貴州省鼠傷寒沙門菌單相變異株的CRISPR基因型和遺傳多樣性研究

白貴歡,游 旅,龍 利,牟鴻江,韋小瑜,,李世軍,王 銘,劉 英,劉淳婷,王 丹,汪俊華

自20世紀(jì)90年代報道了一種與鼠傷寒沙門菌抗原式及遺傳關(guān)系密切的沙門菌,即鼠傷寒沙門菌單相變異株,其是鼠傷寒沙門菌fljB基因突變或丟失從而導(dǎo)致II相鞭毛抗原(H2)無法表達(dá)的突變體[1],現(xiàn)已成為世界范圍內(nèi)一種非常重要的沙門菌血清型,在全球多個國家的畜牧、食品及人源樣品中的檢出率呈逐漸增高的趨勢[2]。2020年鄭州市從22家哨點(diǎn)醫(yī)院收集分離的沙門菌中,鼠傷寒沙門菌單相變異株的檢出率高于鼠傷寒沙門菌[3],在廣東省珠海市該血清型成為本地嬰幼兒腹瀉病例中檢出最多的菌株[4];2014—2018年江蘇省食源性疾病監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門菌變異株的陽性率呈逐年增長的趨勢[5]。近年,貴州省陸續(xù)從感染性腹瀉病例中分離出鼠傷寒沙門菌單相變異株,而其基因型和遺傳多樣性尚不清楚。規(guī)律的成簇間隔短回文重復(fù)序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)是由RNA介導(dǎo)的對外源核酸片段的干擾能形成獲得性和可遺傳性的生物免疫防御系統(tǒng),廣泛分布在細(xì)菌和古生菌的基因組中,由22～47 bp的重復(fù)序列和插入其中的間隔序列組成[6-7]。CRISPR的同向重復(fù)序列通常是保守的,間隔序列即使在同一種菌中,其重復(fù)數(shù)量和種類也可能各不相同,所以可作為靶標(biāo)對細(xì)菌進(jìn)行分型[8]。為了解貴州省鼠傷寒沙門菌單相變異株的基因型和遺傳多樣性特點(diǎn),本研究采用CRISPR方法對分離自2013－2018年貴州省7個市(州)的71株鼠傷寒沙門菌單相變異株進(jìn)行了CRISPR基因分型及遺傳多樣性分析,為貴州省鼠傷寒沙門菌單相變異株引起的沙門菌病的預(yù)防控制提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 基于貴州省感染性腹瀉病例的常規(guī)監(jiān)測,符合24 h腹瀉3次及以上且伴有糞便異常(稀便、水樣便、粘液便或膿血便)等的腹瀉患者糞便標(biāo)本進(jìn)行鼠傷寒沙門菌單相變異株的分離培養(yǎng)鑒定。2013年1月至2018年12月共收集到71株疑似鼠傷寒沙門菌單相變異株,其中銅仁市30株、貴陽市9株、安順市9株、遵義市17株、六盤水市1株、黔東南州3株、黔南州2株。

1.2 主要試劑及儀器 PCR擴(kuò)增儀為德國80WTprofessional Gradient 96;Pre Mix和DNA Marker DL2000購自大連寶生物公司;凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司;引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物公司合成。

1.3 菌株復(fù)核及血清分型 菌株接種至沙門菌顯色培養(yǎng)基上,36℃培養(yǎng)過夜,然后挑取淡紫色菌落接種于克氏雙糖鐵培養(yǎng)基和動力-吲哚-尿素培養(yǎng)基上進(jìn)行初步生化鑒定,再將符合沙門菌初步生化鑒定的菌株使用API20E生化鑒定板進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定,對明確鑒定為沙門菌的菌株轉(zhuǎn)種至營養(yǎng)瓊脂平板36℃過夜培養(yǎng)進(jìn)行O相抗原凝集,確定O相抗原后點(diǎn)種至沙門菌H相誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行H1、H2相血清凝集,依據(jù)White-Kauffman抗原表結(jié)合O相、H1相和H2相血清凝集結(jié)果對沙門菌進(jìn)行血清分型。

