基于鉑氧化銅負(fù)載多壁碳納米管標(biāo)記夾心型電化學(xué)免疫傳感器

孫靜波，欒業(yè)波，馬世花，鄭 釗，邢儀雯，張洪靜

（1．煙臺(tái)南山學(xué)院 工學(xué)院，山東 煙臺(tái) 265713；2．煙臺(tái)南山學(xué)院 化工學(xué)院，山東 煙臺(tái) 265713；3．航鑫材料科技有限公司，山東 煙臺(tái) 264006）

乙型肝炎病毒是常見病毒之一，具有廣泛的傳播性［1］。人血清中乙肝表面抗原（HBs）是一種高特異性、敏感性的（肝）癌標(biāo)志物，健康人血清中HBs的質(zhì)量濃度約為25 ng/mL，而肝癌患者血清中HBs的質(zhì)量濃度明顯升高［2］。因此，HBs的靈敏檢測(cè)對(duì)乙肝的早期診斷起著重要作用［3］。目前，已有許多檢測(cè)HBs的方法，包括時(shí)間分辨熒光法［4］、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析［5］、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)［1］和無酶電化學(xué)免疫傳感器［6］。與這些方法相比，電化學(xué)免疫傳感器具有檢出限低、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、成本低的優(yōu)點(diǎn)［7］。因此，制備一種高靈敏電化學(xué)免疫傳感器用于HBs的檢測(cè)非常重要。

石墨烯（GS）具有大比表面積、優(yōu)良機(jī)械性能和高電導(dǎo)率，在納米材料制備中已被廣泛應(yīng)用［8-10］。然而，其在水溶液中的分散性較差，易堆疊。為了提高石墨烯分散性，在完全還原之前將SnO2分子引入到石墨烯中，得到SnO2負(fù)載石墨烯（GS-SnO2），SnO2的存在阻斷了石墨烯層間的堆疊，同時(shí)提高了分散性，增加了石墨烯的結(jié)合位點(diǎn)，易于負(fù)載大量金納米顆粒［11］。金納米顆粒能提高導(dǎo)電性，并具有良好電催化活性［12］。因此，金負(fù)載二氧化錫石墨烯（GS-SnO2-Au）是理想的基底材料，可通過金納米顆粒與—NH2緊密結(jié)合固定捕獲抗體（Ab1）。

多壁碳納米管（MWCNTs）作為性能優(yōu)異的載體材料，因具有較高電導(dǎo)率、良好化學(xué)穩(wěn)定性、大比表面積、高表面/體積比、高機(jī)械強(qiáng)度和易于功能化的表面，在電化學(xué)分析領(lǐng)域中引起了廣泛關(guān)注［13］。根據(jù)Pietrzak等［14］研究，利用多壁碳納米管（MWCNTs）和離子液體構(gòu)建離子選擇電極用于硝酸鹽的檢測(cè)［15］。MWCNTs本身對(duì)H2O2具有較高催化活性。氧化銅（CuO）作為一種催化劑具有較高的活性和選擇性，是目前應(yīng)用最為廣泛的催化劑［16］。而鉑電極因具有較高催化活性，被用于過氧化氫的直接檢測(cè)［17］。

本文以3種材料復(fù)合的鉑氧化銅負(fù)載多壁碳納米管（Pt@CuO-MWCNTs）作為標(biāo)記物，GS-SnO2-Au為檢測(cè)平臺(tái)，構(gòu)建了一種夾心型電化學(xué)免疫傳感器，用于人血清中HBs的定量檢測(cè)。設(shè)計(jì)的免疫傳感器為檢測(cè)HBs提供了一個(gè)可靠的檢測(cè)平臺(tái)，該方法具有較高的電流響應(yīng)、較寬的線性范圍和較低的檢出限，可實(shí)現(xiàn)對(duì)HBs的高靈敏檢測(cè)，在臨床腫瘤標(biāo)志物篩查、癌癥診斷和愈后復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

