豬源Pdm/09 H1N1甲流NA定點(diǎn)突變拯救毒株的生物特性研究

程 倩,孔子榮,,李三木,李 獻(xiàn),Muhammad Junaid,張書祥,何奇松,熊 毅,孫文博,顏健華

Pdm/09 H1N1流感病毒傳入我國后嚴(yán)重危害到了公共衛(wèi)生安全,其極強(qiáng)的跨物種間傳播能力以及與豬群中的類禽型H1N1豬流感病毒重組產(chǎn)生的新型毒株始終對(duì)人類健康具有較大威脅性,因而對(duì)Pdm/09 H1N1流感病毒的研究具有重要意義[1-5]。反向遺傳學(xué)技術(shù)對(duì)流感病毒的研究具有重大意義,流感病毒的反向遺傳學(xué)技術(shù),目前應(yīng)用最廣泛的為Hoffmann等建立的雙向RNA聚合酶Ⅰ/Ⅱ轉(zhuǎn)錄系統(tǒng),即8質(zhì)粒系統(tǒng)[6-10]。反向遺傳學(xué)技術(shù)在流感病毒研究上的廣泛應(yīng)用,對(duì)流感病毒跨種屬傳播機(jī)制、新型疫苗制備和流感病毒基因組的結(jié)構(gòu)和功能探索有著重要意義。在流感病毒基因功能研究中,通過定點(diǎn)突變可以探究位點(diǎn)對(duì)宿主致病力、病毒復(fù)制能力、病毒傳播機(jī)制、耐藥性和病毒傳播機(jī)制的影響。本研究將利用定點(diǎn)突變技術(shù)突變已有反向遺傳學(xué)體系中的NA基因119位點(diǎn)并拯救成功,為后期研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 質(zhì)粒 豬源Pdm/09 H1N1流感病毒株A/swine/Guangxi/12/2011(H1N1)、pBD-PB2、pBDPB1、p BD-PA、p BD-HA、p BD-NP、p BD-NA、p BDM、pBD-NS的8質(zhì)粒反向遺傳學(xué)體系由廣西大學(xué)醫(yī)學(xué)院顏健華博士惠贈(zèng)[11]。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞 SPF雞胚購自北京梅里亞公司。犬腎細(xì)胞MDCK(Madin-Darby Canine Kidney cells)和人胚胎腎細(xì)胞293T由廣西壯族自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心保存;SPF級(jí)BALB/c 6周齡雌性小鼠(約20 g/只),購自北京維通利華公司。

1.1.3 試劑 X-gal溶液(20 mg/m L)、IPTG溶液(50 mg/m L)、氨芐、青霉素、鏈霉素、Hank’s洗液等均購自北京索萊寶公司;Fast Site-Directed Mutagenesis Kit快速定點(diǎn)突變?cè)噭┖?、質(zhì)粒大量提取試劑盒(無內(nèi)毒素)、病毒總RNA抽提試劑盒等購自北京天根公司;組織固定液購自武漢塞維爾公司;神經(jīng)氨酸酶檢測(cè)試劑盒等購自碧云天公司;含LGlutamine的Opti-MEM細(xì) 胞 培 養(yǎng) 液、DMEM、0.25%EDTA胰酶以及胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司;轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司;MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNase酶抑制劑、小量質(zhì)粒抽提純化試劑盒、膠回收試劑盒等購自寶生物公司;1%雞紅細(xì)胞懸液由實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 試驗(yàn)所需的流感病毒神經(jīng)氨酸酶基因定點(diǎn)突變、測(cè)序以及流感病毒鑒定引物利用Primer 5和Oligo 8設(shè)計(jì),Uni12為流感病毒反轉(zhuǎn)錄引物,序列見表1。

