檢測PmHB5在不同器官（葉片、葉芽和不同發(fā)育階段莖）中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示PmHB5基因在葉片、葉芽和莖中均有不同程度的表達(dá)，PmHB5在LBII、S1-5、S5-10、S11-15中的表達(dá)量均顯著高于葉片中表達(dá)量（圖 2A）。進(jìn)一步研究PmHB5在莖發(fā)育中的功能，從莖中分離出韌皮部、形成層和木質(zhì)部，qRT-PCR 結(jié)果顯示，PmHB5基因在形成層和木質(zhì)部中的表達(dá)量均顯著高于韌皮部中的表達(dá)量（圖 2B），表明PmHB5可能在細(xì)胞分化和枝條木質(zhì)化過程中起到重要作用。

生物信息學(xué)分析顯示，PmHB5基因中存在miRNA 的靶位點(diǎn)，推測miR165/166可能對(duì)PmHB5基因存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，利用qRT-PCR 對(duì)miR165和miR166在梅花嫩莖不同組織中的表達(dá)量進(jìn)行測定，結(jié)果表明miR165和miR166的表達(dá)量均在韌皮部中表達(dá)量最高，在形成層中最低，韌皮部中miR165的表達(dá)量為木質(zhì)部中的171 倍，而形成層中的miR165的表達(dá)量僅為韌皮部的15.2%（圖 2C）；韌皮部中miR166的表達(dá)量為木質(zhì)部中的342 倍，同樣形成層中的miR166的表達(dá)量僅為韌皮部的7.6%（圖2C）。相關(guān)性分析表明，miR165和miR166在梅花莖不同組織中的表達(dá)量呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.999 98，miR165和miR166與PmHB5的 表 達(dá) 量呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值均大于0.96（圖2D）。綜上，梅花miR165和miR166在木質(zhì)部、形成層和韌皮部中的表達(dá)量和PmHB5基因呈相反趨勢(shì)。

圖2 梅花PmHB5和miR165/166在不同組織中的表達(dá)模式分析Fig. 2 Expression analysis ofPmHB5andmiR165/166in different tissues

2.3PmHB5基因?qū)Σ煌に靥幚淼捻憫?yīng)

為了驗(yàn)證PmHB5基因能否響應(yīng)激素處理，使用100 μmol/L 的生長素（IAA）、赤霉素（GA3）、表油菜素內(nèi)酯（BR）、激動(dòng)素（KT）、玉米素（ZA）對(duì)離體枝條進(jìn)行處理12 h 后，檢測PmHB5基因表達(dá)情況。定量結(jié)果表明梅花PmHB5基因均能夠響應(yīng)GA3、IAA、ZA、KT 和BR 激素處理。BR 處理后，PmHB5表達(dá)量變化最大，顯著上調(diào)了2 039 倍；KT 處理后，PmHB5的表達(dá)量上調(diào)了15.4 倍；IAA處理后，PmHB5的表達(dá)量上調(diào)了36.4 倍；而使用兩種細(xì)胞分裂素（ZA 和KT）處理后，PmHB5基因的表達(dá)量也顯著升高（圖3）。

圖3PmHB5基因?qū)Σ煌に靥幚淼捻憫?yīng)Fig. 3 The response ofPmHB5to different hormone treatments

2.4PmHB5基因啟動(dòng)子功能驗(yàn)證

為研究PmHB5啟動(dòng)子的功能，通過擬南芥花序侵染法，利用農(nóng)桿菌將pBI121-PmHB5promoter 轉(zhuǎn)移到擬南芥基因組中并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行GUS 組織染色。結(jié)果表明PmHB5主要在花芽分生組織、側(cè)芽分生組織、花朵、幼嫩葉片以及莖的維管組織中等細(xì)胞分裂和分化活躍部位表達(dá)（圖4A-F）。莖解剖結(jié)構(gòu)顯示，PmHB5主要在形成層和發(fā)育中的木質(zhì)部中表達(dá)（圖4G-H）。此外，PmHB5基因在花瓣的維管組織中表達(dá)量較高（圖4C）。根據(jù)PmHB5基因的表達(dá)部位推測其參與調(diào)控頂端分生組織和維管分生組織的發(fā)育、分化和維持。

圖4PmHB5基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS 在擬南芥中染色Fig.4 GUS staining driven byPmHB5promoters in stem ofArabidopsis thaliana

2.5PmHB5基因亞細(xì)胞定位

為研究PmHB5基因的亞細(xì)胞定位情況，將去掉密碼子的PmHB5序列連入帶有GFP 蛋白的pCAMBIA1300super 載體中， 將重組后的pCAMBIA1300super-35S::PmHB5-GFP亞細(xì)胞定位載體通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化本氏煙草葉片。激光共聚焦顯微觀察結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化pCAMBIA1300super 空載體的煙草葉片下表皮細(xì)胞中，綠色熒光信號(hào)在全細(xì)胞內(nèi)均能被檢測到，而轉(zhuǎn)化pCAMBIA1300super-35S::PmHB5-GFP載體的煙草葉片中，僅在細(xì)胞核中檢測到綠色熒光信號(hào)（圖5），表明PmHB5是定位在細(xì)胞核上的轉(zhuǎn)錄因子。

