蜜環(huán)菌與天麻的共生關(guān)系研究進(jìn)展

趙麒鳴，吳 鵬，劉鴻高，桂明英，

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650201；2.云南省高原特色產(chǎn)業(yè)研究院，云南 昆明 650521)

蜜環(huán)菌（Armillaria mellea（Vahl）P.Kumm.）隸屬于真菌界（Fungi），擔(dān)子菌門（Basidiomycota），擔(dān)子菌綱（Basidiomycetae），傘菌 目（Hymenomycetes），屬 白 蘑（口蘑）科（Tricholoma-taceae），蜜環(huán)菌屬（Armilaria）。因菌蓋表面呈蜜黃色，菌柄上部有環(huán)，所以命名為“蜜環(huán)菌”。野生蜜環(huán)菌夏秋季多叢生或群生于針闊葉林潮濕的枯木上；人工栽培蜜環(huán)菌是利用段木、木屑、農(nóng)作物秸桿等原料培育而得。

天麻（Gastrodiaelata）是傳統(tǒng)名貴藥材，隸屬樹蘭亞科（Epidendroidae）、天麻屬（Gastrodia），無(wú)根，無(wú)葉，是多年生異養(yǎng)草本植物，廣泛用于中成藥方劑的配制及各種疾病的防治，有著極高的藥用價(jià)值[1]。

1 蜜環(huán)菌與天麻關(guān)系概述

天麻自身無(wú)光合作用，需從入侵的蜜環(huán)菌中獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而生長(zhǎng)發(fā)育[1]。其種子的萌發(fā)，需從紫箕小菇（Mycenaosmuudicola Lange）、蘭小菇（Mycenaorchidicola）等共生萌發(fā)菌中吸收營(yíng)養(yǎng)。蜜環(huán)菌即榛蘑，為常見食藥用菌，多生長(zhǎng)在榛材崗上。受真菌間的共生關(guān)系影響，蜜環(huán)菌菌材常用于天麻栽培中促進(jìn)子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育[2]。

蜜環(huán)菌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，其形態(tài)結(jié)構(gòu)可分為子實(shí)體和菌絲體兩個(gè)階段。然而，菌索是菌絲在不良的環(huán)境條件下或生長(zhǎng)后期發(fā)生的適應(yīng)性變態(tài)，即菌絲體交織肉結(jié)組成繩索狀的組織。多年研究得出結(jié)論，蜜環(huán)菌是以菌索的形態(tài)侵染天麻，天麻從而同化蜜環(huán)菌獲得營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行生長(zhǎng)[3]。在自然界中，蜜環(huán)菌與天麻是一種極為特殊的共生關(guān)系。

2 蜜環(huán)菌與天麻共生關(guān)系分析

2.1 共生機(jī)理

天麻（Gastrodiaelata）具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，與蜜環(huán)菌為共生關(guān)系。蜜環(huán)菌是天麻的營(yíng)養(yǎng)源，蜜環(huán)菌離開天麻可獨(dú)立生長(zhǎng)，而天麻離開蜜環(huán)菌不能生長(zhǎng)。蜜環(huán)菌以樹木纖維為其提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)，天麻又靠消化侵染自身的蜜環(huán)菌而獲得營(yíng)養(yǎng)，當(dāng)蜜環(huán)菌營(yíng)養(yǎng)來(lái)源不足，天麻生長(zhǎng)減弱時(shí)，蜜環(huán)菌又可以利用天麻體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)供其生長(zhǎng)。當(dāng)管理不善天麻抵抗力降低或受損傷時(shí)及長(zhǎng)出新生麻的母體逐漸衰老便會(huì)失去消化蜜環(huán)菌菌絲的能力。大量菌絲穿過(guò)消化層細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)部組織，把天麻作為自己營(yíng)養(yǎng)，直到把麻體"吃空"為止。天麻有專門消化蜜環(huán)菌本領(lǐng)，原因是其皮層組織內(nèi)有層具有消化作用細(xì)胞。當(dāng)蜜環(huán)菌幼嫩菌索侵入天麻表皮延伸至消化層細(xì)胞后，消化層細(xì)胞便分泌出酶溶菌酵素，將侵入的菌絲溶解而作為自己的營(yíng)養(yǎng)消化掉。菌絲不斷的沿消化細(xì)胞層成束的向四周擴(kuò)散，天麻不斷得到營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)。故蜜環(huán)菌生長(zhǎng)得越旺盛，侵入天麻塊莖越多，天麻營(yíng)養(yǎng)越多，生長(zhǎng)發(fā)育越快[4]。天麻對(duì)蜜環(huán)菌的選擇共生機(jī)制研究中，從天麻生長(zhǎng)繁衍的角度看，天麻生物種對(duì)相應(yīng)蜜環(huán)菌的誘導(dǎo)性強(qiáng)大，蜜環(huán)菌的入侵性較弱，則天麻正常生長(zhǎng)；相反，如果誘導(dǎo)性較弱，入侵性較強(qiáng)，則天麻被吞噬，因此只有具備強(qiáng)大的誘導(dǎo)系統(tǒng)的天麻種與入侵較弱的蜜環(huán)菌種結(jié)合，才能使天麻通過(guò)相應(yīng)的策略獲得營(yíng)養(yǎng)以維持自身的生長(zhǎng)繁衍。在蜜環(huán)菌侵入天麻皮層后，天麻植物體內(nèi)多酚氧化酶PPO、苯丙氨酸解氨酶PAL，以及基于蜜環(huán)菌種的3 個(gè)DNA 核糖體區(qū)域基因（IGS-1，ITS，EF-1a）的表達(dá)性突出[5]。