1.3 基因定點(diǎn)突變 參考天根公司Fast Site-Directed Mutagenesis Kit快速定點(diǎn)突變?cè)噭┖胁僮鞣椒ɡ肞CR方法直接在pBD-NA質(zhì)粒上進(jìn)行定點(diǎn)突變,PCR體系50.0μL:p BD-NA質(zhì)粒0.2μL,正向、反向突變引物各2μL,5×Fast Alteration Buffer 10μL,1×Fast Alteration DNA Polymerase 1μL,RNase-Free dd H2O補(bǔ)足至50.0μL,反應(yīng)程序:95℃5 min;94℃30 s,55℃1 min,68℃5 min,30個(gè)循環(huán),68℃5 min。按突變?cè)噭┖姓f明書進(jìn)行突變質(zhì)粒模板消化以及轉(zhuǎn)化,然后將所有菌液涂布到含相應(yīng)抗生素的LB固體瓊脂培養(yǎng)基(涂布20μL 0.2 mol/L的IPTG和40μL 40 mg/m L的X-gal)上,將平板置于室溫直至液體被吸收后倒置平板,37℃培養(yǎng)過夜,挑選藍(lán)斑擴(kuò)增后進(jìn)行菌液PCR測(cè)序鑒定,反應(yīng)體系25.0μL:菌液1.0μL,10ⅹbuffer 2.5μL,d NTP(2.5 mmol/L)2.0μL,rTaq酶0.5 μL,上、下 游 引 物 各1.0 μL,RNase-Free dd H2O補(bǔ)足至25.0μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃5 min;94℃45 s,56℃45 s,72℃90 s,30個(gè) 循 環(huán);72℃10 min。最后進(jìn)行1%濃度瓊脂凝膠核酸電泳并回收目的條帶的cDNA測(cè)序。對(duì)測(cè)序正確的陽性菌液加入到50 m L LB培養(yǎng)液(含AMP 50μg/m L)中置搖床中搖菌過夜后提取獲得質(zhì)粒。

1.4 病毒拯救與鑒定 將狀態(tài)良好且可以傳代的293T細(xì)胞和MDCK細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后按細(xì)胞量3∶1的比例(細(xì)胞數(shù)量為105個(gè)/m L)共同鋪板至25 mm直徑的培養(yǎng)皿中,于37℃、5% CO2細(xì) 胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至單層細(xì)胞密度約70%～80%,然后將流感病毒8質(zhì)粒系統(tǒng)改變pBD-NA質(zhì)粒,分別拯救r MT(NA119G)和r WT(NA119E)。流感病毒拯救方法如下:吸取240μL含L-Glutamine的OPTIMEM到2.0 m L離心管,依次加入含1μg流感病毒各基因片段質(zhì)粒,輕輕吹打混勻;吸取240μL OPTI-MEM到另1個(gè)2.0 m L離心管,加入12μL Lipofectamine TM2000,輕柔吹打充分混勻,室溫靜置5 min;將后者緩慢轉(zhuǎn)移至混合質(zhì)粒中,輕柔吹打10余次充分均勻混合,室溫作用30 min形成DNALF 2000混合物;將混合鋪板293T細(xì)胞和MDCK細(xì)胞的培養(yǎng)皿用巴氏吸管吸取Hank’s液洗板3次,去除培養(yǎng)基中血清,再用巴氏吸管從中心位置緩慢滴加480μL/孔的DNA-LF 2000混合物至準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿中,于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 h后吸去上清,更 換 為 含0.5 μg/m L TPCK胰 酶 的OPTIMEM細(xì)胞培養(yǎng)液2 m L,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,每12 h觀察1次細(xì)胞狀態(tài),轉(zhuǎn)染換液并培養(yǎng)48 h后將培養(yǎng)皿上的細(xì)胞吹下,細(xì)胞懸液混勻后將其接種孵育9 d齡SPF雞胚,200μL/枚,繼續(xù)孵育60 h,收取雞胚尿囊液進(jìn)行血凝試驗(yàn)(HA)和PCR鑒定。鑒定為陽性的雞胚尿囊液通過細(xì)胞培養(yǎng)、純化后,再接種SPF雞胚,收獲雞胚尿囊液,分裝、－80℃保存,作為種毒備用。

