上海和廣東豬肉中弓形蟲感染的分子流行病學(xué)調(diào)查

陳曉雨,張燁華,陸金苗,朱詩蘭,藺智兵,米榮升,龔海燕,黃 燕,陳兆國,李國清

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種重要的人獸共患病原體,可以感染幾乎所有溫血動物(包括哺乳動物和鳥類)[1]。人和動物主要通過攝入被貓糞污染的土壤、飲水中的卵囊,或攝入未煮熟的肉類中含有的包囊而感染,感染后可引起腦炎患者或免疫功能低下者的全身性癥狀,如果不加以治療通常會致死[2]。此外,弓形蟲感染還可引起反應(yīng)遲鈍、精神分裂、情緒失控等精神性問題[3-4]。研究發(fā)現(xiàn),1990—2018年全球豬弓形蟲血清陽性率約為19%,非洲最高(25%),歐洲最低(13%),亞洲約為21%[5]。我國人弓形蟲的感染率約為7.9%,以隱性感染為主[6]。據(jù)報道,世界上約1/3人口呈弓形蟲血清陽性[7],造成大面積感染的原因究竟何在,故開展豬肉中弓形蟲攜帶情況的調(diào)查非常必要。

目前弓形蟲感染的檢測方法很多,其中以血清學(xué)試驗[7-8]和分子檢測方法[9]多見。此外,還可采用動物接種、組織培養(yǎng)和染色鏡檢[10]等方法。上述方法中血清學(xué)試驗的重復(fù)性和靈敏度較差,易出現(xiàn)交叉反應(yīng);常規(guī)PCR及巢式PCR不能對樣品進行定量分析,實時熒光定量PCR(qPCR)方法既可定性又可定量檢查,并且特異性強、敏感性高,能檢出低拷貝樣本[11]。畜禽田間樣品中弓形蟲的含量通常比較低[12]。因此,qPCR方法非常適合對豬肉樣本進行弓形蟲檢測。

豬肉是人類重要的肉類攝入來源,攝入攜帶弓形蟲的豬肉是人類感染弓形蟲的一個重要途徑。在世界范圍內(nèi)已報道許多起因食用豬肉而感染弓形蟲的病例[13-14]。同時,養(yǎng)豬場也不時報道暴發(fā)弓形蟲病,給豬場造成嚴重損失[15]。近年來,豬肉中弓形蟲的攜帶問題已引起人們關(guān)注。為了調(diào)查近年來上海市和廣東地區(qū)豬肉樣品中弓形蟲的攜帶情況并分析其流行因素,本研究采用qPCR方法對上海和廣東兩地屠宰場和市場豬肉樣品進行檢測與分析,以便為人類和豬的弓形蟲病防控提供新的資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 弓形蟲DNA 弓形蟲速殖子基因組DNA由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動物源性病原生物學(xué)及食品安全創(chuàng)新團隊提供。

1.1.2 主要試劑 血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司,p MD-19T載體、Premix Ex Taq酶購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司,瓊脂糖購自翊圣生物科技公司,大腸桿菌DH 5α購自北京擎科生物科技有限公司,其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 樣品采集 本研究從上海市5區(qū)(嘉定、浦東、閔行、松江和奉賢),以及廣東省4市(廣州、惠州、佛山和深圳)的屠宰場和市場采集豬的肌肉組織樣本,每個屠宰場采集30份膈肌樣本,每個菜市場(超市)采集3份腿肌樣本,共1450份。每個樣本約50 g,標記采樣地區(qū)、屠宰場或菜市場(超市)名稱、時間等信息。將樣本單獨放在塑料袋中,置于冷凍箱盡快運到實驗室,4℃冰箱保存,2 d內(nèi)處理完畢。

1.2.2 樣品前處理 每份樣品取3～5 g肌肉,用無菌剪刀將其剪碎,置于15 m L離心管中,離心管中裝入無菌鋼珠和5 m L PBS緩沖液。采用FastPrep組織快速破碎儀破碎,速度設(shè)置為6.0 m/s,持續(xù)40 s。取300μL勻漿提取基因組DNA。

1.2.3 基因組DNA提取 采用基因組DNA提取試劑盒提取豬肉組織的基因組DNA。取樣品勻漿進行10000×g離心5 min,隨后用蛋白酶K 56℃消化過夜,按照試劑盒說明書提取基因組DNA。提取的DNA樣品置于—20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 弓形蟲529 bp重復(fù)序列(repetitive 529 bp fragment,rep529)重組質(zhì)粒的制備 采用本實驗室建立的巢式PCR方法擴增弓形蟲rep529基因。使用DNA純化試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化。將純化后的PCR產(chǎn)物亞克隆到p MD-19T載體中,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH 5α中,用巢式PCR內(nèi)引物篩選陽性重組質(zhì)粒,送至生工生物技術(shù)(上海)有限公司測序。測序正確的陽性質(zhì)粒保存在—20℃冰箱。

