NDV 基因Ⅶ型與基因Ⅱ型感染CEF 后microRNA 表達(dá)譜分析

薄一丹，龐洪澤，趙 款,2，雷白時(shí),2，蔣文明，袁萬(wàn)哲,2，張武超,2，劉聚祥

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001；2. 河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心, 河北 保定 071001；3.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東 青島 266032）

新城疫（Newcastle disease, ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）引起的一種烈性、高度致死性禽類(lèi)傳染性疾?。?］。NDV 屬于副粘病毒科，禽腮腺炎病毒屬，單股、負(fù)鏈、不分節(jié)段的RNA 病毒［2］。目前國(guó)內(nèi)以基因Ⅶ型為主要流行毒株，可造成免疫雞群中出現(xiàn)非典型新城疫癥狀［3］。基因Ⅶ型NDV 強(qiáng)毒株與早期強(qiáng)毒株F48E9株（Ⅸ型）和Hert33 株（Ⅳ型）相比，其在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的復(fù)制能力更強(qiáng)，可以引起更加嚴(yán)重的免疫系統(tǒng)損傷［4］。

microRNA（miRNA）又稱(chēng)微小RNA，一般由20 ～25 個(gè)核苷酸組成內(nèi)源性的單鏈RNA，廣泛存在于各種動(dòng)植物細(xì)胞中［5］。miRNA 為非編碼RNA，本身并不能翻譯成蛋白質(zhì)，可通過(guò)與靶基因3’UTR 區(qū)域結(jié)合起到對(duì)目的基因的調(diào)控作用［6］。mi RNA 通過(guò)上述這種調(diào)控方式，在病原體入侵以及機(jī)體自身的免疫反應(yīng)過(guò)程中均發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，如miRNA-32 可以通過(guò)靶向病毒基因組起到抑制翻譯的作用［7］；然而病原體自身也會(huì)編碼產(chǎn)生miRNA，用來(lái)幫助病毒抵抗機(jī)體的免疫反應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)免疫逃逸［8］，如人巨細(xì)胞病毒（hCMV）可以通過(guò)下調(diào)miR-UL112 來(lái)抑制NK 細(xì)胞對(duì)病毒的殺傷作用［9］。

Ingle H 等人在2015 年率先證明miR-485 在調(diào)節(jié)NDV 感染中發(fā)揮重要作用［10］，但直到現(xiàn)在關(guān)于miRNA 與NDV 之間相互作用的研究仍較少，因此，深入解析NDV 感染雞胚成纖維細(xì)胞（Chicken embryo fibroblasts,CEF）后miRNA 的表達(dá)情況，對(duì)研發(fā)新型防治藥物具有重要意義。本研究利用我國(guó)現(xiàn)流行的NDV 基因Ⅶ型流行毒株HB 株與疫苗毒株La Sota 株分別感染CEF 后，通過(guò)高通量技術(shù)對(duì)比分析La Sota 株與HB 株感染CEF 36 h 后，宿主細(xì)胞miRNA 的差異表達(dá)情況，為進(jìn)一步揭示miRNA在NDV 感染宿主細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮的調(diào)控作用提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒株、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

NDV 基 因Ⅶ型HB 株（GenBank 登 錄 號(hào)：MK342603）、La Sota 毒 株（GenBank 登 錄 號(hào)：AF077761）均由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心保存；SPF 雞胚購(gòu)自于山東昊泰實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司?？俁NA 提取試劑Trizol、RNAiso for Small RNA、Mir-XTmmiRNA First-Strand Synthesis Kit 和Mir-XTmmiRNA qPT-PCR TB Green Kit 均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司； 1xPBS、青霉素鏈霉素混合溶液購(gòu)自于北京索萊寶科技有限公司；FBS 胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基、胰酶均購(gòu)自于Gibco 公司；TPCK 胰酶購(gòu)自于Sigma 公司。

1.2 NDV 一步生長(zhǎng)曲線(xiàn)的繪制

將HB 株、La Sota 株 分 別 按 照MOI=1 感 染CEF 細(xì)胞，在感染后12、24、36、48、60 和72 h收集病毒液，反復(fù)凍融3 次后，按照Reed-Muench法測(cè)定并計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)TCID50，繪制一步生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.3 測(cè)序樣品制備