1.5 PCR鑒定 使用天根公司病毒總RNA提取試劑盒來提取流感病毒的RNA,操作步驟按說明書進(jìn)行,然后使用反轉(zhuǎn)錄引物Uni12合成c DNA,體系混合均勻后,放入PCR儀中42℃反轉(zhuǎn)錄1 h、95℃5 min。反應(yīng)結(jié)束后,取反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后的使用鑒定引物對(duì)樣品c DNA進(jìn)行PCR反應(yīng),使用56℃退火45 s。PCR體系為:2.5μL 10×Trans Taq HiFi Buffer(含Mgcl2),2.0μL d NTP mix,各0.5μL Id-F與Id-R,0.5μL Trans Taq HiFi DNA Polymerase,5.0 μL cDNA Template,14μL dd H2O,擴(kuò)增片段,進(jìn)行電泳,膠回收目的條帶送測(cè)序。

1.6 病毒生長曲線 分別以100個(gè)TCID50(MOI＝0.001)的劑量將拯救株及突變株病毒分別接種于12孔板中狀態(tài)良好且單層的MDCK細(xì)胞,然后在不同的時(shí)間點(diǎn)12 h、24 h、48 h和72 h分別收集細(xì)胞上清,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)重復(fù),觀察CPE,按照Reed&Muench公式計(jì)算TCID50值。

1.7 神經(jīng)氨酸酶活性測(cè)定 取HA滴度最高的獲救病毒細(xì)胞毒6份分裝的種毒進(jìn)行試驗(yàn),操作步驟按碧云天神經(jīng)氨酸酶活性檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行,檢測(cè)體系如表2。

表2 神經(jīng)氨酸酶活性檢測(cè)體系Tab.2 Neuraminidase activity detection system

按說明書所示順序及上表配制體系,37℃孵育30 min后,以450 nm發(fā)射波長進(jìn)行熒光測(cè)定,再根據(jù)監(jiān)測(cè)出來的熒光強(qiáng)度對(duì)比陽性及陰性對(duì)照,計(jì)算樣品中神經(jīng)氨酸酶的相對(duì)活力。正式試驗(yàn)前需進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),以確定最佳孵育時(shí)間。

1.8 神經(jīng)氨酸酶二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 登錄泰德生物網(wǎng)站(http://www.detaibio.com/tools/chou-fasmanforecast.html),輸入NA蛋白質(zhì)推導(dǎo)的氨基酸序列,使用Chou-Fasman算法在線預(yù)測(cè)神經(jīng)氨酸酶二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.9 致病性試驗(yàn)

1.9.1 攻毒實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)將6周齡雌性BALB/c小鼠分為3組,分別空白對(duì)照、r MT組和r WT組,每組8只健康小鼠。用干冰將BALB/c小鼠輕度麻醉后,空白對(duì)照組每只小鼠鼻腔滴鼻接種50μL PBS液;r MT組每只小鼠經(jīng)鼻腔滴鼻接種r MT病毒稀釋液50μL(病毒含量為106TCID50);r WT組接種r WT病毒稀釋液50μL(病毒含量為106TCID50)。接種后繼續(xù)飼養(yǎng)14 d,記錄小鼠體重、存活數(shù)量和臨床癥狀,并計(jì)算小鼠攻毒不同毒株后的存活率。

1.9.2 組織切片 在第3天隨機(jī)無菌剖解攻毒組和對(duì)照組小鼠各2只,取腦、腎臟、脾臟、肺臟并分裝至5 m L滅菌的EP管中,一部分加入適量的組織固定液,組織切片送由廣西醫(yī)科大學(xué)完成;另一部分進(jìn)行組織病毒滴度測(cè)定。

