濟(jì)南市平陰縣農(nóng)村環(huán)境鼠形動物調(diào)查與攜帶病原體檢測

于瑞洪,魏 凌,張 曉,李 輝,王 東

老鼠是人居環(huán)境中常見的病媒生物之一,不僅盜食糧食、污染食品、損壞物品,還會攜帶漢坦病毒、鉤端螺旋體、巴爾通體、立克次體等多種病原體,傳播多種疾病[1-3]。平陰縣位于濟(jì)南市西南部,地處北緯36°1′～36°23′、東經(jīng)116°12′～116°37′,全縣以丘陵山地為主,平原、洼地為次的地形分布特征,是國家級鼠類生態(tài)學(xué)監(jiān)測點。本研究在平陰縣5個鄉(xiāng)鎮(zhèn)農(nóng)村自然村中集中開展了鼠形動物調(diào)查,并對其攜帶的病原體進(jìn)行檢測,為預(yù)防和控制鼠傳疾病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查與鑒定 2020年11月21－30日,在平陰縣玫瑰鎮(zhèn)、東阿鎮(zhèn)、孔村鎮(zhèn)、安城鎮(zhèn)和孝直鎮(zhèn)5個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的73個自然村用鼠夾法和粘鼠板法開展鼠形調(diào)查(表1),并對采集的鼠形動物進(jìn)行分類鑒定[4]。

表1 鼠形動物調(diào)查村莊數(shù)與覆蓋面積Tab.1 Number and coverage of villages in this survey

1.2 樣本制備 將捕獲的鼠形動物放在解剖盤上,用75%乙醇消毒皮膚,用無菌剪刀沿腹部正中線剪開后,取出肝、脾和腎臟器官放入凍存管中,標(biāo)好編號;另換滅菌剪刀剪斷胸骨兩側(cè)軟肋骨,翻起胸骨,切取肺臟放入凍存管,標(biāo)好編號。將存放樣本的凍存管保存在－80℃超低溫冰箱中,剩余鼠體高壓后按實驗室垃圾處理,消毒試驗區(qū)域和試驗用具。

1.3 鼠傳致病菌檢測 使用DNA提取試劑盒DNeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen,69504)和PCR檢測試劑盒Taq PCR Master Mix Kit(Qiagen,201443)開展莫氏立克次體(Rickettsiamooseri)、嗜吞噬細(xì)胞無形體(Amaplasmaphagocytophilum)、恙蟲病東方體(Orientiatsutusgamushi)、土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)、巴爾通體(Bartonella)和致病性鉤端螺旋體(Leptospira)的檢測[5-6]。等量剪取鼠肝、脾和腎組織置于同一管中混合,按照DNeasy Blood&Tissue Kit說明書提取核酸,進(jìn)一步按照Taq PCR Master Mix Kit說明書配置20μL反應(yīng)體系,包括10μL Taq DNA聚合酶和d NTP混合液qPCR Master Mix,0.4μL探針,0.8 μL上/下游引物(表2)和5μL DNA模板。開展實時熒光定量PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min,1個 循 環(huán);95℃變 性15 s,60℃退 火45 s,45個循環(huán)。反應(yīng)設(shè)陽性和空白對照,陽性對照模板為各病原的靶標(biāo)序列質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。觀察擴(kuò)增曲線和Ct值,以Ct值≤40且有明顯擴(kuò)增曲線的原則判斷陽性批次。

表2 鼠傳致病菌引物序列Tab.2 Primer sequences for mouse borne pathogens

1.4 鼠傳病毒檢測 使用核酸提取或純化試劑盒(碩世生物,SDK60104)、漢坦病毒和漢城病毒核酸檢測試劑盒(碩世生物,JC60201)、新布尼亞病毒核酸檢測試劑盒(碩世生物,JC70107)檢測漢坦病毒(hantavirus)和發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus)[7-8]。剪取鼠肺組織或等量鼠脾、肝、腎組織研磨處理,按照核酸提取試劑盒制備RNA模板,進(jìn)一步按照病毒核酸檢測試劑盒說明書配置25μL反應(yīng)體系,包括12.5μL 2×Reaction Mix,0.5μL上/下游引物(表3),0.3μL探針,1μL Enzyme mix和5μL RNA模板。開展實時熒光定量PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件:50℃30 min;95℃10 min;95℃15 s,60℃45 s,45個循環(huán)。反應(yīng)設(shè)陽性和空白對照。觀察擴(kuò)增曲線和Ct值,以Ct值≤40且有明顯擴(kuò)增曲線的原則判斷陽性批次。