2.2 影響天麻產(chǎn)量因素

根據(jù)蜜環(huán)菌與天麻共生機(jī)理及蜜環(huán)菌菌種生長(zhǎng)機(jī)制，由此展示主要影響天麻產(chǎn)量因素的研究如下：王秋穎[6]、陳明義等[7]對(duì)不同蜜環(huán)菌菌株對(duì)天麻產(chǎn)量的影響進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)菌株表現(xiàn)出生長(zhǎng)速度快、菌索分枝多、菌索粗壯、菌索內(nèi)菌絲色白，其伴播天麻產(chǎn)量高、品質(zhì)好。季寧等[8]在栽培方式的試驗(yàn)中得出結(jié)論，同一蜜環(huán)菌菌株在仿野生栽培試驗(yàn)和室外箱栽試驗(yàn)中，與對(duì)照伴栽天麻效果不一致。王永等[9]通過(guò)采用不同蜜環(huán)菌菌株培養(yǎng)菌材，并與紅天麻伴栽，觀察記錄不同蜜環(huán)菌栽培種對(duì)青岡菌材的侵染情況以及不同處理紅天麻的農(nóng)藝性狀，檢測(cè)天麻的有效成分含量，發(fā)現(xiàn)菌株MHJ-1 與紅天麻的伴栽效果最好，不同蜜環(huán)菌栽培種對(duì)青岡菌材的侵染情況不同，對(duì)紅天麻農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量及質(zhì)量的影響也不同；其伴栽的天麻醇溶性浸出物含量、天麻素含量、天麻素與對(duì)羥基苯甲醇總含量均最高，且極顯著高于對(duì)照菌株，并確定仿野生栽培試驗(yàn)表現(xiàn)出良好的伴栽效果。

孫士青等[10]研究得出，蜜環(huán)菌-天麻組合對(duì)在天麻生物產(chǎn)量及天麻素含量上有顯著性差異。為保證烏天麻栽培品質(zhì)提高烏天麻產(chǎn)量，劉天睿等[11]篩選適合彝良小草壩烏天麻伴栽的蜜環(huán)菌菌株，選擇4 株（M1、M2、M3、M4）不同蜜環(huán)菌菌株，采用“三下窩”的方式栽培烏天麻。測(cè)定烏天麻產(chǎn)量并對(duì)烏天麻進(jìn)行天麻素、對(duì)羥基苯甲醇、天麻多糖的含量測(cè)定，通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，4 株蜜環(huán)菌菌株為高盧蜜環(huán)菌族（Armillaria gallica），但伴栽的烏天麻產(chǎn)量和有效成分含量存在差異。以烏天麻產(chǎn)量、天麻素、天麻素和對(duì)羥基苯甲醇的總含量及多糖含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，M1 在4 個(gè)菌株與烏天麻伴栽試驗(yàn)中箭麻產(chǎn)量最高（0.981 kg·m-2），天麻素質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)0.581%，天麻素和對(duì)羥基苯甲醇總量為0.595%，表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)性，即不同菌株伴栽烏天麻，其品質(zhì)不同。發(fā)現(xiàn)最適宜彝良烏天麻伴栽的蜜環(huán)菌菌株為M1 菌株。