1.9.3 組織病毒滴度檢測(cè) 取出第3天隨機(jī)剖取的臟器標(biāo)記稱重,按照g/m L的比例加入4℃預(yù)冷的接毒液和滅菌過的鋼珠,2000 r/min在組織研磨儀中研磨1 min,然后8000 r/min,4℃離心1 min,無菌快速吸取上清,倍比稀釋接種在長好單層細(xì)胞密度約80%的MDCK細(xì)胞的96孔板上,放置進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng),詳細(xì)測(cè)定流程如下。

1.9.3.1 細(xì)胞鋪板 將T25細(xì)胞瓶中生長狀態(tài)良好單層細(xì)胞密度約80%的MDCK細(xì)胞經(jīng)胰酶消化和完全培養(yǎng)基稀釋,以100μL/孔加入至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,上下?lián)u動(dòng)后于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。

1.9.3.2 病毒稀釋 在另一置于冰面上的96孔板進(jìn)行,第一列加入病毒原液每孔200μL,第2到12列中每孔加入病毒稀釋液180μL/孔,從第一列吸取20μL病毒液加至第2列混勻,然后倍比稀釋至第11列,第12列作細(xì)胞對(duì)照。

1.9.3.3 接種病毒 吸取稀釋病毒板每孔100μL轉(zhuǎn)移至Hank’s液洗過的鋪板MDCK細(xì)胞的96孔板,然后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.9.3.4 結(jié)果計(jì)算 從接種病毒的96孔板中每孔吸取50μL上清液按方法1.5測(cè)定血凝價(jià),按照根據(jù)Reed&Muench公式計(jì)算TCID50。

1.9.4 組織病毒含量檢測(cè) 對(duì)所需檢測(cè)的動(dòng)物組織按照天根病毒總RNA抽提試劑盒進(jìn)行抽提然后進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒定點(diǎn)突變結(jié)果 經(jīng)過突變PCR和質(zhì)粒消化后的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化、涂板和藍(lán)白斑篩選,挑選白色斑菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),再進(jìn)行PCR鑒定,鑒定陽性的質(zhì)粒進(jìn)行基因序列測(cè)定。通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)pBD-NA119G只在核苷酸第336位由A突變?yōu)镚,使氨基酸位點(diǎn)發(fā)生E(核苷酸:GAA)到G(核苷酸:GGA)的變化,而其他位置的氨基酸均未發(fā)生改變,表明質(zhì)粒定點(diǎn)突變成功,見圖1。

圖1 定點(diǎn)突變后測(cè)序r MT和r WT并對(duì)比Fig.1 Sequencer r MT and r WT after site-directed mutation and compare

2.2 血凝試驗(yàn)結(jié)果 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞懸浮液接種MDCK細(xì)胞連續(xù)傳代3代后血凝效價(jià)完全穩(wěn)定,拯救的r MT血凝效價(jià)最高為27,r WT為26,見圖2。

圖2 r MT和r WT血凝試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Hemagglutination tests for r MT and r WT

2.3 PCR鑒定結(jié)果 將轉(zhuǎn)染收獲的細(xì)胞懸液反復(fù)凍融后進(jìn)行用M基因片段引物進(jìn)行PCR鑒定,陰性對(duì)照無電泳條帶,陽性對(duì)照在700 bp位置出現(xiàn)條帶,對(duì)照組均成立。r MT和r WT在700 bp位置均有條帶出現(xiàn),經(jīng)測(cè)序得到684 bp核苷酸序列,NCBI比對(duì)后確認(rèn)拯救出了H1N1亞型豬流感病毒,見圖3。

圖3 r MT和r WT M基因片段擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplification of r MT and r WT M gene fragments

2.4 病毒生物曲線繪制 r MT與r WT相比,病毒復(fù)制能力有所增強(qiáng),但差異不顯著,主要表現(xiàn)在r MT 12 h至48 h時(shí)間段的復(fù)制速度略高于r WT 48 h后略有降低但相差不多,見圖4。