1.4 細(xì)菌DNA提取及雙重PCR法鑒定菌株 將血清分型為鼠傷寒沙門菌單相變異株的菌株劃線接種至血瓊脂平板,36℃培養(yǎng)過夜,然后刮取適量菌苔制成菌懸液,金屬浴100℃10 min,13000 r/min離心10 min,吸取上清液得到細(xì)菌DNA。以提取的DNA作為模板,引物參考Tennant等[9]的設(shè)計(jì),PCR反應(yīng)體系25μL,其中Pre Mix 12.5μL、上下游引物各1μL,模板DNA 1μL,用純水補(bǔ)至25μL。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性2 min;95℃變性30 s,64℃退火30 s,72℃延伸90 s,共30個循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果,出現(xiàn)1389 bp和1000 bp 2條擴(kuò)增條帶的判定為鼠傷寒沙門菌,僅出現(xiàn)1000 bp 1條擴(kuò)增條帶的判定為鼠傷寒沙門菌單相變異株。

1.5 CRISPR位點(diǎn)的檢測及分析

1.5.1 引物合成 根據(jù)Fabre[10]及莊孝飛[11]的研究報道合成CRISPR1和CRISPR2引物,引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物公司合成。

1.5.2 PCR擴(kuò)增和測序 配制50μL PCR擴(kuò)增體系:Pre Mix 25μL,上下游引物各2μL,DNA模板2 μL,純水19μL,并分別對CRISPR1和CRISPR2位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后,取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,使用凝膠成像儀觀察結(jié)果。將所得PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物送至北京天一輝遠(yuǎn)生物公司進(jìn)行雙向測序。

1.5.3 CRISPR序列的分析測序結(jié)果使用CRISPRCasfinder(https://crisprcas.i2bc.parissaclay.fr/Crispr CasFinder/Index)查找每個菌株的CRISPR位點(diǎn),得到其重復(fù)序列及間隔序列。通過Weblogo(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)對重復(fù)序列進(jìn)行保守性分析。根據(jù)Fabre[10]提出的命名方法對間隔序列進(jìn)行命名和分型,將CRISPR1和CRISPR2位點(diǎn)的間隔序列分別命名為STM(Spacer of Typhimurium Monophase)和STMB,后綴B表示在CRISPR2位點(diǎn)中發(fā)現(xiàn)的間隔序列,間隔序列按發(fā)現(xiàn)順序編號,對于每個分離株,CRISPR1和CRISPR22個位點(diǎn)的間隔序列組成一個CRISPR基因型,命名為TST(Typhimurium Sequence Type),不同型別用不同的數(shù)字后綴表示。進(jìn)一步使用Bionumerics 8.0軟件進(jìn)行遺傳多樣性分析。

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定 71株疑似鼠傷寒沙門菌單相變異株經(jīng)菌株復(fù)核、血清分型及雙重PCR法鑒定均為鼠傷寒沙門菌單相變異株。

2.2 CRISPR位點(diǎn)檢測 利 用PCR擴(kuò)增菌 株的CRISPR1和CRISPR2位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)71株鼠傷寒沙門菌單相變異株中有56株菌檢測到CRISPR1和CRISPR2位點(diǎn),10株菌只檢測到CRISPR1位點(diǎn),5株菌只檢測到CRISPR2位點(diǎn)。

2.3 重復(fù)序列組成及保守性分析 將測序結(jié)果與CRISPRCasfinder數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,71株鼠傷寒沙門菌單相變異株共有2110個重復(fù)序列,其中CRISPR1位點(diǎn)有912個重復(fù)序列,CRISPR2位點(diǎn)有1198個重復(fù)序列。通過Weblogo軟件分析結(jié)果如圖1,菌株CRISPR位點(diǎn)的重復(fù)序列均包含高度保守 的、長29 bp的 共 有 序 列5′-CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACAC-3′,但CRISPR1位點(diǎn)的重復(fù)序列比CRISPR2位點(diǎn)的重復(fù)序列更為保守,具體表現(xiàn)為CRISPR1位點(diǎn)的重復(fù)序列共有17個堿基存在突變,CRISPR2位點(diǎn)的重復(fù)序列共有24個堿基存在突變。

圖1 71株鼠傷寒沙門菌單相變異株CRISPR位點(diǎn)重復(fù)序列的保守性分析Fig.1 Conservation analysis of CRISPR locus repeats of 71 monophasic Salmonella Typhimurium strains