HBs抗體、HBs抗原（上海領(lǐng)潮生物科技有限公司）；牛血清白蛋白（BSA，96%~99%）、聚二甲基二烯丙基氯化銨（PDDA）購(gòu)自Sigma公司；GS-SnO2（SnO2含量：50%，石墨烯：500 nm~5 μm）購(gòu)自先豐納米科技有限公司；多壁碳納米管（直徑10~20 nm，長(zhǎng)度30 μm，純度＞95%）、四氯鉑酸鉀（K2PtCl4）、乙酸銅（Cu（CH3COO）2·H2O）購(gòu)自阿拉丁公司。采用1/15 mol/L KH2PO4和1/15 mol/L Na2HPO4制備磷酸緩沖溶液（PBS，pH 7．4）。其他化學(xué)品均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

CHI760D電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）；H-600透射電子顯微鏡（TEM，日本日立公司）。

1.2 GS-SnO2-Au復(fù)合材料的制備

通過一種簡(jiǎn)單的化學(xué)方法合成GS-SnO2-Au復(fù)合材料［2］：將50 mL 0．01%的HAuCl4加熱至沸騰，加入0．75 mL 1%檸檬酸鈉，保持沸騰15 min，冷卻至室溫，得到金納米顆粒溶液。將15 mg GS-SnO2分散于20 mL 25%的PDDA溶液中，攪拌30 min，再加入60 mL金納米顆粒溶液，繼續(xù)攪拌過夜，得到GS-SnO2-Au黑色懸浮液。采用離心分離、干燥、研磨制得黑色粉末。1 mg黑色粉末經(jīng)超聲波處理后均勻分散于1 mL水溶液中，得到1 mg/mL GS-SnO2-Au溶液。

1.3 Pt@CuO-MWCNTs的制備

將0．5 g MWCNTs加入3．0 mol/L HNO3和2．0 mol/L H2SO4（體積比3∶1）混合溶液中，去除MWCNTs中的金屬氧化物，40℃下超聲3 h。經(jīng)過預(yù)處理的MWCNTs在室溫下冷卻，用水沖洗至中性后，在室溫下干燥。

將16 mg Cu（CH3COO）2·H2O溶于5 mL水中，攪拌下加入0．1 mL 25%的NH4OH溶液，并將10 mg上述預(yù)處理的MWCNTs分散于溶液中，反應(yīng)17 h，離心分離并洗滌，在70℃真空條件下干燥。最終產(chǎn)物在350℃，N2保護(hù)下煅燒3 h得到CuO-MWCNTs復(fù)合材料。

采用化學(xué)還原法制備Pt@CuO-MWCNTs［18］：將CuO-MWCNTs復(fù)合材料分散于5 mL 5 mg/mL的K2PtCl4水溶液中。緩慢加入0．1 mol NaBH4和1 mol NaOH的混合溶液還原Pt鹽。在pH 3．2鹽酸溶液中，100℃冷凝回流12 h，離心分離洗滌干燥后，得到Pt@CuO-MWCNTs復(fù)合材料，35℃真空中干燥12 h。4 mg Pt@CuO-MWCNTs超聲分散于1 mL水中備用。

1.4 制備免疫探針Pt@CuO-MWCNTs/Ab2

將2 mg Pt@CuO-MWCNTs加 入1 mL 10 μg/mL的Ab2溶 液中，4℃下 振蕩 孵 化12 h，制 得Pt@CuO-MWCNTs/Ab2，4℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 免疫傳感器的構(gòu)建

夾心型電化學(xué)免疫傳感器的組裝過程如圖1所示：依次用1．0、0．3、0．05 μm的Al2O3粉末拋光裸玻碳電極（GCE）。將6 μL 1 mg/mL的GS-SnO2-Au溶液滴至GCE表面并干燥。在電極表面滴加6 μL 10 μg/mL的Ab1溶液，孵化1 h。接著滴加3 μL 1%的BSA溶液至電極，孵化1 h以消除非特異性結(jié)合位點(diǎn)。水洗滌后，將6 μL不同濃度的HBs溶液滴至電極，孵化1 h。最后，將6 μL 2 mg/mL的Pt@CuOMWCNTs/Ab2溶液滴加在電極表面完成免疫反應(yīng)。