2.5 神經(jīng)氨酸酶相對(duì)活性測(cè)定 3份不同批次r WT病毒液在OD 450 nm處測(cè)量的光吸收值分別為0.1202、0.0993和0.1126,r MT病毒測(cè)量的光吸收值分別為0.1050、0.0944和0.0994,根據(jù)試劑盒所示算出樣品活性,3批次同一批次同比下降約8.7%、9.5%、8.8%,神 經(jīng) 氨 酸 酶 活 性 平 均 下 降 約9.0%,但變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F＝0.315,P＞0.05),見圖5。

圖5 r MT和r WT神經(jīng)氨酸酶相對(duì)活性檢測(cè)Fig.5 Relative activity of neuraminidase for r MT and rWT

2.6 神經(jīng)氨酸酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用軟件對(duì)神經(jīng)氨酸酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),結(jié)果見圖6。r MT 111位點(diǎn)至119位點(diǎn)Alpha Helix分值(A圖)分別為:0.96、0.89、0.95、0.96、0.93、0.88、0.85、0.79、0.82,均值為0.892。r WT 111位點(diǎn)至119位點(diǎn)的Alpha Helix分值(B圖)分 別為:1.06、1、1.06、1.07、1.03、0.99、0.95、0.9、0.92,均 值 為0.998。r MT與r WT相比Alpha Helix分值明顯下降,均值同比下降約為10.62%,經(jīng)突變后的r MT Alpha Helix結(jié)構(gòu)分值表現(xiàn)為下降趨勢(shì)。

圖6 r MT和r WT神經(jīng)氨酸酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction of secondary structure of neuraminidase for r MT and r WT

2.7 攻毒小鼠臨床癥狀、體重變化和存活情況 對(duì)照組小鼠均未出現(xiàn)死亡且體重呈持續(xù)增長趨勢(shì),而r MT與r WT攻毒小鼠后均不能致死小鼠,但攻毒組都會(huì)在第3 d出現(xiàn)明顯的被毛凌亂臨床癥狀,r WT攻毒組小鼠在第4 d和第5 d出現(xiàn)精神沉郁并伴有輕微的腹式呼吸,然后逐漸恢復(fù),第8 d典型的流感后臨床癥狀基本消失;r MT攻毒組小鼠在感染前期出現(xiàn)被毛凌亂,但能正常進(jìn)食,第5 d均開始出現(xiàn)輕微腹式呼吸的癥狀,個(gè)別小鼠在第6 d會(huì)出現(xiàn)呼吸急促癥狀,但第2 d呼吸急促會(huì)有所減輕,多數(shù)小鼠在第9 d典型的流感臨床癥狀會(huì)消失,臨床癥狀記錄表見表3。

表3 r MT與r WT攻毒小鼠的臨床癥狀Tab.3 Clinical symptoms of r MT and rWT in mice

r MT與r WT攻毒小鼠后均會(huì)導(dǎo)致體重迅速下降(見圖7),r WT組小鼠在第2 d開始明顯體重下降,第4 d平均體重達(dá)到最低,平均體重下降率為9.1%,個(gè)體最大體重下降率為10.3%,第5 d體重開始逐漸恢復(fù)。r MT組小鼠第3 d開始明顯體重下降,第6 d平均體重達(dá)到最低,平均體重下降率為9.9%,個(gè)體最大體重下降率為12.8%,第7 d體重開始逐漸恢復(fù)。第14 d r WT組小鼠基本恢復(fù)到原有體重水平,r MT組小鼠則比初始體重略低。

圖7 對(duì)照r MT與r WT攻毒小鼠平均和個(gè)體體重變化情況Fig.7 Mean and individual weight changes in control,r MT and r WT exposed mice