1.2.5 qPCR檢測 以rep529為靶基因,參考藺智兵等[16]方法建立qPCR方法。正向引物和反向引物 分 別 為P1(5′-GCT CGC CTG TGC TTG GAG-3′)和P2(5′-ATC TTC TCC CTC TCC GAC TCT C-3′),探針為P3(FAM-TCG CTT CCC AAC CAC GCC ACC C-BHQ1),引物和探針均由上海擎科生物科技有限公司合成?？偡磻?yīng)體積為20μL,包括10μL Premix Ex Taq(2×Conc)、0.8μL(10 μmol/L)正 向 和 反 向 引 物、0.2 μL探 針、0.2μL ROX Reference Dye、2 μL DNA模 板,最 后 用dd H2O補足至20μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s,95℃變性15 s,60℃退火30 s,45個循環(huán)。將1×1010copy/μL重組質(zhì)粒DNA 10倍倍比稀釋,采用上述反應(yīng)條件,進行qPCR擴增,繪制標準曲線,檢測其敏感性;以日本血吸蟲、新孢子蟲、巴貝斯蟲、賈第蟲、隱孢子蟲和弓形蟲DNA作為模板,檢測其特異性。

1.2.6 巢式PCR檢測 采用本實驗室建立的巢式PCR檢測方法[17],擴增豬肉樣本中弓形蟲ITS靶序列。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用IBM SPSS 25.0統(tǒng)計軟件分析上海和廣東地區(qū)豬肉中弓形蟲攜帶情況。采用卡方(χ2)檢驗評估各種因素對弓形蟲感染的影響,檢驗水準α＝0.05。利用在線網(wǎng)站(http://www.vassarstats.net/)計算檢測結(jié)果的95%置信區(qū)間。

2 結(jié)果

2.1 弓形蟲qPCR檢測方法的建立 以弓形蟲DNA為模板,采用PCR技術(shù)擴增rep529序列,連接至p MD19-T載體,構(gòu)建含有rep529序列片段的重組質(zhì)粒,測序結(jié)果表明該重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。對構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA進行10倍倍比稀釋,共設(shè)6個梯度,每個梯度設(shè)3個重復(fù),根據(jù)qPCR擴增結(jié)果繪制標準曲線(圖1),結(jié)果表明該標準曲線R2值為0.9989,敏感性可達到1×102copies/μL。特異性試驗結(jié)果表明qPCR僅擴增弓形蟲DNA(圖2)。

圖1 實時熒光定量PCR的標準曲線Fig.1 Standard curve of real-time PCR

圖2 實時熒光定量PCR特異性試驗結(jié)果Fig.2 Specific detection with Real-time PCR

2.2 不同地區(qū)、不同年份豬肉樣品中弓形蟲攜帶情況 qPCR檢測結(jié)果顯示,在1450份豬肉樣品中檢出59份弓形蟲陽性,檢出率4.07%。其中,上海地區(qū)豬肉樣本弓形蟲的檢出率為6.32%(50/791),廣東為1.37%(9/659),上海地區(qū)的檢出率顯著高于廣東(χ2＝20.95,P＜0.01)。不同年份中,以2018年的檢出率最高,為9.29%;2019年未見陽性樣品,2020年檢出率為0.61%,不同年份之間檢出率差異顯著(表1)。

表1 不同年份豬肉中弓形蟲攜帶情況Tab.1 Prevalence of T.gondii infection in pork by year

2.3 不同來源豬肉樣品中弓形蟲攜帶情況 檢測結(jié)果顯示,屠宰場豬肉的檢出率為3.85%(35/908),其中上海地區(qū)為6.10%(30/492),廣東地區(qū)為1.20%(5/416);市場豬肉的檢出率為4.43%(24/542),其中上海地區(qū)為6.69%(20/299),廣東地區(qū)為1.65%(4/243),不同來源豬肉間陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2＝0.26,P＞0.05)(表2)。

表2 不同來源豬肉中弓形蟲攜帶情況Tab.2 T.gondii infection in pork by source

2.4 不同檢測方法檢測結(jié)果比較 采用套式PCR和實時熒光定量PCR分別對上海和廣東采集的884份豬肉樣本進行弓形蟲檢測,套式PCR檢出率為3.17%(28/884),qPCR檢 出 率 為6.33%(56/884),2種方法檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2＝8.91,P＜0.05)(表3)。

