CRISPR/Cas9 基因編輯技術在腫瘤研究治療中的應用

周嵐，于鴻浩

（桂林醫(yī)學院生物技術學院，廣西 桂林 541199）

0 引言

惡性腫瘤是一種高死亡率疾病，在全球范圍內發(fā)病率逐年上升，嚴重威脅著類的生存[1]。盡管在惡性腫瘤治療領域取得了一系列令人振奮的成就包括手術治療、靶向生物治療、放療、化療、和新的聯(lián)合治療等，但術后高復發(fā)率、藥物毒副作用、放/化療耐藥性仍嚴重影響著患者生存時間和生活質量[2]。研究表明，所有惡性腫瘤都存在多種基因突變，主要涉及致癌基因的激活和抑癌基因的失活，從而改變了整個基因組的表觀遺傳學[3]。目前通過高通量測序技術已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量與癌癥發(fā)生和發(fā)展相關的基因[4-5]。在此研究基礎上，基因編輯技術通過調節(jié)基因的表達和糾正基因突變，為癌癥治療帶來了巨大的希望，導致精準腫瘤學領域的進一步突破[6]。

1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的簡介

2020年諾貝爾化學獎授予 Emmanuelle Charpentier和Jennifer A.Doudna兩位博士，以表彰她們開發(fā)的CRISPR/Cas9基因編輯技術，該技術為精確的基因編輯提供了新的有力工具。第三代基因組編輯技術即CRISPR/Cas9技術，它是由細菌和古細菌中存在的抵抗病毒入侵、清除病毒基因組的Ⅱ型CRISPR/Cas獲得性免疫系統(tǒng)經(jīng)人工改造而成[7-8]。它包含Cas9蛋白，CRISPR RNA（crRNA）和反式激活RNA（tracrRNA）三個核心原件，為了使CRISPR/Cas9技術在實際應用中更為簡便，Jinek等科學家將crRNA與tracrRNA融合在一起改造為依然具有引導Cas9蛋白識別靶點DNA序列功能的單鏈向導RNA（sgRNA）[9]。sgRNA通過堿基互補配對與靶序列相結合指導Cas9核酸內切酶切割目標DNA序列，造成雙鍵斷裂（DSBs）[10]。切割位點在“NGG”前間隔相鄰基序（PAM）上游序列的第3個堿基對上，DNA雙鍵斷裂后引發(fā)細胞內的修復機制，即非同源重組末端連接（NHEJ）或同源定向修復（HDR）[11]。HDR修復需要同源模板鏈，可精確介導基因的修復和置換，NHEJ 修復途徑則隨機產(chǎn)生堿基插入或缺失突變[12]。與鋅指蛋白核酸酶（ZFN）或轉錄因子激活樣效應物核酸酶（TALENs）等應用較早的基因編輯技術相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有操作簡單、設計靈活、高效、成本較低等優(yōu)點[13]，目前CRISPR/Cas9技術已成功實現(xiàn)基因敲除、基因修復、轉錄調控等操作，廣泛應用于不同研究領域。本文就CRISPR/Cas9基因編輯技術在腫瘤治療中取得的研究成果進行綜述，為腫瘤發(fā)病機制和臨床治療的相關研究提供參考。

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在腫瘤治療研究中的應用

2.1 建立腫瘤研究模型

小鼠是惡性腫瘤研究中常用的動物模型，傳統(tǒng)的胚胎干細胞打靶技術雖然適合在內源基因中產(chǎn)生復雜的遺傳修飾，但其操作繁瑣且耗時[14]。快速而精確的CRISPR/Cas9技術使研究人員能夠通過特定的基因修飾創(chuàng)建癌癥的小鼠模型，從而能夠更客觀地研究癌癥的發(fā)生機制。目前直接將 Cas9 mRNA和sgRNA通過顯微注射的方式注入小鼠受精卵中，在特定序列上產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂從而形成定向突變的方法大大加速了轉基因小鼠模型的生產(chǎn)[15]。比如通過流體動力尾靜脈注射共表達Cas9蛋白和靶向抑癌基因Pten的sgRNA的pX330載體質粒到成年小鼠的肝細胞中進行瞬時表達，獲得小鼠遲發(fā)型肝癌模型，并驗證小鼠肝臟Pten基因被特異性敲除[16]。利用AAV病毒將針對Kras、p53和LKB1基因的sgRNA導入化膿性鏈球菌Cas9（SpCas9）小鼠的肺部，成功地建立了小鼠肺癌模型[17]。