圖1 鉑氧化銅負(fù)載多壁碳納米管免疫傳感器的制備Fig．1 The preparation procedures of Pt@CuO-MWCNTs immunosensor

1.6 實(shí)際樣品預(yù)處理及乙肝表面抗原檢測(cè)

血清樣本由醫(yī)院提供。通過以下步驟對(duì)人血清樣品進(jìn)行特殊處理：將人血清樣品在4℃下靜置24 h去除血細(xì)胞和其他血液沉淀物并儲(chǔ)存于無菌管中。用PBS（pH 7．4）稀釋血清樣品至適當(dāng)濃度，通過制備免疫傳感器檢測(cè)血清樣本的上清液。

采用三電極系統(tǒng)進(jìn)行電化學(xué)測(cè)量：直徑4 mm的GCE為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為輔助電極，通過計(jì)時(shí)電流記錄電流響應(yīng)，檢測(cè)電壓為-0．4 V，測(cè)量均在pH 7．4的PBS中進(jìn)行，磁力攪拌下電流穩(wěn)定后，用微量注射器向PBS中注入10 μL 5 mmol/L的H2O2溶液，記錄電流變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 GS-SnO2-Au和Pt@CuO-MWCNTs的表征

分別對(duì)GS-SnO2和GS-SnO2-Au進(jìn)行表征。通過高倍透射電鏡表征圖可看出SnO2納米顆粒均勻地鑲嵌在石墨烯表面，其晶格間距為0．33 nm，對(duì)應(yīng)金紅石相SnO2的生長(zhǎng)方向。SnO2納米粒子的粒徑為3~5 nm，其表面帶正電荷，可通過物理吸附、靜電結(jié)合或電荷轉(zhuǎn)移與石墨烯相互結(jié)合（圖2A）。通過透射電鏡圖可觀察到GS-SnO2的形貌呈明顯的二維層狀結(jié)構(gòu)，金納米顆粒大小均勻，且均勻負(fù)載在GS-SnO2表面（圖2B）。

圖2 GS-SnO2的高倍透射電鏡（A）及GS-SnO2-Au的透射電鏡圖（B）Fig．2 HRTEM image of GS-SnO2（A），and TEM image of GS-SnO2-Au（B）

采用相同濃度的MWCNTs、CuO-MWCNTs和Pt@CuO-MWCNTs分別修飾GCE，并在電化學(xué)工作站上檢測(cè)催化H2O2獲得的計(jì)時(shí)電流。如圖3A所示，CuO-MWCNTs（曲線b）的催化能力是MWCNTs（曲線a）的20倍，Pt@CuO-MWCNTs（曲線c）是CuO-MWCNTs（曲線b）的2倍，表明Pt@CuO-MWCNTs的催化活性最強(qiáng)。通過TEM進(jìn)一步觀察CuO-MWCNTs和Pt@CuO-MWCNTs的形態(tài)（圖3B、C），可以觀察到CuO納米顆粒的粒徑為15~20 nm，鑲嵌在多壁碳納米管內(nèi)部，圖3C內(nèi)插圖為Pt@CuO-MWCNTs的高倍透射電鏡圖，可觀察到Pt納米顆粒鑲嵌在管壁的外表面。圖4為Pt@CuO-MWCNTs的能譜圖，圖中可明顯觀察到C、O、Cu、Pt的元素峰，其中元素含量百分比分別為C（81．35%）、O（7．30%）、Cu（9．88%）、Pt（1．47%），研究結(jié)果表明，Pt和CuO已負(fù)載在MWCNTs上。