表3 鼠傳病毒引物序列Tab.3 Primer sequences for mouse borne viruses

1.5 數(shù)據(jù)分析計算方法如下:

組間數(shù)據(jù)資料采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行χ2檢驗。檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 捕鼠情況與鼠種構(gòu)成 共捕獲鼠形動物100只,其中小家鼠數(shù)量最多,捕獲55只,占捕獲總數(shù)的55%;其次是褐家鼠,捕獲40只,占捕獲總數(shù)的40%。此外,還捕獲到5只鼩鼱(表4)。

表4 鼠夾法和粘鼠板法的捕獲情況Tab.4 Murine-like-animals caught in mouse clips and mouse glue traps

捕獲的小家鼠、褐家鼠和鼩鼱中,粘鼠板均為主要的捕獲器械,捕獲率分別為85.45%、65.00%和100%。鼠夾法捕獲的鼠形動物中,褐家鼠所占的比例最高,為63.64%,而粘鼠板法捕獲的鼠形動物中,小家鼠所占的比例最高,為60.26%。

2.2 各鄉(xiāng)鎮(zhèn)的鼠密度 在平陰縣玫瑰鎮(zhèn)、東阿鎮(zhèn)、孔村鎮(zhèn)、安城鎮(zhèn)和孝直鎮(zhèn)5個鄉(xiāng)鎮(zhèn)17個農(nóng)村自然村共布放有效鼠夾3168夾次、有效粘鼠板2351板次,分別捕獲鼠形動物22只和78只,捕獲率分別為0.69%和3.32%,兩 者 差 異 有 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義(χ2＝52.20,P＜0.001)(表5)。

表5 平陰縣5個鄉(xiāng)鎮(zhèn)捕獲情況Tab.5 Murine-like-animals caught in five towns in Pingyin county

玫瑰鎮(zhèn)、東阿鎮(zhèn)、孔村鎮(zhèn)和安城鎮(zhèn)捕鼠環(huán)境為農(nóng)村居民區(qū),2種捕鼠器械捕獲率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2＝65.04,P＜0.001)。然而,在孝直鎮(zhèn)的養(yǎng)雞場環(huán)境中,粘鼠板法捕鼠率雖然高于鼠夾法,但兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2＝2.86,P＝0.09)。

2.3 攜帶病原體情況 平陰縣5個鄉(xiāng)鎮(zhèn)捕獲的鼠形動物均有檢出病原體,陽性率為28.00%～55.56%,平均陽性率為40.00%,各鄉(xiāng)鎮(zhèn)鼠形動物帶毒率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2＝5.71,P＝0.22)(表6)。

表6 濟(jì)南市平陰縣各鄉(xiāng)鎮(zhèn)捕獲鼠形動物攜帶病原體情況Tab.6 Pathogen detection in murine-like-animals in five towns in Pingyin County

對不同鼠形動物攜帶病原體的檢測發(fā)現(xiàn),55只小家鼠中,檢出陽性23只,陽性率為41.82%;40只褐家鼠中,檢出陽性14只,陽性率為35%;5只鼩鼱中,檢出陽性3只,陽性率為60.00%(表7)。3種鼠形動物帶毒情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2＝1.33,P＝0.52)。

共檢出混合感染6只,混合感染率為15.00%。其中,小家鼠4只、褐家鼠2只,混合感染率分別為17.39%和14.29%,兩者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2＝0.062,P＝0.80)?；旌细腥揪鶠殡p重感染,包括致病性鉤端螺旋體與土拉弗朗西斯菌、致病性鉤端螺旋體與恙蟲病東方體、致病性鉤端螺旋體與莫氏立克次體、致病性鉤端螺旋體與巴爾通體、嗜吞噬細(xì)胞無形體與莫氏立克次體、嗜吞噬細(xì)胞無形體與土拉弗朗西斯菌,未見三重及以上多重感染。