共分為2 組：HB 株（MOI=1）感染CEF 組及La Sota 株（MOI=1）感染CEF 組，每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。細(xì)胞接毒后培養(yǎng)36 h，棄去上清，加入Trizol 收集細(xì)胞懸液，干冰保存，送至南京派森諾基因科技有限公司。

1.4 文庫(kù)構(gòu)建和sRNA 深度測(cè)序

使用 TruSeq sRNA 樣品制備試劑盒（Illumina,USA）合成并擴(kuò)增 cDNA，從 PAGE 凝膠中提取和純化 145 ～160 bp PCR 擴(kuò)增片段，根據(jù)制造商的說(shuō)明，合格文庫(kù)中的 DNA 片段在 Illumina HiSeq 2500儀器（Illumia Inc,USA）上進(jìn)行測(cè)序。

1.5 miRNA-seq 數(shù)據(jù)處理及分析

1.5.1 已知miRNA 及novel miRNA 的鑒定 測(cè)序完成后，對(duì)所有的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量篩選，其中堿基長(zhǎng)度小于15 nt 大于30 nt 的數(shù)據(jù)以及未匹配上的數(shù)據(jù)都將被刪除過(guò)濾。過(guò)濾后數(shù)據(jù)通過(guò)與miBase 數(shù)據(jù)庫(kù)參考雞源基因組(http://ftp.ensembl.org/pub/release103/fasta/gallus _gallus/dna/Gallus_gallus.GRCg6a.dna.toplevel.fa.gz）進(jìn)行對(duì)比來(lái)注釋sRNA，篩選對(duì)比已知miRNA。對(duì)已知miRNA 進(jìn)行首位堿基以及各點(diǎn)位堿基偏好性進(jìn)行分析。通過(guò)miRNA 預(yù) 測(cè) 軟 件miR Evo（miR Evo_vl.1）和Mirdeep2（mirdeep2_0_0_05）預(yù)測(cè)novel miRNA，并對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)、成熟體以及靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.5.2 差異表達(dá)miRNA 的篩選 根據(jù)各樣品中 miRNA 的表達(dá)量數(shù)據(jù)，采用 DESeq（version 1.18.0，Anders S 和 Huber W，2010） 對(duì) miRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析，并按照表達(dá)量倍數(shù)差異（|log2FoldChange|>1）和表達(dá)差異，顯著性（P-value＜0.05）篩選出差異的保守 miRNA，通過(guò)R 語(yǔ)言Pheatmap 軟件對(duì)所有miRNA 和樣品進(jìn)行雙向聚類(lèi)分析；R 語(yǔ)言ggplot2 軟件繪制差異表達(dá)基因火山圖。

1.5.3 差異表達(dá)miRNA 靶基因GO 功能及KEGG通路分析 分別使用topGO 以及KOBAS v2.0 對(duì)差異表達(dá)miRNA 靶基因進(jìn)行GO 以及KEGG 富集分析，分析時(shí)利用GO 項(xiàng)目注釋的差異miRNA 靶基因?qū)γ總€(gè)項(xiàng)目的miRNA 靶基因列表和數(shù)目進(jìn)行計(jì)算，然后通過(guò)計(jì)算P-value（顯著富集的標(biāo)準(zhǔn)為P-value＜0.05），從而確定差異miRNA 靶基因行使的主要生物學(xué)功能以及富集通路。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（RT-qPCR）驗(yàn)證

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)HB 株與La Sota株在感染CEF 后miRNA 表達(dá)量，以U6 作為內(nèi)參基因，隨機(jī)選取5 個(gè)差異表達(dá)miRNAs，根據(jù)其序列結(jié)果設(shè)計(jì)引物如表1 所示，均由上海生工生物工程有限公司合成。數(shù)據(jù)處理采用2-△△Ct法計(jì)算。

表1 RT-qPCR 擴(kuò)增引物Table 1 Primers for RT-qPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 NDV 不同毒株感染CEF 后一步生長(zhǎng)曲線(xiàn)

HB 株為基因Ⅶ型流行毒株，La Sota 株為基因Ⅱ型疫苗毒株，按照MOI=1 感染CEF 細(xì)胞，繪制HB 株與La Sota 株的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)（圖1）。

圖1 NDV 不同株感染CEF 細(xì)胞的一步生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.1 One-step growth curve of CEF cells infected with different NDV strains