2.8 組織病毒滴度 攻毒r WT和r MT病毒第3 d小鼠組織病毒滴度檢測(cè)結(jié)果見圖8,r WT攻毒組小鼠肺組織的病毒滴度為(5.12±0.35)log10 TCID50/g,鼻甲骨的平均組織滴度為(4.21±0.34)log10 TCID50/g;r MT攻毒組小鼠肺組織的平均病毒滴度為(5.51±0.30)log10 TCID50/g,鼻甲骨的平均組織滴度為(4.46±0.24)log10TCID50/g。攻毒組在肺組織和鼻甲組織中的病毒滴度相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F肺＝0.219,F鼻＝0.278,均P＞0.05),r WT攻毒組鼻甲組織與肺臟中的病毒滴度相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F＝3.071,P＜0.05),r MT攻毒組鼻甲組織與肺組織中的病毒滴度相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F＝8.901,P＜0.01),表明突變后毒株不會(huì)明顯改變對(duì)上呼吸道和下呼吸道的組織親和性。此外,在r MT攻毒組的脾臟和腎臟組織中均檢測(cè)到病毒的存在,而r WT攻毒組則僅在脾臟組織中檢測(cè)出病毒。在脾臟組織中,r MT攻毒組組織病毒滴度為(0.87±0.35)log10 TCID50/g,r WT脾組織病毒滴度為(0.27±0.21)log10 TCID50/g,變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F＝2.976,P＜0.05),在腎臟組織中,測(cè)得r MT脾組織病毒滴度僅為(0.20±0.17)log10 TCID50/g,r WT攻毒組病毒滴度為0。

圖8 r WT和r MT攻毒小鼠組織病毒滴度Fig.8 rWT and r MT viral titers in mice

2.9 組織中病毒含量檢測(cè) 攻毒r WT和r MT病毒第3 d小鼠組織進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果見圖9。2組小鼠脾臟和腎臟中均有病毒存在,r MT攻毒組組織中病毒含量都高于r WT攻毒組,其中脾組織高1.5倍左右病毒拷貝數(shù)量,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F＝2.702,P＜0.05);腎組織高2倍左右病毒拷貝數(shù)量,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F＝61.625,P＜0.001);攻毒組小鼠腦組織中均未檢測(cè)到病毒的存在。

圖9 r WT和r MT攻毒小鼠組織病毒含量檢測(cè)Fig.9 Detection of virus content in tissues of r WT and r MT exposed mice

2.10 組織切片 根據(jù)組織中病毒含量的測(cè)定結(jié)果,我們對(duì)脾臟、腎臟和肺臟進(jìn)行了組織切片檢查。肺臟組織中的病變明顯:對(duì)照組(圖10A)肺臟組織細(xì)支氣管形態(tài)結(jié)構(gòu)未見明顯異常,肺泡壁厚薄正常,形態(tài)結(jié)構(gòu)未見明顯異常,沒有發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤;r WT攻毒組小鼠肺臟出現(xiàn)肺泡壁增厚和毛細(xì)血管淤血的現(xiàn)象(圖10B),r MT攻毒組小鼠肺泡壁增厚和毛細(xì)血管淤血,同時(shí)肺泡腔變窄并伴隨有少量中性粒細(xì)胞浸潤(圖10C)。結(jié)果顯示空白對(duì)照、r WT和r MT攻毒組小鼠的脾臟(圖10D、E和F)中,空白對(duì)照和r WT組未發(fā)現(xiàn)明顯病變,r MT攻毒組白髓見少量淋巴細(xì)胞壞死(藍(lán)色箭頭)。腎臟(圖10G、H和K)3個(gè)組的組織皮髓質(zhì)分界清楚,腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)未見明顯異常,腎小管排列緊密,形態(tài)結(jié)構(gòu)未見明顯異常,未見明顯炎性細(xì)胞浸潤;r MT攻毒組(圖10K)見靜脈擴(kuò)張,有淤血(黑色箭頭)。