所檢測的8種病原體中,莫氏立克次體和致病性鉤端螺旋體的檢出率最高,均為17.00%,嗜吞噬細(xì)胞無形體、恙蟲病東方體、土拉弗朗西斯菌和巴爾通體的檢出率為1.00%～5.00%,并未檢出漢坦病毒和發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒(表7)。

表7 濟(jì)南市平陰縣不同鼠形動物攜帶病原體情況Tab.7 Pathogen detection in different species of murine-like-animals

3 討論

平陰縣屬暖溫帶大陸性半濕潤季風(fēng)氣候,地處泰山西延余脈與魯西平原的過渡地帶,境內(nèi)形成以丘陵山地為主,平原、洼地為次的地形分布特征,適宜鼠類等小型獸類棲息繁殖。本次調(diào)查環(huán)境中的平均捕獲率為1.81%,其中農(nóng)村居民區(qū)的捕獲率為1.54%,養(yǎng)殖場的捕獲率為4.55%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2＝23.5,P＜0.001),表明養(yǎng)殖場等重點場所的鼠患較為嚴(yán)重。捕獲的鼠形動物以小家鼠和褐家鼠為主,小家鼠的比例偏高,與其他地區(qū)調(diào)查一致[9-10],這可能因為現(xiàn)在的農(nóng)村居民住宅多為磚瓦混凝土結(jié)構(gòu)限制了褐家鼠棲息。無論是對鼠種分析還是對鄉(xiāng)鎮(zhèn)分析,粘鼠板法的捕獲率明顯高于鼠夾法的捕獲率,這可能與幾個因素有關(guān):1)調(diào)查季節(jié)屬于秋末初冬,因室外環(huán)境較冷,鼠類轉(zhuǎn)為室內(nèi)活動,而粘鼠板在室內(nèi)布放,鼠夾在室外布放,固粘鼠板捕獲鼠類較多;2)鼠夾為一次擊發(fā),而粘鼠板可以多次粘捕,在實際調(diào)查中也經(jīng)常發(fā)現(xiàn)粘鼠板捕獲多只鼠類的現(xiàn)象。

平陰縣5個鄉(xiāng)鎮(zhèn)捕獲的鼠形動物中均有檢出陽性,最高陽性率為55.56%,表明鼠群攜帶病原體的比例較高,其中莫氏立克次體和致病性鉤端螺旋體感染率最高,其相應(yīng)的疾病防控應(yīng)加強關(guān)注。值得一提的是,捕獲的5只鼩鼱感染率為60%。鼩鼱不同于鼠類,屬于食蟲目鼩鼱科,也經(jīng)常出沒于人居環(huán)境中,同樣有文獻(xiàn)報道鼩鼱攜帶致病病原體的情況[11-13]。

混合感染是指在同一機體檢出2種或2種以上的病原體,在同一鼠體內(nèi)曾報道可檢出多種病原[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)6種類型的雙重混合感染,以致病性鉤端螺旋體與其他病原體混合感染為主,并未發(fā)現(xiàn)三重及以上多重感染。從鼠種上看,小家鼠和褐家鼠均發(fā)現(xiàn)混合感染,兩者的混合感染率并沒有顯著性差異,而鼩鼱未出現(xiàn)這種情況,這可能與捕獲到的鼩鼱數(shù)量太少有關(guān),需進(jìn)一步擴(kuò)大調(diào)查范圍和種類以確定病原體混合感染在宿主上的選擇性。

綜上所述,平陰縣農(nóng)村居民區(qū)鼠形動物不僅攜帶病原體,且存在兩種病原體雙重感染的現(xiàn)象,這對相應(yīng)疾病的防控提出了更高的要求,除關(guān)注單一病原體的同時還需注意混合感染的可能。

利益沖突:無

引用本文格式:于瑞洪,魏凌,張曉,等.濟(jì)南市平陰縣農(nóng)村環(huán)境鼠形動物調(diào)查與攜帶病原體檢測[J].中國人獸共患病學(xué)報,2022,38(10):941-946.DOI:10.3969/j.issn.1002－2694.2022.00.113