結(jié)果顯示，2 株病毒在感染初期隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)，其滴度不斷升高，均于感染后60 h 達(dá)到峰值，其中HB 株增殖滴度在60 h 以?xún)?nèi)均高于La Sota 株，且在24 ～36 h 存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，感染后60 h 病毒滴度開(kāi)始下降，72 h 時(shí)La Sota 株滴度高于HB 株但并無(wú)顯著性差異。由于在病毒感染36 h 時(shí)細(xì)胞產(chǎn)生明顯病變，因此選擇在36 h 收集樣品進(jìn)行測(cè)序。

2.2 小RNA 文庫(kù)測(cè)序統(tǒng)計(jì)

通過(guò)Hiseq Single-End 模式測(cè)序，對(duì)下機(jī)后原始數(shù)據(jù)進(jìn)行接頭去除，根據(jù)序列質(zhì)量進(jìn)行剪切，過(guò)濾序列用于后續(xù)分析，HB 感染組最終獲得純凈序列占原始數(shù)據(jù)的51.33%；La Sota 感染組純凈序列占原始數(shù)據(jù)的49.91%（表2）。

表2 測(cè)序質(zhì)量數(shù)據(jù)分析Table 2 Quality of sequencing data

2.3 sRNA 長(zhǎng)度分布和分類(lèi)注釋

過(guò)濾掉長(zhǎng)度＜18 nt 以及＞40 nt 的sRNA，發(fā)現(xiàn)2 組sRNA 長(zhǎng)度均集中在20 ～23 nt 之間（圖2）。其中，長(zhǎng)度22 nt 的序列占比最高，HB 感染組為18.71%、La Sota 感染組為25.79%。將sRNA 對(duì)比雞源參考基因后，對(duì)sRNA 進(jìn)行分類(lèi)注釋?zhuān)? 個(gè)文庫(kù)中順序均為know miRNA>piRNA>unknow miRN A>intron>repeat>exon>snoRNA>snRNA>tRNA>no vel miRNA，know miRNA 占比最高，HB 感染組占49.4%（圖3A），La Sota 感染組占58.2%（圖3B）。

圖2 序列長(zhǎng)度分布情況Fig.2 Sequence length distribution

圖3 sRNA 分類(lèi)注釋Fig.3 sRNA classification annotation

2.4 sRNA 分類(lèi)注釋

2.4.1 已知miRNA 的鑒定 將長(zhǎng)度為18 ～40 nt sRNA與參考基因組已知miRBase 中雞（G.gallus）miRNA 序列進(jìn)行對(duì)比，其中HB 感染組中共發(fā)現(xiàn)554 條miRNA成熟體以及440 條miRNA 前體；La Sota 感染組中共發(fā)現(xiàn)613 條miRNA 成熟體以及479 條miRNA 前體。通過(guò)統(tǒng)計(jì)2 個(gè)已知miRNA 文庫(kù)發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)度在20 ～24 nt的大部分以首位堿基以U 為主，其次為A（圖4）；2 個(gè)文庫(kù)中2 ～8 位種子序列以G 堿基為主（圖5）。

圖4 miRNA 首位堿基偏好性Fig.4 miRNA first base preference

圖5 miRNA 個(gè)點(diǎn)位堿基偏好性Fig.5 miRNA first base preference

2.4.2 novel miRNA 預(yù)測(cè) 根據(jù)與基因組的對(duì)比結(jié)果，運(yùn)用軟件分析未注釋到任何信息的序列，進(jìn)行novel miRNA 序列分析，預(yù)測(cè)結(jié)果表明HB 感染組中共發(fā)現(xiàn)45 條novel miRNA；La Sota 感染組中共發(fā)現(xiàn)56 條novel miRNA，其中表達(dá)量前5 的novel miRNA 如表3 所示，同時(shí)通過(guò)軟件預(yù)測(cè)表達(dá)量前5的novel miRNA 前體二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)具有典型的發(fā)卡結(jié)構(gòu)（圖6）。

表3 表達(dá)量前5 的novel miRNA 序列Table 3 The top 5 novel miRNA sequences in expression

圖6 novo miRNA 前體二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction of the secondary structure of novo miRNA precursors