患者來源的異種移植（PDX）動物模型可以使人類腫瘤外源性生長，為腫瘤學研究提供不可或缺的臨床前工具[18]。小鼠是人類PDX模型最廣泛使用的宿主；然而小鼠體積過小限制了異種移植腫瘤的生長，這對樣本收集和藥物評價造成了影響。因此，研究人員使用CRISPR/Cas9技術敲除了Spraogue Dawley（SD）大鼠的Rag1、Rag2和Il2rg基因，該SD-RG大鼠存在嚴重的免疫缺陷，免疫系統(tǒng)中缺乏成熟的T、B和NK細胞。利用該大鼠模型研究人員地建立了一種肺鱗狀細胞癌的PDX模型，且移植腫瘤包含了原發(fā)腫瘤的組織病理學特征[19]。綜上所述，與小鼠相比，嚴重免疫缺陷的SD-RG大鼠支持PDX的快速生長，因此具有作為腫瘤研究的新模型的巨大潛力。

2.2 靶向敲除致癌基因

細胞生長調控機制紊亂是腫瘤發(fā)生的主要原因。在致癌因素的影響下，原癌基因突變導致異?；罨毎L信號通路被激活，幼稚細胞異常增殖，細胞成熟和凋亡受到抑制，從而導致腫瘤的發(fā)生[20]。體外研究表明，CRISPR/Cas9技術可以通過靶向敲除癌基因有效地抑制腫瘤細胞的生長。CRISPR-Cas9敲除CD133基因可減弱黑色素瘤的侵襲轉移能力、降低基質金屬蛋白酶MMP2/MMP9的表達水平[21]。用CRISPR/Cas9技術敲除miR-3064顯著抑制了胰腺癌細胞的增殖、侵襲和致瘤能力[22]。此外，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除癌基因EGFR的等位基因，發(fā)現(xiàn)肺癌細胞系H1975、A549和H1650的生長和增殖受到抑制，H1975或A549肺癌細胞的種瘤小鼠的腫瘤體積有所減小[23]。使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除KRAS突變的非小細胞肺癌細胞（NSCLC）中的FAK基因導致NSCLC細胞對放射治療的敏感性增加[24]。這些研究表明CRISPR/Cas9 基因編輯技術可通過靶向敲除致癌基因，干擾相關蛋白的表達，從而抑制腫瘤的生長。

2.3 靶向修復抑癌基因

抑癌基因的沉默、缺失或突變會激活癌基因，導致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[25]。CRISPR/Cas9技術可以在體內和體外實驗中快速驗證抑癌基因，此外大量研究為通過CRISPR/Cas9技術糾正抑癌基因突變和治療腫瘤提供了基礎。惡性胸膜間皮瘤（MPM）中發(fā)現(xiàn)了抑癌基因神經(jīng)纖維素2（NF2）的突變，與未經(jīng)處理的細胞相比，NF2基因敲除的人間皮細胞系MET-5A顯示出更強的遷移和侵襲能力[26]。且通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)在肺癌線粒體融合蛋白2（MFN2）基因敲除細胞上觀察到類似的現(xiàn)象[27]。通過CRISPR/Cas9技術使小鼠腦內多種腫瘤抑制基因（包括p53、Nf1、Pten和Ptch1）缺失，導致膠質母細胞瘤的發(fā)生[28]。這些研究表明，通過CRISPR/Cas9技術能夠快速識別抑癌基因。

此外CRISPR/Cas9技術通過修復失活的抑癌基因在癌癥治療發(fā)揮作用。Moses等科學家使用CRISPR/dCas9聯(lián)合反式激活劑VP64p65-RTA（VPR）激活癌細胞中低表達的PTEN基因。結果表明，通過dCas9-VPR系統(tǒng)，PTEN在黑色素瘤細胞中的表達水平升高，并且PTEN的激活明顯抑制了下游的致癌途徑[29]。Artegiani等人研究發(fā)現(xiàn)，利用CRISPR/Cas9技術使得正常人類膽管細胞中的BAP1基因喪失功能后，細胞變得異常活躍，并與其他器質融合，這一特征類似于腫瘤的轉移性侵襲。有趣的是，他們恢復了BRCA1關聯(lián)蛋白1（BAP1）在細胞核中的催化活性后，細胞恢復正常表型[30]。目前已使用CRISPR/Cas9基因編輯技術研究腫瘤抑制基因的癌癥包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、卵巢癌和宮頸癌、肝細胞癌等[31]。這些研究充分表明，使用CRISPR/Cas9技術進行基因修復或誘導腫瘤抑制基因的過度表達顯示出癌癥治療的新潛力。

