高溫脅迫下匍匐翦股穎酵母cDNA 文庫的構建與鑒定

劉 暢，董康挺，張雅晰，李靜思，邊秀舉，李會彬，王麗宏，孫鑫博

（河北農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院/河北省作物生長調控重點實驗室，河北 保定 071000)

匍匐翦股穎(Agrostis stolonifera)屬禾本科植物，一種冷季型草坪草。由于其修剪品質高、再生能力強、抗逆性較好，是北方地區(qū)常用的優(yōu)質草種［1］，尤其用于建植高質量的精細草坪，如高爾夫球場的果嶺和運動場草坪。然而，匍匐翦股穎耐熱性較差，在其使用過程中，常常會因為受到高溫脅迫而對其生長發(fā)育和草坪質量造成嚴重影響［2］。因此，提高匍匐翦股穎的耐熱性是目前亟待解決的問題。挖掘高溫響應基因，了解匍匐翦股穎高溫響應途徑和機理是解決該問題的重要途徑。當前，已有部分研究揭示了匍匐翦股穎與高溫相關基因的功能［3］，為培育新的抗高溫草坪提供了一定的借鑒。然而，植物響應高溫脅迫的途徑非常復雜，因此，系統(tǒng)地挖掘與高溫相關的基因，揭示其整個信號轉導的過程是提高匍匐翦股穎抗高溫能力的關鍵所在。

酵母cDNA 文庫是挖掘植物相關功能基因的常用方式，而酵母雜交系統(tǒng)則能夠利用酵母細胞內DNA 結合結構域（binding domain，BD）和轉錄激活域（AD）的融合表達功能篩選出目的基因互作蛋白［4］。目前，關于酵母cDNA 文庫在各種作物中的研究已逐漸深入［5-9］。隨著cDNA 文庫的廣泛應用，越來越多的未知基因被發(fā)現(xiàn)，其功能也被深入的研究［10-12］。但是，關于匍匐翦股穎的cDNA 文庫構建信息還未見報道。因此，構建質量好、容量高的匍匐翦股穎cDNA 文庫對后續(xù)匍匐翦股穎分子機理的研究具有重要意義。通過建立酵母cDNA 文庫，能夠得到植物基因組的完整信息及克隆片段［13-14］，從而進一步挖掘匍匐翦股穎在高溫脅迫下有顯著變化的基因，對其進行研究，闡明其功能。此外，通過酵母雙雜交技術可以對已知抗熱基因的互作蛋白進行篩選與檢驗，再使用該技術對篩選出的互作蛋白進行一對一驗證，揭示抗熱基因與其它基因的相互作用，從而闡明匍匐翦股穎抗熱信號途徑，驗證抗熱基因功能［15-16］。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 將匍匐翦股穎種子均勻的撒播于育苗缽中，待其發(fā)芽后移植到直徑20 cm 的花盆中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)土體積比為泥炭∶蛭石=1∶2，在光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，條件為光23 ℃/16 h，暗23 ℃/ 8 h。

1.1.2 試劑選擇 選用載體pDONR222/pGADT7-DEST 為建庫載體，所用到的與構建cDNA 文庫相關的試劑主要來源于美國英杰生命技術有限公司（Invitrogen）；轉化大腸桿菌的材料來源于TaKaRa（大連寶生物）公司；培養(yǎng)基等在Sigma 公司購買。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗處理 將培養(yǎng)8 周的匍匐翦股穎植株置于培養(yǎng)箱中進行高溫處理，處理條件為光37 ℃/16 h、暗37 ℃/8 h，分別在處理的第0、2、8 和24 h 取葉片，并進行混合，用于后續(xù)總RNA 的提取。

1.2.2 Trizol 法提取匍匐翦股穎總RNA 取上述匍匐翦股穎葉片混樣材料0.1 g，液氮研碎，用Trizol法提取匍匐翦股穎的總RNA，Oligotex mRNA Midi Kit 試劑盒進行總RNA 的分離純化，再用1%瓊脂糖凝膠電泳對Total RNA 進行質量檢測。