2.4 間隔序列組成 71株鼠傷寒沙門菌單相變異株的CRISPR位點(diǎn)共檢測到163個間隔序列(包含共享間隔序列),其 中CRISPR1有102個,CRISPR2有61個,長度為27～38 bp,未發(fā)現(xiàn)新的間隔序列。根據(jù)菌株CRISPR位點(diǎn)間隔序列組成,71株菌被分為19個CRISPR1型和11個CRISPR2型,基因型及出現(xiàn)頻率如圖2。CRISPR1位點(diǎn)的STM17間隔序列在部分菌株中重復(fù)2次,STM3、STM4、STM5、STM6、STM7、STM8這5個間隔序列存在于大部分菌株,在CRISPR2位點(diǎn)中,STMB8、STMB9、STMB10、STMB11、STMB12、STMB13、STMB14、STMB15這8個間隔序列存在于大部分菌株。

圖2 CRISPR1和CRISPR2位點(diǎn)基因型的間隔序列組成及出現(xiàn)頻率Fig.2 Spacer sequence composition and frequency of occurrence of CRISPR1 and CRISPR2 locus genotypes

2.5 CRISPR基因分型 將CRISPR1和CRISPR2位點(diǎn)的間隔序列聯(lián)合分析(如圖3),71株菌共得到33個CRISPR基因型(TSTs),命名為TST1-33,其中TST11和TST1是貴州省鼠傷寒沙門菌單相變異株的優(yōu)勢基因型,分別占總菌株數(shù)的25.35%和12.68%。除TST28和TST32、TST2、TST5、TST6、TST13、TST22、TST26、TST31只 檢測出CRISPR1或CRISPR2位點(diǎn)從而組成獨(dú)特的CRISPR基因型外,其余的TSTs間隔序列組成不同的CRISPR基因型。從CRISPR基因型的間隔序列組成來看,發(fā)現(xiàn)TST1和TST33雖間隔序列的排列相同,但由于TST33存在1個重復(fù)的間隔序列(STM17?),從而將分離自貴陽市、遵義市、銅仁市和安順市的菌株分成2個不同的CRISPR基因型。

圖3 貴州省71株鼠傷寒沙門菌單相變異株的33個TSTs基因型和出現(xiàn)頻率Fig.333 TSTs genotypes and frequency of 71 monophasic Salmonella Typhimurium strains in Guizhou Province

2.6 聚類分析 使用BioNumerics軟件對貴州省71株鼠傷寒沙門菌單相變異體與不同來源的參考株做系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果見圖4。根據(jù)各基因型親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近,33個TSTs基因型與3株不同來源的參考株被分為A、B、C、D 4個簇。A簇包含的菌株最多,主要來自2016—2018年的菌株,包括優(yōu)勢基因型TST11在內(nèi)的12個TSTs基因型,來自貴州省7個市州的分離株。B簇包括另一個優(yōu)勢基因型TST1且包含的基因型最多(14個TSTs),分離自2013—2018年貴陽市、遵義市、安順市、銅仁市和黔南州五個市州的菌株,其中TST33、TST1基因型的相似度達(dá)98.5%,2個基因型之間僅為1個間隔序列的差異。C簇由不同來源的3株參考株組成一個獨(dú)立的分支。D簇包含7個TSTs型,來自銅仁市、遵義市、安順市和黔東南州4個市州的分離株,但不含有2014年的菌株。整體來看,A簇CRISPR1、2位點(diǎn)的間隔序列排列差異不大,B、C兩簇CRISPR1位點(diǎn)間隔序列較CRISPR2位點(diǎn)的間隔序列更為多樣,而在D簇則大多缺失CRISPR2位點(diǎn)。

圖4 貴州省71株鼠傷寒沙門菌單相變異株與3株不同來源參考株的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of 71 monophasic Salmonella Typhimurium strains from Guizhou Province and three reference strains from different sources