2.4 腫瘤的免疫治療

腫瘤免疫療法不是直接攻擊腫瘤細胞，而是通過各種策略使機體發(fā)生適應性或先天性免疫應答來攻擊腫瘤細胞。程序性細胞死亡分子1（PD-1）是一種存在于活化的T細胞、B細胞和NK細胞表面的膜蛋白，表達于許多腫瘤細胞表面的PD-L1和PD-L2配體與PD1結合后可抑制T細胞對腫瘤細胞的免疫應答，使腫瘤細胞逃避免疫系統(tǒng)的清除，阻斷PD-1及其配體互作可恢復T細胞對腫瘤細胞的免疫應答[32]。因此，利用CRISPR-Cas9技術敲除包括PD-1基因和細胞毒性T淋巴細胞抗原4（CTLA-4）等，對于提高腫瘤免疫治療的療效至關重要。目前已有臨床實驗將CRISPR介導的PD-1基因敲除用于對前列腺癌、膀胱癌、肝細胞癌和轉移性腎細胞癌的治療，旨在進一步評估PD-1基因敲除在T細胞中的有效性和安全性[33]。

嵌合抗原受體（CAR）T細胞治療開啟了腫瘤治療的新紀元，尤其是FDA 批準了Kymriah和Yescarta（B細胞白血病和淋巴瘤中CD19基因修飾的自體T細胞）為CAR-T細胞，分別用于急性淋巴細胞白血病和某些類型的非霍奇金淋巴瘤患者[34,35]。盡管廣泛使用的自體CAR-T細胞在癌癥治療中具備良好療效，但仍存在一定局限性，與CRISPR/Cas9技術的結合將優(yōu)化CAR-T細胞療法。同種異體通用CAR-T細胞應用于異體移植需要克服兩個障礙即移植物抗宿主病（GVHD）和改善生物安全性以獲得更強大的腫瘤靶向作用。為了解決這些障礙，研究人員使同種異體通用T細胞中的內源性α、βT細胞受體（TCRs）和人類固有白細胞抗原（HLA）分子沉默或破壞。在幾項研究中，CRISPR/Cas9技術介導的TCRβ鏈和β-2微球蛋白（B2M）的多重敲除已被用于生產(chǎn)通用CAR-T細胞，結果表明，這些通用細胞在體外和體內都保持了功能，不會引起移植物抗宿主病[36-37]。在一項使用CRISPR/Cas9干擾粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）的研究中，構建了GM-CSF缺陷的CART19細胞，其細胞抗腫瘤活性增強，總存活率提高。此外，在使用抗GM-CSF人源化IgG1 Kappa輕鏈抗體lenzilumab中和GM-CSF后，白血病得到持久控制，患者來源的異種移植物中的細胞因子釋放綜合征和神經(jīng)炎癥減少，研究者計劃使用Lenzilumab和CART19細胞療法的組合進行二期臨床研究[38]。這些研究證實了CRISPR/Cas9基因編輯技術在腫瘤免疫治療中的應用可行性。

2.5 修復表觀遺傳調控基因

在腫瘤細胞中表觀遺傳調控基因經(jīng)常發(fā)生突變，導致基因表達紊亂[39]。DNA甲基轉移酶和組蛋白修飾酶在惡性腫瘤細胞中經(jīng)常發(fā)生突變，因此在基因水平上對表觀遺傳調控基因的編輯對糾正腫瘤表觀遺傳障礙尤為重要[40,41]。CRISPR/Cas9技術用于靶向特異性乙?；D移酶p300激活中心，催化組蛋白H3賴氨酸的乙?；?，激活基因啟動子和近端、遠端增強子。即CRISPR/Cas系統(tǒng)通過靶向乙?；D移酶活性的相關基因使其特異性激活從而調控靶基因轉錄[42]。因此，靶向編輯基因乙?；笧檎{控基因轉錄提供了有力的途徑，靶向修復表觀調控酶編碼基因是腫瘤治療的有力手段。

3 結語

目前，如要充分實現(xiàn)CRISPR/Cas9基因編輯技術在臨床中的應用，需要面臨許多挑戰(zhàn)，如編輯效率[43]、脫靶效應[44]，及如何高效的將CRISPR/Cas9系統(tǒng)成分導入目標組織等[45]，這對腫瘤治療尤為重要，科研工作者正致力于對CRISPR/Cas9系統(tǒng)特異性及遞送方法進行優(yōu)化改進。CRISPR/Cas9基因編輯技術被廣泛應用于腫瘤研究，但是目前大部分研究還處于初級階段，更深入的技術還有待開發(fā)和應用。CRISPR/Cas9基因編輯技術在分子水平上仍存在許多與腫瘤治療相關的問題尚未解決，這項技術必須經(jīng)過嚴格的臨床測試，包括有效性、安全性和特異性測試，確認其安全有效，然后才能投入臨床應用。但不可否認的是，CRISPR/Cas9基因編輯技術在基因層面上對腫瘤治療具有極大的潛力，為腫瘤的治療帶來了希望，基于CRISPR/Cas9的個性化和靶向治療可能是腫瘤治療的發(fā)展趨勢。