培育方法上，在阜新市彰武縣樟子松林下，對(duì)長(zhǎng)白山野生烏桿天麻進(jìn)行了蜜環(huán)菌菌種培養(yǎng)和麻種大小對(duì)比試驗(yàn)；通過(guò)連續(xù)3 a 跟蹤測(cè)定天麻的單株產(chǎn)麻個(gè)數(shù)、單株產(chǎn)麻重量、單位面積產(chǎn)麻重量、天麻外觀形態(tài)等因子，最終篩選出適合阜新地區(qū)林下栽培適用的菌棒培養(yǎng)方法為穴培法，選擇外觀優(yōu)良，且個(gè)頭大的天麻作為麻種進(jìn)行栽培有利高產(chǎn)[12]。

根據(jù)上述研究文獻(xiàn)表明，不同蜜環(huán)菌菌株對(duì)天麻的產(chǎn)量有較大影響，蜜環(huán)菌的菌索粗壯發(fā)達(dá)程度、生長(zhǎng)情況、生長(zhǎng)速度決定天麻產(chǎn)量高低。栽培天麻的產(chǎn)量與質(zhì)量不僅取決于麻種、菌種質(zhì)量，而且與菌麻之間的組合有關(guān)。另外，蜜環(huán)菌的栽培方法也會(huì)對(duì)天麻生長(zhǎng)及產(chǎn)量存在一定影響。

2.3 蜜環(huán)菌胞外酶的影響

天麻種植中，蜜環(huán)菌的生長(zhǎng)與胞外酶活性密切相關(guān)，在生長(zhǎng)期間，不斷向胞外分泌漆酶、纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、淀粉酶等。這些胞外酶的分泌為蜜環(huán)菌侵染蘭科植物天麻的表皮提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。研究表明，胞外酶對(duì)木腐菌降解營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力起著決定性作用[13]，其種類及活性大小與真菌的種類有關(guān)[14]。

在對(duì)蜜環(huán)菌胞外酶的研究中，王賀等[15]發(fā)現(xiàn)釋放水解酶消化真菌的主要場(chǎng)所是天麻皮層消化細(xì)胞。薛梅等[16]通過(guò)液體培養(yǎng)時(shí)胞外酶活性研究發(fā)現(xiàn)，多個(gè)蜜環(huán)菌菌株在整個(gè)發(fā)酵培養(yǎng)周期中淀粉酶、濾紙纖維素酶、愈創(chuàng)木酚酶活性的變化趨勢(shì)基本一致，表現(xiàn)為首先利用淀粉作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，繼而開始利用基質(zhì)中的纖維素；鄒寧等[17]利用蜜環(huán)菌胞內(nèi)外提取物進(jìn)行天麻組織培養(yǎng)試驗(yàn)，胞內(nèi)提取液對(duì)天麻生長(zhǎng)有相應(yīng)的抑制效果，而胞外提取液卻有促進(jìn)效果。曾春函等[18]對(duì)8 種蜜環(huán)菌的胞外酶（漆酶、果膠酶、木聚糖酶和纖維素酶）活性對(duì)溫度的響應(yīng)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，木聚糖酶是蜜環(huán)菌主要作用的胞外酶，其活力遠(yuǎn)高于纖維素酶、漆酶和果膠酶。并且得出蜜環(huán)菌首先分泌的胞外酶是果膠酶和纖維素酶，然后才是漆酶。且蜜環(huán)菌多糖的累積與其分泌的胞外酶漆酶、木聚糖酶活力呈現(xiàn)顯著相關(guān)性。劉曉杰等[19]對(duì)黃綠蜜環(huán)菌胞外葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶酶活性進(jìn)行研究，結(jié)果表明30 ℃下酶活穩(wěn)定性最高，pH 值在6~7 內(nèi)酶活穩(wěn)定性最好。劉曉敏等[20]通過(guò)鑒定4 株菌株，由云南基地分離的M1、M2 菌株為高盧蜜環(huán)菌（Armillaria gallica Marxm.&Romagn.），由吉林基地分離的F2、F3 菌株為頭柄蜜環(huán)菌（Armillaria cepistipes Velen.）。結(jié)合前期的天麻產(chǎn)量結(jié)果，初步確認(rèn)高盧蜜環(huán)菌M1、M2 菌株為伴栽天麻的優(yōu)良菌株；對(duì)不同蜜環(huán)菌菌株胞外酶活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，不同菌株之間的胞外酶活性不同，存在種間差異。胞外酶活性的變化規(guī)律為：隨著時(shí)間的推移，胞外酶活性和多糖含量均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，并且胞外酶活性的種間差異更為明顯，高盧蜜環(huán)菌菌株的胞外酶活性更強(qiáng)，多糖含量更高。根據(jù)相關(guān)性分析可知，蜜環(huán)菌生長(zhǎng)的快慢與胞外酶的活性顯著相關(guān)。