3 討論

沙門菌是常見人獸共患病病原菌,在世界各地的食物中毒病例中位居榜首,其引起的感染性腹瀉給我國帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)及社會負(fù)擔(dān)[12]。鼠傷寒沙門菌單相變異株是鼠傷寒沙門菌的一種血清型,已被證明與鼠傷寒沙門菌具有相似的毒力和耐藥特征[13],是目前常見的沙門菌血清型之一。在歐洲與人沙門菌病的常見血清型中,鼠傷寒沙門菌單相變異株在2017年排名第3,僅次于腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌[14]。在我國河南省,鼠傷寒沙門菌單相變異株的檢出率已超過鼠傷寒沙門菌,成為僅次于腸炎沙門菌排名第2的沙門菌血清型[15],在2018—2019年廣東省中山市食源性疾病監(jiān)測及食物中毒事件中,鼠傷寒沙門菌單相變異株是其優(yōu)勢血清型之一,目前已成為廣東省最主要的流行血清型[16]。因此,及時、準(zhǔn)確地對鼠傷寒沙門菌單相變異株進(jìn)行鑒定、分型和進(jìn)化分析等有重大意義。CRISPR作為一個細(xì)菌獲得性免疫的機(jī)制,其重復(fù)序列具有高度的保守性,間隔序列通常來源于外源DNA,體現(xiàn)細(xì)菌在進(jìn)化過程中的多樣性,通過對不同菌株的間隔序列識別,可為細(xì)菌的鑒定、分型和進(jìn)化分析等提供可靠的工作依據(jù)[17]。近年來對其研究逐漸深入。周松等[18]利用CRISPR分型技術(shù)將128株鼠疫菌分為2個基因型,發(fā)現(xiàn)Cb2型為河北省長爪沙鼠疫源地的主要基因型,謝曉蕾等[19]將不同來源的173株鼠傷寒沙門菌及單相變異株分為34個CRISPR基因型,其中TST4為優(yōu)勢基因型,經(jīng)過溯源分析,發(fā)現(xiàn)豬是其優(yōu)勢基因型的主要宿主。另外,CRISPR分型還在空腸彎曲菌[20]、大腸桿菌[21]、志賀氏菌[22]等菌種有不同程度的應(yīng)用。本研究使用CRISPR分型技術(shù)對分離自貴州省7個市(州)的71株鼠傷寒沙門菌單相變異株CRISPR位點(diǎn)重復(fù)序列的保守性、間隔序列組成、CRISPR基因型及遺傳多樣性進(jìn)行了系統(tǒng)分析。

一般來說,沙門菌各血清型的重復(fù)序列顯著保守,長度為29 bp,重復(fù)序列包含高度一致的序列5′-CGGTTTATCCCCGCTGGCGCGGGGAACAC-3′[10]。本 研 究 中 發(fā) 現(xiàn),71株 菌CRISPR1和CRISPR2位點(diǎn)的重復(fù)序列與沙門菌CRISPR數(shù)據(jù)庫中出現(xiàn)頻率最高的重復(fù)序列一致,說明鼠傷寒沙門菌單相變異株CRISPR的重復(fù)序列具有高度的保守性。同時,在我們的研究中,CRISPR1和CRISPR2位點(diǎn)的重復(fù)序列分別有17和24個堿基存在突變,說明CRISPR2位點(diǎn)的重復(fù)序列堿基頻率比CRISPR1位點(diǎn)的重復(fù)序列堿基頻率要高,CRISPR1位點(diǎn)的重復(fù)序列比CRISPR2位點(diǎn)的重復(fù)序列更保守,與Shariat等[23]的研究結(jié)果一致,但在謝曉蕾[24]的研究中CRISPR1位點(diǎn)的重復(fù)序列僅存在4個堿基突變,CRISPR2位點(diǎn)的重復(fù)序列僅存在11個堿基突變,一方面可能是因不同血清型的沙門菌其重復(fù)序列堿基突變不同,另一方面也可能因菌株來源不同而導(dǎo)致。