2.5 差異表達(dá)miRNA 分析

2.5.1 聚類(lèi)分析 將La Sota 株與HB 株感染CEF 36 h 后的miRNA 表達(dá)情況進(jìn)行聚類(lèi)分析（圖7），橫坐標(biāo)表示基因，每一列為1 個(gè)樣本，紅色表示高表達(dá)基因，藍(lán)色表示低表達(dá)基因，顏色從紅到藍(lán)，表示 log10(FPKM+1)從大到小，可以看出NDV 在感染CEF 36 h 后，存在較多的miRNA 差異表達(dá)。

圖7 聚類(lèi)分析Fig.7 Cluster analysis

2.5.2 差異表達(dá)miRNA 分析 將La Sota 感染組與HB 感染組miRNA 表達(dá)水平進(jìn)行比較（圖8），其中橫坐標(biāo)表示log2FoldChange 值，縱坐標(biāo)表示-log10（P-value）值，紅色表示上調(diào)基因，藍(lán)色表示下調(diào)基因。按照表達(dá)量倍數(shù)差異（|log2FoldChange|>1）和表達(dá)差異顯著性（P-value ＜0.05）從La Sota與HB 表達(dá)差異的miRNA，篩選出差異的保守miRNA。共統(tǒng)計(jì)到10 個(gè)差異表達(dá)的miRNA，包括7 個(gè)表達(dá)上調(diào)，以及3 個(gè)表達(dá)下調(diào)（見(jiàn)表4）。

圖8 La Sota 株與HB 株感染CEF 細(xì)胞的差異表達(dá)基因火山圖Fig.8 Volcano plot of differentially expressed genes in CEF cells infected with La Sota and HB strains

表4 差異表達(dá)miRNA 統(tǒng)計(jì)Table 4 Statistics of differentially expressed miRNA

2.5.3 GO 功能注釋和KEGG 信號(hào)通路富集分析為了解NDV 不同毒株感染CEF 后參與的體內(nèi)生物學(xué)過(guò)程，對(duì)差異表達(dá)的miRNA 靶基因進(jìn)行GO 功能注釋?zhuān)暨xP-value 最小即富集

將最顯著的前20 個(gè)GO term 條目進(jìn)行展示（表5），發(fā)現(xiàn)細(xì)胞成分CC 主要富集在：細(xì)胞器、細(xì)胞器膜以及囊泡上；生物過(guò)程BP 主要富集在：細(xì)胞以及蛋白定位和細(xì)胞成分的調(diào)節(jié)；分子功能MF 主要富集在核苷酸結(jié)合與GTP 結(jié)合上。KEGG 富集結(jié)果是通過(guò) Rich factor、FDR 值和富集到此 pathway 上的miRNA 靶基因個(gè)數(shù)來(lái)衡量富集的程度，挑選富集最顯著的前20 個(gè)KEGG 通路（表6），發(fā)現(xiàn)主要集中在細(xì)胞代謝、生物合成以及應(yīng)激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路上。

表5 差異表達(dá)miRNA 靶基因G0 功能富集分析Table 5 GO Functional enrichment analysis of differentially expressed miRNA target genes

表6 差異表達(dá)miRNA 靶基因KEGG 富集分析Table 6 KEGG enrichment analysis of differentially expressed miRNA target genes

2.6 RT-qPCR 驗(yàn)證

隨機(jī)選取5 個(gè)miRNA，分別為：gga-miR-204、gga-miR-155、gga-miR-3536、gga-miR-223、ggamiR-1680-5p，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法對(duì)隨機(jī)選取的miRNA 的表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證（圖9），可以看出RT-qPCR 結(jié)果與測(cè)序RNA-seq 結(jié)果趨勢(shì)一致，證明了測(cè)序結(jié)果的可靠性。

圖9 RT-qPCR 驗(yàn)證Fig.9 RT-qPCR verification

3 討論與結(jié)論

隨著對(duì)miRNA 調(diào)控功能的不斷研究，越來(lái)越多的miRNA 被證明參與調(diào)控宿主與病原體之間的相互作用，有研究證明miRNA 可以通過(guò)靶向M 以及L 蛋白，對(duì)NDV 的復(fù)制造成抑制；miRNA 也參與調(diào)控NDV 在Hela 細(xì)胞中的復(fù)制［11-14］。