圖3 MWCNTs（a），CuO-MWCNTs（b）和Pt@CuO-MWCNTs（c）的計(jì)時(shí)電流圖（A）；CuO-MWCNTs（B）的透射電鏡圖；Pt@CuO-MWCNTs的透射電鏡圖（C）及Pt@CuO-MWCNTs的高倍透射電鏡圖（D）Fig．3 Amperometric responses of MWCNTs（a），CuO-MWCNTs（b）and Pt@CuO-MWCNTs（c）（A），TEM images of CuO-MWCNTs（B）and Pt@CuO-MWCNTs（C），HRTEM image of Pt@CuO-MWCNTs（D）

圖4 Pt@CuO-MWCNTs的能譜圖Fig．4 Energy spectrum of Pt@CuO-MWCNTs

2.2 免疫傳感器的表征

以逐層修飾的玻碳電極作為工作電極，在5 mol/L K3［Fe（CN）6］電解液中采用循環(huán)伏安法（CV）表征了免疫傳感器的組裝（如圖5A）。首先在GCE（曲線a）上修飾GSSnO2-Au（曲線b），電極的氧化還原峰增強(qiáng)，接著分別在電極表面修飾Ab1（曲線c）、BSA（曲線d）和HBs（曲線e），由于生物活性物質(zhì)阻礙了電子轉(zhuǎn)移，使得氧化還原峰電流逐漸下降。最后在電極表面修飾Pt@CuO-MWCNTs/Ab2（f），峰電流再次下降，表明免疫傳感器已成功構(gòu)建。

采用電化學(xué)阻抗譜法研究了層層修飾電極的電子轉(zhuǎn)移能力，以表征電化學(xué)免疫傳感器的組裝過程。在0．1~105Hz記錄交流阻抗譜圖，高頻區(qū)域?yàn)榘雸A，表示電子轉(zhuǎn)移電阻（如圖5B）。隨著GS-SnO2-Au（曲線b）修飾在GCE（曲線a）上，電阻有所減少，當(dāng)Ab1（曲線c）、BSA（曲線d）、HBs（曲線e）依次修飾在電極上時(shí)，由于大量生物活性物質(zhì)的疊加阻礙了電子轉(zhuǎn)移，電極的阻抗進(jìn)一步增大。最后，在電極表面修飾Pt@CuO-MWCNTs/Ab2，Ab2進(jìn)一步抑制電子轉(zhuǎn)移，基于Pt@CuO-MWCNTs的良好導(dǎo)電性，使電極的阻抗增幅減少（曲線f），表明免疫傳感器已成功構(gòu)建。

圖5 免疫傳感器構(gòu)建的循環(huán)伏安圖（A）及交流阻抗圖（B）Fig．5 CV curves（A）and Nyquist diagrams（B）of the immunosensor

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

為獲得最佳的電化學(xué)檢測(cè)信號(hào)，對(duì)pH值、GS-SnO2-Au及Pt@CuO-MWCNTs質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化。由于強(qiáng)酸（堿）性環(huán)境會(huì)破壞抗原和抗體的活性，配制了pH 5．0~8．0的系列PBS緩沖溶液。圖6A顯示，在pH 5．0~7．4范圍內(nèi)，電流信號(hào)逐漸上升并達(dá)到最大值，之后隨pH值的增大其電流信號(hào)下降。因此實(shí)驗(yàn)選擇最佳pH值為7．4。

如圖6B所示，在0．5~1．0 mg/mL范圍內(nèi)，隨著GS-SnO2-Au質(zhì)量濃度的增加，Ab1的固載量增加，與抗原免疫結(jié)合的探針量增加，進(jìn)而電流信號(hào)也隨之增加。但隨著GS-SnO2-Au質(zhì)量濃度從1 mg/mL增加到2 mg/mL時(shí)，界面電子轉(zhuǎn)移電阻增大，電流逐漸減小。因此，實(shí)驗(yàn)選擇GS-SnO2-Au的最佳質(zhì)量濃度為1 mg/mL。圖6C所示，電流信號(hào)隨Pt@CuO-MWCNTs質(zhì)量濃度的增加而增加，直至2 mg/mL時(shí)達(dá)到最大值，當(dāng)質(zhì)量濃度超過2 mg/mL時(shí)，電流信號(hào)減小。因此，實(shí)驗(yàn)選擇Pt@CuOMWCNTs的最佳質(zhì)量濃度為2 mg/mL。