有研究顯示[25-26],CRISPR結(jié)構(gòu)中的間隔序列被認(rèn)為是截取和保留某些外源入侵基因的片段,因此其排列順序反映了菌株對環(huán)境的適應(yīng)性進(jìn)化,而不同CRISPR的間隔序列是不同的,但相同的間隔序列則顯示出其具有特異性及適應(yīng)性,也有研究報道CRISPR間隔序列的多樣性是由于單個間隔-重復(fù)單元或連續(xù)間隔-重復(fù)單元的復(fù)制或刪除所形成的[10],因此該微變異導(dǎo)致了71株鼠傷寒沙門菌單相變異株被分為了19個CRISPR1型和11個CRISPR2型或33個CRISPR1-CRISPR2組 合型(CRISPR基因型),研究結(jié)果不僅說明CRISPR1位點(diǎn)間隔序列多樣性較CRISPR2位點(diǎn)間隔序列多樣性高,同時表明即使在相同血清型中,CRISPR基因型也具有高度的多樣性,這對于細(xì)菌分型來說意義重大。本研究發(fā)現(xiàn)CRISPR1位點(diǎn)的STM17間隔序列在部分菌株中重復(fù)出現(xiàn),可能原因是菌株被相似的噬菌體入侵或者是由于CRISPR序列的自我復(fù)制形成,其反映出它們在進(jìn)化上可能有所關(guān)聯(lián),其機(jī)制有待我們進(jìn)一步研究。同時發(fā)現(xiàn)TST1和TST33雖間隔序列排列相同,但由于TST33存在一個重復(fù)的STM17間隔序列,從而將來自不同地點(diǎn)的分離株分為不同的CRISPR基因型,說明CRISPR分子分型技術(shù)能在一定程度下區(qū)分同一血清型的變異。

PFGE分型技術(shù)被廣泛的用于溯源,在日常監(jiān)測或暴發(fā)事件中可以及時的發(fā)現(xiàn)污染源頭,但該方法只能通過圖譜分析條帶信息,且實(shí)驗(yàn)操作繁瑣,對實(shí)驗(yàn)人員要求較高,與PFGE相比,CRISPR分型方法不受實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和操作人員的影響,通過觀察間隔序列的排列順序和堿基片段可直觀的比較菌株的進(jìn)化特點(diǎn)和堿基變異情況。本研究選取的3株參考株[10,19]分離自豬源、雞源和人源的標(biāo)本,包括來自湖南省、江蘇省、江西省、遼寧省、浙江省、上海市和法國的分離株。從系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果上看,33個TSTs型與3株參考株明顯的分為獨(dú)立的分支,在進(jìn)化關(guān)系上遺傳相似性不高,說明貴州省鼠傷寒沙門菌單相變異株與其他省份或國外的CRISPR基因型有較大差異,可能有其他的感染來源,推測可能受地域等因素影響,有待做進(jìn)一步研究。從間隔序列的排列來看,不同來源的參考株有不同于貴州省33個TSTs基因型的間隔序列,這些間隔序列是否具有獨(dú)特的地域性還需擴(kuò)大菌株量進(jìn)行深入研究。另外,本研究發(fā)現(xiàn)貴州省某些菌株與菌株間的遺傳相似性較高,但菌株的分離地點(diǎn)多樣。如TST12與優(yōu)勢基因型TST11的遺傳相似性為94%,包含分離自銅仁市、貴陽市、遵義市、安順市和黔南州5個市州的菌株,TST33、TST1、TST20和TST29這4個基因型的遺傳相似性達(dá)98.1%,來源于貴陽市、遵義市、銅仁市和安順市4個市州的分離株,表明貴州省鼠傷寒沙門菌單相變異株的CRISPR基因型具有遺傳多樣性,不同菌株CRISPR基因型之間的遺傳關(guān)系密切,有可能來自相同的感染源。特別是作為優(yōu)勢基因型的TST11(存在于除2014年和2015年外的4年中)和TST1(在2013—2018年間均存在)同時包含貴陽市、銅仁市、遵義市和安順市4個不同分離地點(diǎn)的菌株,提示我們TST11和TST1具有在不同分離地點(diǎn)相互傳播的潛力且存在持續(xù)流行的情況,需引起重視。由于本研究收集的菌株量較少,不足以反映整體情況,將在以后的工作中結(jié)合流行病學(xué)資料進(jìn)一步對該血清型進(jìn)行系統(tǒng)監(jiān)測,擴(kuò)大菌株量對其進(jìn)行深入研究。

利益沖突:無

引用本文格式:白貴歡,游旅,龍利,等.貴州省鼠傷寒沙門菌單相變異株的CRISPR基因型和遺傳多樣性研究[J].中國人獸共患病學(xué)報,2022,38(10):862-868,873.DOI:10.3969/j.issn.1002－2694.2022.00.136