在 HB 感染組共發(fā)現(xiàn)554 條miRNA 成熟體、440 條miRNA 前 體 以 及45 條novel miRNA；La Sota 感染組共發(fā)現(xiàn)613 條miRNA 成熟體、479 條miRNA 前體以及56 條novel miRNA，豐富了雞源miRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)對(duì)miRNA 堿基偏好性分析表明，20 ～24 nt 首位堿基主要以U 為主，研究表明當(dāng)首位堿基為U 時(shí)有利于對(duì)miRNA 前體進(jìn)行識(shí)別與切割［15］；成熟miRNA2 ～8 位點(diǎn)為種子序列可以靶向miRNA 的3’端進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)并對(duì)其發(fā)揮降解作用［16］，測(cè)序結(jié)果表明2 個(gè)文庫(kù)中2 ～8 位堿基均以G 為主。

通過(guò)GO 和KEGG 途徑分析顯示，不同NDV毒株感染在宿主的生物合成以及代謝途徑上具有明顯富集，因?yàn)椴《靖腥具^(guò)程中通常會(huì)掠奪宿主細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)從而改變宿主細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)［17］。Zhou 等［18］推測(cè)gga-miR-3538 可能通過(guò)參與病毒-載體相互作用、氧化磷酸化以及細(xì)胞生長(zhǎng)來(lái)發(fā)揮作用。Lim等［19］研究表明gga-miR-1764 可以參與葡萄糖、電解質(zhì)和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸過(guò)程；La Sota 感染組與HB 感染組在C 型凝集素受體信號(hào)通路（CLRs）上具有明顯的富集，如C 型凝集素受體CD69 就可以通過(guò)調(diào)節(jié)miR-155 及其靶蛋白來(lái)調(diào)控T 細(xì)胞的發(fā)育與激活；MAPKs 通路主要通過(guò)Raf/MEK/ERK 信號(hào)刺激基因產(chǎn)生特異性變化，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化與增殖［20］，也有研究證明了gga-miR-142-3p 通過(guò)靶向TAB2 負(fù)調(diào)控NF-κB 和MAPKs 信號(hào)通路減輕炎癥，通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖抑制細(xì)胞凋亡從而抵御雞支原體的感染。根據(jù)以上研究對(duì)差異表達(dá)miRNA功能進(jìn)行推測(cè)：gga-miR-3538 與gga-miR-1764-3p 可能在NDV 感染過(guò)程中通過(guò)調(diào)控宿主的生物合成、代謝以及營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸過(guò)程中途徑發(fā)揮作用；ggamiR-155 在感染NDV 不同毒株后，均有不同程度的上調(diào)，證明gga-miR-155 可能通過(guò)CLRs 參與適應(yīng)性免疫的激活；La Sota 感染組gga-miR-142-3p 表達(dá)量上調(diào)，推測(cè)弱毒La Sota 株可能通過(guò)上調(diào)ggamiR-142-3p 減輕感染后的炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡，這也與NDV 弱毒株在感染后造成的炎癥反應(yīng)以及臨床癥狀較輕相符合。

miRNA 可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡進(jìn)而影響病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。如Li 等［21］表明gga-miR-233 通過(guò)靶向FOCO3抑制雞支原體在DF-1 細(xì)胞中的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；Wang 等［22］證實(shí)了miR-365 通過(guò)抑制IGF1 的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡； Xu 等［23］通過(guò)試驗(yàn)證明miR-187-5p 通過(guò)抑制蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。在本研究中，測(cè)序結(jié)果表明gga-miR-233表達(dá)量上調(diào)，gga-miR-365-1-5p、gga-miR187-5p 表達(dá)下調(diào)。此前研究結(jié)果表明NDV V 蛋白可以抑制細(xì)胞凋亡，并且V 蛋白抑制細(xì)胞凋亡的能力與毒力有關(guān)［24］。表明篩選出的差異表達(dá)miRNA 在NDV 感染中可能通過(guò)與靶基因相互結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，并且強(qiáng)弱毒之間的凋亡水平并不相同。

綜上所述，本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，系統(tǒng)對(duì)比分析La Sota 株與HB 株感染CEF36 h 后miRNA 的表達(dá)情況，共篩選出10 個(gè)差異表達(dá)的miRNA，通過(guò)與先前報(bào)道的研究相比較推測(cè)這些差異表達(dá)miRNA 可能在調(diào)控代謝以及細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用，為進(jìn)一步揭示NDV 感染CEF 以及不同毒株在感染過(guò)程中miRNA 發(fā)揮的調(diào)控作用提供了研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)。