表3 不同檢測方法檢測結(jié)果比較Tab.3 Comparison of detection results of two methods

2.5 陽性樣品qPCR擴增的Ct值 本次qPCR擴增的陽性樣品中,Ct值大于35的占71.19%,屠宰場和市場分別 為77.14%和62.50;Ct值 在15～35的占16.95%,屠宰場和市場分別為17.14%和16.67%;Ct值小于15的占11.86%,屠宰場和市場分別為5.71%和20.83%(表4)。

表4 實時定量PCR檢測豬肉樣品DNA數(shù)據(jù)Tab.4 DNA data for pork samples detected with real-time PCR

3 討論

弓形蟲病是一種由剛地弓形蟲速殖子、包囊和卵囊被人和動物吞食后所引起的人獸共患病,豬肉中弓形蟲速殖子和包囊是重要的感染性階段。本研究采用qPCR技術(shù)檢測來自上海和廣東兩個地區(qū)2018－2020年的豬肉樣品,比較不同地區(qū)豬肉中弓形蟲的攜帶情況。結(jié)果顯示,兩地豬肉弓形蟲檢出率為4.07%,上海和廣東地區(qū)豬肉樣本弓形蟲的檢出率分別為6.32%和1.37%,上海的檢出率顯著高于廣東(χ2＝20.95,P＜0.01)。不同年份中以2018年的檢出率最高(9.29%),與2019(0%)和2020年(0.61%)相比差異顯著。比較而言,上海地區(qū)的檢出率(6.32%)低于Zhang Y等[17]使用巢式PCR對上海地區(qū)2016—2018年豬肉弓形蟲流行病學(xué)調(diào)查的結(jié)果(8.3%),豬肉中弓形蟲感染呈下降趨勢。其原因可能與非洲豬瘟的控制有關(guān)。自2018年8月以來由于我國暴發(fā)非洲豬瘟,各大養(yǎng)殖場相應(yīng)加強了豬場的生物安全措施[18-19],這些措施在控制非洲豬瘟的同時加強了養(yǎng)豬場的生物安全管理[20],降低了弓形蟲感染的可能性[21]。

檢測方法不同直接會影響弓形蟲的檢出率,尤其是在蟲荷比較低的情況下。本研究對采集的884份豬肉樣品同時進行巢式PCR和qPCR檢測,結(jié)果顯示巢式PCR對豬肉弓形蟲的檢出率為3.17%,而采用qPCR方法對相同樣品的檢出率為6.33%,2種方法的檢測結(jié)果差異顯著(P＜0.05)。此外,本次檢出的陽性樣本Ct值大于35的占71.19%,多數(shù)屬于低感染狀態(tài)。由此說明qPCR方法對低蟲荷樣本的檢測效果比巢式PCR好。不過這僅是分子檢測方法之間的比較,并未涉及與血清學(xué)方法如IFAT和MAT[22-24]之間的比較。本次檢出的陽性樣品中Ct值小于15的占11.86%,其中屠宰場和市場分別為5.71%和20.83%,差異顯著。這可能是由于采樣部位的不同,在屠宰場采集的是膈肌樣品,而在菜市場采集的是腿肌樣本。此外,市場上采集的豬肉樣本還有可能在分割、運輸、銷售等環(huán)節(jié)受到弓形蟲不同發(fā)育階段(如速殖子和卵囊)的污染。綜上所述,不同地區(qū)、不同年份、采樣部位不同,以及在流行病學(xué)調(diào)查中采取的檢測方法不同都會影響其調(diào)查的結(jié)果。但據(jù)以往流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,與豬的弓形蟲感染最密切相關(guān)的因素是豬場的綜合控制管理[25]。因此,預(yù)防弓形蟲的感染首先要做好生物安全工作,這是保證豬場安全生產(chǎn)的重中之重。

本研究對2018—2020年上海和廣東屠宰場和市場豬肉樣品中弓形蟲攜帶情況進行了分子流行病學(xué)調(diào)查,檢出率(4.07%)比2016—2018年采用類似方法調(diào)查的結(jié)果稍低;2019年以來豬肉中弓形蟲檢出率顯著下降,提示加強生物安全管理對于減少豬的弓形蟲感染、提高豬肉產(chǎn)品質(zhì)量與安全具有重要意義。

利益沖突:無

引用本文格式:陳曉雨,張燁華,陸金苗,等.上海和廣東豬肉中弓形蟲感染的分子流行病學(xué)調(diào)查[J].中國人獸共患病學(xué)報,2022,38(10):931-935.DOI:10.3969/j.issn.1002－2694.2022.00.132