1.2.3 初級cDNA 文庫的構建 用上述所提取的RNA 作為模板DNA 進行完整cDNA 雙鏈的合成（參照Clone Miner 說明書進行）。在得到cDNA 雙鏈后，用已經(jīng)合成的完整cDNA 連接于3 種attB1 重組接頭。待連接完成后，進行cDNA 的分級分離，收集產(chǎn)物。對收集到的產(chǎn)物進行BP 重組反應，轉入大腸桿菌DH10B 進行電擊轉化。完成后加入SOC 培養(yǎng)基，置于37 ℃，轉速為225 ～250 r/min，搖床培養(yǎng)1 小時。培養(yǎng)結束后取培養(yǎng)物10 μL 稀釋1 000倍，均勻在LB 培養(yǎng)基上涂50 μL，第2 天計數(shù)，用于后續(xù)的結果分析，剩余培養(yǎng)物加入甘油至終濃度20%于-80 ℃存好。

1.2.4 構建酵母cDNA 文庫 從上述建立的cDNA初級文庫中抽取質粒，按照300 ng/μL 的濃度進行稀釋。將稀釋好的質粒用LR 重組反應法連接到pGADT7-DEST 載體上，將連接好的質粒和載體轉入大腸桿菌DH10B 感受態(tài)細胞進行培養(yǎng)。取培養(yǎng)物10 μL 稀釋1 000 倍，均勻在LB 培養(yǎng)基上涂50 μL，第2 天計數(shù)，用于后續(xù)的結果分析，剩余培養(yǎng)物加入甘油至終濃度20%于-80 ℃存好。

1.2.5 制備Y187 酵母感受態(tài)細胞 取Y187 酵母感受態(tài)細胞在YPDA 培養(yǎng)基上劃線，30 ℃倒置培養(yǎng)3 ～5 d。挑取生長出來的單菌落于液體YDPA 培養(yǎng)基中震蕩，待OD600值到0.5 左右時，離心后傾析上清液，使用ddH2O 將其重懸，再次離心后使用TE/LiAc 溶液將其混合得到Y187 酵母感受態(tài)細胞。

1.2.6 cDNA 文庫質粒轉化 在無菌預冷的15 mL離心管中加入試劑Reaction Component、Herring Testes Carrier DNA、denatured 和次級文庫質粒，取50 μL Herring DNA，100 ℃/5 min 冰浴冷卻后再重復進行1 次。加入感受態(tài)細胞，渦旋振蕩混合完全后加入PEG/LiAc 溶液，混合后溫育，每隔15 min混合1 次。加入二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）混合完成后，離心去上清，用30 mL NaCl溶液懸浮細胞。將得到的溶液取10 μL 分別稀釋10、100、1 000、10 000 倍涂于SD/-Leu 培養(yǎng)基，30 ℃倒置培養(yǎng)3 ～5 d。收集轉化子，挑取克隆菌落，進行PCR 鑒定。

2 結果與分析

2.1 匍匐翦股穎Total RNA 檢測結果

匍匐翦股穎Total RNA 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示(圖1)能夠擴增出明亮的條帶，且條帶的長度大于500 bp，說明Total RNA 質量良好，可作為建庫的起始樣品。

圖1 mRNA 分離結果Fig.1 mRNA separation results

2.2 cDNA 第2 鏈合成結果

使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測對合成的雙鏈cDNA 進行檢測，結果(圖2)顯示條帶呈彌散狀，大小范圍在250 ～2 000 bp。表明此cDNA 雙鏈合成質量過關，可使用其進行酵母cDNA 文庫的構建。