圖10 對(duì)照r MT與r WT攻毒小鼠肺臟、脾臟、腎臟(HE染色,×200)Fig.10 HE staining of lungs,spleens and kidneys of control,r MT and r WT exposed mice(HE,×200)

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流感病毒反向遺傳學(xué)技術(shù)的應(yīng)用對(duì)研究流感病毒的基因組結(jié)構(gòu)和功能有著重要意義。NA蛋白的氨基酸變異可以影響神經(jīng)氨酸酶抑制劑的藥物敏感性、病毒釋放以及協(xié)同作用的其他生物學(xué)特性,如致病性和病毒組織組織親和性等。本研究中的2個(gè)獲救毒株存在血凝效價(jià)的差異,這可能是在病毒復(fù)制過程中NA蛋白同HA蛋白的協(xié)同作用釋放流感病毒步驟受到影響有關(guān),突變后的NA蛋白經(jīng)氨基酸二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)111位點(diǎn)至119位點(diǎn)Alpha Helix分值明顯下降,均值同比下降約為10.62%。其中,NA蛋白E119G的突變可影響到酶活性中心118位關(guān)鍵催化位點(diǎn)從而降低NA活性,這與H3N2亞型流感病毒在該位點(diǎn)的同等突變相似[12]。在突變對(duì)藥物敏感性影響方面,現(xiàn)有主流抗流感藥物有M2離子通道阻斷劑、神經(jīng)氨酸酶抑制劑以及中成藥,NA蛋白酶活性中心有8個(gè)關(guān)鍵催化位點(diǎn)以及11個(gè)酶活性輔助位點(diǎn),其中119E、152R、275H、293R、295N被認(rèn)為是神經(jīng)氨酸酶抑制劑藥物敏感位點(diǎn),發(fā)生突變后可影響毒株的藥物敏感性,最新研究發(fā)現(xiàn)247位點(diǎn)的改變也能引起其對(duì)奧司他韋的耐藥性。本研究中的H1N1亞型豬流感病毒發(fā)生E119G單位點(diǎn)突變是否會(huì)直接產(chǎn)生耐藥性還有待進(jìn)一步研究,值得注意的是,NA的耐藥突變往往具有協(xié)同效應(yīng),如H274Y與S247N和I117V等突變的組合可導(dǎo)致病毒對(duì)奧司他韋的耐藥性,而H3N2亞型流感病毒NA蛋白發(fā)生E119V和I222L雙突變可產(chǎn)生對(duì)奧司他韋的耐藥性[12]。此外,扎那米韋也是一種神經(jīng)氨酸酶抑制劑,但毒性較大,已有研究表明NA蛋白發(fā)生E119G/A/D和R292K突變或者HA蛋白發(fā)生K68R、G75E、E114K、N145S、S165N、S186F、N199S和K222T突變時(shí)會(huì)產(chǎn)生耐藥性,由于E119G突變產(chǎn)生耐藥性已被證實(shí)以及使用流感治療中使用扎那米韋的非必須性,因而本研究并未對(duì)r MT的扎那米韋耐藥性進(jìn)行重新驗(yàn)證。