圖6 pH值（A），GS-SnO2-Au（B）及Pt@CuO-MWCNTs（C）質(zhì)量濃度對(duì)電流信號(hào)的影響Fig．6 Effects of pH value（A），concentration of GS-SnO2-Au（B）and Pt@CuO/MWCNTs（C）on the immunosensor error bar=5%

2.4 免疫傳感器檢測(cè)HBs的工作曲線

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，該電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)一系列 不 同 質(zhì) 量 濃 度（0、0．001、0．01、0．1、1、50、100 ng/mL）HBs，圖7為獲得的計(jì)時(shí)電流曲線圖。結(jié)果顯示，檢測(cè)HBs三次注入H2O2引起電流變化的均值（Y）與其質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值（X，ng/mL）呈線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7插圖，線性方程為Y=127．51+11．14X（r2=0．996 9），線性范圍為0．001~100 ng/mL，檢出限（S/N=3）為0．33 pg/mL。

圖7 系列質(zhì)量濃度HBs的計(jì)時(shí)電流曲線圖Fig．7 Amperometric I-t current curve of HBs at different concentrations insert：calibration plot between I-t current and the logarithm values of HBs concentrations

2.5 不同方法的比較

將Pt@CuO-MWCNTs免疫傳感器與其他檢測(cè)HBs的免疫傳感器進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示，Pt@CuOMWCNTs的多重放大信號(hào)作用使得該免疫傳感器的檢出限明顯低于其它方法（見表1），可實(shí)現(xiàn)HBs的靈敏檢測(cè)。

表1 Pt@CuO-MWCNTs免疫傳感器與其他電化學(xué)傳感器的對(duì)比Table 1 Comparison of Pt@CuO-MWCNTs immunosensor and the other sensors

2.6 重現(xiàn)性、選擇性與穩(wěn)定性

相同條件下平行制備5支免疫傳感器，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下檢測(cè)1 ng/mL HBs，測(cè)得檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為4．7%，說明該免疫傳感器具有較好的重現(xiàn)性。

以癌癥胚胎抗原（CEA）、鱗狀細(xì)胞癌抗原（SCCA）、葡萄糖、維生素C、前列腺蛋白抗原（PSA）和BSA為干擾物，分別測(cè)定了1 ng/mL HBs溶液中加入100 ng/mL干擾物的電流信號(hào)。結(jié)果顯示，干擾物引起的電流變化小于無干擾物時(shí)電流的5%，說明該免疫傳感器的選擇性良好。

同一組免疫傳感器儲(chǔ)存于4℃的PBS中，每隔5 d測(cè)量并記錄一次電流信號(hào)。20 d后，免疫傳感器的電流信號(hào)變化不大，仍能保持初始電流的95．1%，表明該免疫傳感器具有良好的穩(wěn)定性。

2.7 實(shí)際樣品的分析

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，設(shè)計(jì)的免疫傳感器采用標(biāo)準(zhǔn)加入法檢測(cè)血清樣品中HBs的濃度，并與酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）進(jìn)行比較（見表2）。結(jié)果表明，該方法的回收率為99．8%~100%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=5）為1．1%~1．5%，表明該免疫傳感器可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

表2 實(shí)際樣品中HBs的檢測(cè)Table 2 The detection of HBs in serum sample

3 結(jié)論

本文以GS-SnO2-Au為基底，Pt@CuO-MWCNTs為標(biāo)記物，構(gòu)建了一種夾心型電化學(xué)免疫傳感器用于HBs的靈敏檢測(cè)。GS-SnO2-Au可有效固定捕獲抗體，Pt@CuO-MWCNTs的協(xié)同放大催化作用提高了檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度，增強(qiáng)了免疫傳感器的靈敏度。該方法的檢測(cè)線性范圍寬、檢出限低，且重現(xiàn)性、選擇性及穩(wěn)定性良好，具有廣闊的應(yīng)用前景。