圖2 cDNA 第二鏈合成結果Fig.2 Results of synthesis of cDNA second strand

2.3 初級文庫構建結果鑒定

對初級文庫菌液進行稀釋、涂布，第2 天觀察計數(shù)。用“CFU/mL= 平板上的克隆數(shù)/50 μL×100×1 000 μL=1 700/50 μL×l00×1 000 μL=3.4×106”的方法計算出庫容量的總克隆數(shù)CFU=3.4×106×4 =1.36×107個（圖3A）。從中隨機選取了24 個克隆進行菌落PCR 鑒定，經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳的檢測發(fā)現(xiàn)：初級文庫的重組率為100%，插入的克隆片段長度均大于1 000 bp，符合初級文庫的建庫要求（圖3B）。

圖3 初級文庫庫容量鑒定及 cDNA 插入片段重組鑒定結果Fig.3 Identification of primary library capacity and recombination of cDNA insertion fragment

2.4 次級文庫構建結果鑒定

將初級文庫的菌液取出10 μL，稀釋后進行涂布并觀察計算克隆數(shù)量（圖4A），通過觀察計算出總克隆數(shù)CFU =3.0×106×4=1.2×107個。從中隨機選取24 個菌落進行PCR 鑒定，結果顯示：該文庫的重組率為100%，平均插入片段長度＞1 000 bp（圖4B）。經(jīng)過計算，符合酵母雜交cDNA 文庫的要求，可用于后續(xù)的匍匐翦股穎酵母雜交相關試驗。

圖4 次級文庫的構建及鑒定結果Fig. 4 Construction and identification of secondary libraries

2.5 cDNA 文庫質粒轉化Y187 酵母菌株結果

將轉化好的菌液涂布在SD/-Leu 培養(yǎng)基上，對其進行觀察。發(fā)現(xiàn)克隆數(shù)目為400 個，工作液的細胞密度>3×107cells/mL，文庫滴度(cells/mL) 為4.0×107cells/mL（圖5A）。從中選取24 個單菌落進行菌落PCR 鑒定（圖5B），擴增出了23 個單菌落條帶，由此計算出插入片段平均＞1 000 bp,文庫重組率為96%。

圖5 cDNA 文庫轉化 Y187 酵母感受態(tài)細胞鑒定結果Fig. 5 Identification of cDNA library transformed into yeast competent cells Y187

3 結論與討論

在對建立的cDNA 文庫進行評價時，主要從2個方面對其進行評價：所建立的cDNA 文庫是否有代表性和提取的mRNA 是否完整［17-18］。其中，庫容量中包含的獨立重組克隆數(shù)的多少是決定文庫是否有代表性的重要因素。普遍來說，cDNA 文庫所包含的克隆數(shù)應在1×106CFU 之上才能夠說明文庫滿足后續(xù)的使用要求［19］。通過本試驗所建立的cDNA文庫，經(jīng)過測定得到克隆數(shù)為1.36×107CFU，大于最低克隆數(shù)，插入片段平均大于1 000 bp，重組率為100%。說明該cDNA 文庫滿足mRNA 的篩選要求，可用于后續(xù)酵母試驗的研究。

通過構建不同作物的cDNA 文庫，能夠為相關作物研究未知基因及其功能提供基礎。通過建立匍匐翦股穎酵母cDNA 文庫，能夠從中進行挖掘并篩選一批與高溫相關的基因［20］。此外，利用酵母cDNA文庫還能夠有效的篩選目的基因的互作蛋白，通過對蛋白質互作關系的進一步研究，驗證與高溫相關基因行使何種功能［21］。

采用SMART 技術構建酵母cDNA 文庫是得到目的基因較為高效、迅速的方法［22］。本研究詳細說明了匍匐翦股穎cDNA 文庫的建立方法，通過SMART 技術，建立了可用于酵母雜交試驗的高質量匍匐翦股穎酵母cDNA 文庫，并將文庫質粒成功轉入Y187 酵母感受態(tài)細胞。為尋找匍匐翦股穎響應高溫的基因和后續(xù)研究互作蛋白的酵母雙雜交試驗奠定了基礎，也為解釋匍匐翦股穎抗高溫信號通路提供了重要信息。