圖5 PmHB5 蛋白亞細(xì)胞定位Fig. 5 Subcellular localization of PmHB5 proteins

3 結(jié)論與討論

HD-Zips 蛋白屬于同源異型盒基因家族，是植物高度保守的一類轉(zhuǎn)錄因子，常以二聚體形式識(shí)別DNA 上的一對(duì)對(duì)稱序列，并作為轉(zhuǎn)錄激活子或者抑制子調(diào)控靶基因表達(dá)，其調(diào)控活性受microRNA 調(diào)控［21］。HD-Zip 蛋白廣泛參與植物發(fā)育過程，如維管發(fā)育、器官形成、分生組織維持、逆境響應(yīng)等［22］。HD-Zips 依據(jù)DNA 結(jié)合域同源性被分為HD-Zip（I-IV）4 個(gè)亞家族。HD-Zip III 是維持莖尖分生組織模式所必需的轉(zhuǎn)錄因子，其功能缺失或功能獲得突變會(huì)改變維管束模式，從而影響莖的形態(tài)建成。

梅花PmHB5在未展葉的葉芽（LBSII）和莖頂端（S1-5）中有較高的表達(dá)水平，在梅花莖次生生長過程中，PmHB5在形成層中表達(dá)量最高，在分化木質(zhì)部中次之。轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS 組織染色結(jié)果表明梅花PmHB5基因主要在分生組織、維管組織等細(xì)胞生長和分化活躍的部位中表達(dá)。Ko 等通過半定量RT-PCR、Northern blot 和原位雜交等方法證明銀白楊（Populus alba）HD-Zip III 亞家族基因PtaHB1主要在木質(zhì)部中表達(dá)，且在枝條木質(zhì)部形成過程中表達(dá)量逐漸升高［23］。杉木ClHDZ2和ClHDZ3主要在莖中表達(dá)且表達(dá)量均隨著木質(zhì)化程度的提高而增強(qiáng)，推測其參與杉木木質(zhì)部的發(fā)育［24］。取百日草（Zinnia elegans）嫩莖進(jìn)行原位雜交試驗(yàn)，結(jié)果表明ZeHB-10、ZeHB-11和ZeHB-12基因主要在原形成層和分化木質(zhì)部中表達(dá)［25］，與PmHB5在梅花中的表達(dá)模式基本類似。基于PmHB5基因在莖中的表達(dá)模式推測其在梅花莖中參與調(diào)控細(xì)胞分化和枝條木質(zhì)化過程。

HD-Zip III 基因在多種植物中被報(bào)道能夠響應(yīng)多種激素誘導(dǎo)。外施IAA 可以促進(jìn)擬南芥ATHB-8基因表達(dá)［26-27］，在百日草中，油菜素類激素能夠誘導(dǎo)ZeHB-10、ZeHB-11和ZeHB-12表 達(dá)［25］，使 用BR處理后，巨桉（Eucalyptus grandis）中PHB、PHV和ATHB15的表達(dá)量顯著升高［28］。水稻OsHox10基 因 能 夠 響 應(yīng)JA 和ABA 處 理［29］，在 光 皮 樺（Betula luminifera）中，HD-Zip III 基因BlHDZ2、BlHDZ3、BlHDZ4、BlHDZ5均 能 響 應(yīng)IAA 處 理，BlHDZ1和BlHDZ2能夠響應(yīng)油菜素內(nèi)酯處理，GA、IAA、BR 和乙烯利（Ethephon）處理后的第2 天，BlHDZ4表達(dá)量升高［29］。在本研究中，通過對(duì)梅花PmHB5基因啟動(dòng)子中順式作用元件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，PmHB5基因啟動(dòng)子中存在大量光響應(yīng)元件和多種激素響應(yīng)順式作用元件，包括IAA、SA、ET、MeJA、GA 和ABA 等。使用不同激素處理梅花枝條，qRTPCR 檢測結(jié)果表明，PmHB5基因能夠響應(yīng)GA3、IAA、ZA、KT 和BR 等激素誘導(dǎo)，這與長白落葉松HD-Zip 基因?qū)ν庠醇に氐捻憫?yīng)模式類似［31］。Chip-Seq 試驗(yàn)證明擬南芥HD-Zip III 亞家族轉(zhuǎn)錄因子REV能夠直接作用于多個(gè)HD-Zip II γ 和δ 組基因啟動(dòng)子，包括HAT22、HAT14、HAT1、ATHB2、ATHB4等基因，這些基因被報(bào)道能夠響應(yīng)光敏色素參與紅光/遠(yuǎn)紅光（R: FR）誘導(dǎo)的蔭蔽反應(yīng)，在蔭蔽環(huán)境下促進(jìn)擬南芥下胚軸伸長［32-35］。生長素在調(diào)控植物在蔭蔽環(huán)境中的下胚軸伸長方面起著至關(guān)重要的作用，REV轉(zhuǎn)錄因子通過直接激活調(diào)控色氨酸依賴途徑的生長素合成［36］以及生長素運(yùn)輸相關(guān)基 因（LAX2）和LAX3的 表 達(dá)［37］。HD-Zip III 和KANAD1 轉(zhuǎn)錄因子通過相互拮抗共同調(diào)控器官或組織的極性發(fā)育，如莖頂端分生組織、葉片原基、莖和根的維管組織等［38-40］。另外，HD-Zip II 和HD-Zip III 和miR165/166之間存在一個(gè)反饋調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在葉片原基中，miR165/166在遠(yuǎn)軸面抑制HD-Zip III 亞家族基因REV的表達(dá)，而在葉原基遠(yuǎn)軸面，HD-Zip II 亞家族HAT3和ATHB4轉(zhuǎn)錄因子能夠與REV結(jié)合形成異源二聚體抑制miR65/166的表達(dá)從而促進(jìn)HDZip III 亞家族基因的表達(dá)。3 類基因的相互作用共同維持了組織特異性發(fā)育的平衡，導(dǎo)致了扁平葉片的形成［41-42］。