在突變對(duì)致病性影響方面,在前期的研究中,我們發(fā)現(xiàn)1株對(duì)BALB/c小鼠致死率為100%的H1N1毒株,通過推導(dǎo)的氨基酸序列分析,與其它致病力弱的H1N1毒株主要氨基酸位點(diǎn)差異就是在NA基因上119位點(diǎn)發(fā)生了E119G的突變,推測(cè)HA蛋白Ca2抗原區(qū)發(fā)生V204D變異協(xié)同NA蛋白E119G變異可能是病毒抗原性改變和致病性增強(qiáng)的關(guān)鍵變異,因此我們利用r WT(HA蛋白Sb抗原區(qū)V204D變異)利用基因突變技術(shù)將NA蛋白119位點(diǎn)E替換成G后進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)r MT與r WT都沒有引起小鼠死亡,但小鼠體重下降幅度增加,最大為12.8%,組織切片顯示均在肺臟出現(xiàn)輕微炎癥,說明HA蛋白Ca2抗原區(qū)發(fā)生V204D的變異可能才是病毒致病性改變的關(guān)鍵。另外,我們?cè)跈z測(cè)小鼠組織病毒滴度和病毒含量中也發(fā)現(xiàn)了差異的存在,主要表現(xiàn)為r MT在脾臟組織和腎臟組織中的病毒含量較r WT明顯升高,說明HA蛋白發(fā)生位于Sb抗原區(qū)的V204D變異協(xié)同NA蛋白E119G變異也可能增強(qiáng)病毒與小鼠的組織親和性。豬流感病毒在自然情況下同時(shí)具有與SAα-2,6 Gal受體和SAα-2,3 Gal受體結(jié)合的能力,研究表明,BALB/c小鼠脾臟組織主要分布SAα-2,6 Gal受體,而腎臟組織中主要分布SAα-2,3 Gal受體,病毒含量檢測(cè)結(jié)果中r MT攻毒組小鼠在脾臟中的含量較r WT攻毒組極顯著增加,在腎臟組織中則是顯著增加,r MT對(duì)在腎臟組織中病毒含量顯著增高可能是病毒NA活性降低所導(dǎo)致,說明r MT對(duì)SAα-2,6 Gal受體的結(jié)合能力增強(qiáng)才是主要變化。研究認(rèn)為流感病毒HA蛋白第226位氨基酸被認(rèn)為是決定結(jié)合何種流感受體的關(guān)鍵,當(dāng)226位為L(亮氨酸)易與SAα-2,6 Gal受體特異性結(jié)合易攻毒人,當(dāng)226位為Q(谷氨酰胺)可與SAα-2,3 Gal受體結(jié)合攻毒禽類,而豬流感病毒中226位為M(蛋氨酸)可同時(shí)攻毒人和禽。研究使用的r WTHA蛋白第226位氨基酸為Q,病毒本身更趨向于結(jié)合SAα-2,6 Gal受體,但需要注意HA蛋白第227位和228位氨基酸發(fā)生變異能影響該位點(diǎn)的功能,研究使用的r WT未發(fā)生上述變異,因而在排除HA蛋白226位點(diǎn)附近位點(diǎn)變異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響的前提下,NA蛋白第119位氨基酸E到G的突變后會(huì)使病毒對(duì)SAα-2,6 Gal受體的結(jié)合能力明顯增強(qiáng),肯定了HA蛋白Sb抗原區(qū)204位氨基酸協(xié)同NA蛋白119位氨基酸變異的必要性。

本研究成功突變Pdm/09 H1N1流感病毒A/swine/Guangxi/12/2011株反向遺傳學(xué)體系p BDNA119E→pBD-NA119G并且成功拯救,為后續(xù)流感病毒研究奠定基礎(chǔ)。在生物特性研究方面,利用定點(diǎn)突變技術(shù)使NA蛋白發(fā)生E119G單點(diǎn)突變后,對(duì)病毒的復(fù)制能力沒有明顯影響,但用r WT和r MT病毒攻毒BALB/c小鼠后第3天的小鼠肺組織、鼻甲骨、脾和腎的病毒滴度,r MT攻毒組均比r WT攻毒組高,鼻甲組織與肺臟中的病毒滴度相比差異不顯著,脾和腎的差異顯著。突變株對(duì)BALB/c小鼠的致病力有一定增強(qiáng),臨床癥狀明顯;神經(jīng)氨酸酶活性下降。

利益沖突:無

引用本文格式:程倩,孔子榮,李三木,等.豬源Pdm/09 H1N1甲流NA定點(diǎn)突變拯救毒株的生物特性研究[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào),2022,38(10):890-897,905.DOI:10.3969/j.issn.1002－2694.2022.00.129