根據(jù)多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，不同的胞外酶在蜜環(huán)菌生長(zhǎng)過(guò)程中具有不同的作用。漆酶具有降解木質(zhì)素、酚類物質(zhì)的作用，其活性影響蜜環(huán)菌對(duì)木質(zhì)素的降解能力；纖維素酶水解纖維素產(chǎn)生葡萄糖，可為菌株自身生長(zhǎng)提供碳源；木聚糖酶能夠分解位于植物次生壁的多糖結(jié)構(gòu)木聚糖[21]；淀粉酶主要水解植物多糖淀粉提供營(yíng)養(yǎng)；果膠酶能夠降解植物細(xì)胞間質(zhì)和初生細(xì)胞壁中的果膠質(zhì)[22]。

如今，提高蜜環(huán)菌胞外酶活性是一項(xiàng)有利天麻種植的可行方法。采用松針?lè)鄣冉?jīng)改性纖維素酶酶解后配合食用菌菌渣、南瓜蛋白、膨化米糠殼等經(jīng)發(fā)酵制備蜜環(huán)菌培養(yǎng)基，合理的搭配，豐富的營(yíng)養(yǎng)，可以提高蜜環(huán)菌胞外酶活性，進(jìn)而提高胞外酶栽培效率，采用的改性纖維素酶，在培養(yǎng)基中存在時(shí)間長(zhǎng)，可以持續(xù)協(xié)同分解纖維素，給蜜環(huán)菌提供營(yíng)養(yǎng)；采用生物活性磷酸鈣多孔微球吸附加載的發(fā)酵菌進(jìn)行發(fā)酵，有效地提高了酵母菌的活性，促進(jìn)了培養(yǎng)基原料的分解，便于養(yǎng)分的吸收和利用；測(cè)定1 L 發(fā)酵液最高酶活力為48744.0～51202.0 U（在pH 3.0，以ABTS 為底物含有50 mmol·L-1的酒石酸鈉緩沖液中），發(fā)酵條件為葡萄糖添加2.5%，碳氮比為3（以蛋白胨氮源計(jì)），微量元素添加量為15 mL，起始發(fā)酵pH 為5.0，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，確定此工藝可作為蜜環(huán)菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶生產(chǎn)的參考依據(jù)[23]。

蜜環(huán)菌胞外酶不僅能為蜜環(huán)菌生長(zhǎng)發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)，還為其侵染天麻形成共生機(jī)制提供物質(zhì)條件，因此對(duì)蜜環(huán)菌胞外酶活性的探究對(duì)于蜜環(huán)菌和天麻生長(zhǎng)都具有著重要意義。

3 討論

通過(guò)上述對(duì)天麻蜜環(huán)菌各方面的研究與分析，蜜環(huán)菌的菌種對(duì)天麻生長(zhǎng)的影響存在直接關(guān)系。并且為了保證蜜環(huán)菌可為天麻提供充足營(yíng)養(yǎng)，蜜環(huán)菌菌索需要保持相對(duì)活性，其次生長(zhǎng)過(guò)程中需提供蜜環(huán)菌最適合的碳源、氮源及優(yōu)質(zhì)菌材。天麻蜜環(huán)菌種植需多應(yīng)用生產(chǎn)新技術(shù)，制備優(yōu)質(zhì)的蜜環(huán)菌母種及原種，選育符合種植地域的蜜環(huán)菌栽培種。

天麻蜜環(huán)菌屬于中成藥、處方藥，沒(méi)有明顯的不良反應(yīng)，相對(duì)于安全性較高。然而，受中藥發(fā)酵環(huán)節(jié)生產(chǎn)制約因素差異影響，有必要從宏觀環(huán)境下進(jìn)行栽培技術(shù)改進(jìn)，以整體提升天麻的生產(chǎn)效率及品質(zhì)。

綜上所述，在天麻種植過(guò)程中，蜜環(huán)菌與天麻的栽培環(huán)節(jié)里，基于蜜環(huán)菌形態(tài)學(xué)、生物學(xué)特征、地域分布、生長(zhǎng)環(huán)境等影響，需要進(jìn)一步探究蜜環(huán)菌種質(zhì)資源的利用與其栽培技術(shù)的提升。根據(jù)蜜環(huán)菌與天麻共生機(jī)理及其胞外酶的相互影響，總結(jié)出一些高效可利用的天麻蜜環(huán)菌栽培技術(shù)及天麻蜜環(huán)菌的釆后處理方法，以此達(dá)到整體提升栽培效果，更好地滿足栽培要求。同時(shí)，重視蜜環(huán)菌菌種的相關(guān)研究可為天麻種植提供絕對(duì)性的指導(dǎo)意見及思路。