寫字機器人繪制紙基微流控芯片便攜檢測Ca2+

劉 旭，高國偉，胡敬芳，張開宇，李延生*

（1．北京信息科技大學 傳感器實驗室，北京 100101；2．北京信息科技大學 現代測控技術教育部重點實驗室，北京 100192；3．中國科學院上海微系統(tǒng)與信息技術研究所 傳感技術聯(lián)合國家重點實驗室，上海 200050）

紙基微流控芯片是一種以紙張為基底材料的微流控芯片，憑借纖維素紙?zhí)烊欢嗫椎慕Y構和親水性，樣品通過毛細作用輸運便可以實現復雜的生物化學分析，具有成本低廉、操作簡單、安全便攜等優(yōu)勢，受到了廣大科研人員的關注［1-5］。常用的紙基微流控芯片制備方法有光刻法、噴墨打印法、噴蠟打印法、等離子體處理法、切割法等［6-10］。Xiong研究團隊［11］利用光刻法制備微流通道，通過顯色反應實現了對鐵（Ⅲ）、鎳（Ⅱ）和牛血清白蛋白的檢測。光刻技術制備紙基微流控芯片具有分辨率高的優(yōu)勢，但該設備價格高昂，不利于紙基微流控芯片的商品化進程。因此，商業(yè)打印設備正逐漸取代專業(yè)昂貴的光刻設備用于紙基微流控芯片的制作［12-14］。Shibata等［15］通過噴墨打印技術將離子載體摻雜的離子選擇性光電納米球應用于紙張表面，實現了Ca2+的定量檢測。Mentele課題組［16］通過噴蠟打印在紙基微流控芯片上制備控制液體流動的三維疏水屏障，實現對鐵、銅和鎳的檢測。商業(yè)打印裝置有助于實現紙基微流控芯片的普適化制備，為經費不寬裕的實驗室以及欠發(fā)達地區(qū)提供了研究和生產紙基微流控芯片的可能［17-20］。

寫字機器人是一種高科技自動化設備，可實現多種字體的書寫以及復雜圖案的繪制，具有價格低廉、操作簡單、寬幅制備的特點，為紙基微流控芯片的普適化制備提供了相應的設備［21-22］。智能水凝膠是一種比表面積大、生物相容性好、受外界刺激敏感度高的新型敏感材料，在生物醫(yī)藥、生化檢測等領域受到了廣泛關注［23-25］。本文利用智能水凝膠的特點和優(yōu)勢，以Ca2+為靶標對象，借助寫字機器人制備了紙基微流控芯片。以纖維素層析紙作為實驗基底，借助寫字機器人繪制了海藻酸鈉水凝膠的智能閥門結構作為紙基微流控芯片的敏感區(qū)域，而后對紙張進行切割、封裝，完成紙基微流控芯片的制備。水溶性的海藻酸鈉結合Ca2+后變成不溶于水的海藻酸鈣，通過檢測溶液在紙帶上的流速可實現Ca2+的準確測量。該紙基微流控芯片制備成本低廉、操作方便、可一次性制備多條紙帶，為紙基微流控芯片的普適化制作提供了一種新的研究思路。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

海藻酸鈉（分析純，上海Sigma-Aldrich公司），CaO（分析純，昌邑市隆坤建材有限公司），Whatman1級色譜層析紙3001-861（英國Whatman公司）。實驗用水為除氧純凈水（自制）。

CZ6890A工程結構寫字機器人（淳真旗艦店），TopPette移液槍（北京大龍興創(chuàng)實驗儀器股份公司），FA2204N電子天平（上?？茣钥茖W儀器有限公司），HC-110臺式恒溫混勻儀（杭州佑寧儀器有限公司），LGJ-10真空冷凍干燥機（北京松源華興科技發(fā)展有限公司），101-4真空干燥箱（紹興市蘇珀儀器有限公司），1/16 peek魯爾接頭（北京儀佳科技有限公司），四氟毛細管（中山市拓鴻橡塑科技有限公司），27 G（0．21 mm）、30 G（0．16 mm）、32 G（0．06 mm）的點膠針頭（蘭撥萬智能點膠科技有限公司），GDQZ330電動切紙刀（北京金典高科科技有限公司），古德092T加熱層壓機（古德辦公旗艦店），ILX506 CCD線性傳感器（日本Sony公司）。

1.2 水凝膠閥門紙基微流控芯片的制作

1.2.1 水凝膠閥門的制備將0．8 g海藻酸鈉粉末加至39．2 g去氧水中，90℃恒溫振蕩12 h，制得質量分數為2%的海藻酸鈉溶液。將制備的海藻酸鈉溶液開蓋放置于真空干燥箱，抽真空去氧1 h后獲得無氧海藻酸鈉溶液（后續(xù)實驗所用海藻酸鈉溶液均為無氧溶液）。將海藻酸鈉溶液吸入2 mL的針筒中，通過寫字機器人在層析紙上制備海藻酸鈉條帶。完成一條海藻酸鈉區(qū)域條帶的繪制后，將含有海藻酸鈉條帶的層析紙放入真空冷凍干燥機中12 h進行凍干，由于單條海藻酸鈉閥門阻擋溶液的成功率較低，適量增加閥門數量可提高阻擋效果，以擬合更準確的工作曲線。在距離第一條水凝膠閥門2．5 mm處繪制第二條海藻酸鈉區(qū)域條帶（設置2．5 mm的間隔可有效防止新的水凝膠閥門和第一條水凝膠閥門重合），制備具有雙閥門的紙基微流控芯片。繪制完畢后，進行凍干處理，凍干后的產品放在4℃冰箱中密封保存。

1.2.2 紙基微流控芯片的制備繪制具有水凝膠閥門的紙帶后，使用Golden GD-QZ330電動切紙刀將20 cm×20 cm的Whatman1級色譜層析紙切成2 mm寬的紙帶，在紙帶正反面和側面涂抹白蠟并加熱1 min后，將覆蓋膜、紙帶、底膜組裝在一起。通過加熱層壓機（軋制速度設為“1”檔，溫度為100℃）將聚酯薄膜加熱后與紙帶粘在一起。

1.3 紙基微流控芯片性能測試

將制備的紙基微流控芯片進行易用性和重現性分析，分別以0．01、0．1、1、10、30、50 mmol/L Ca2+溶液進行檢測，每個濃度平行測定5次，結果取均值，以Ca2+濃度的對數為橫坐標，溶液流過的時間為縱坐標，擬合工作曲線函數。

2 結果與討論

2.1 寫字機器人制備紙基微流控芯片的工藝

寫字機器人是一種智能仿生機器人，具有精度高、操作簡單、價格低廉等特點［26］。在使用寫字機器人繪制閥門時，其制備過程示意圖如圖1A所示，將針筒固定在微流泵上以實現溶液的勻速流出，將點膠針頭固定在魯爾公接頭上，然后用四氟毛細管將魯爾公接頭與2 mL的針筒連接，將點膠針頭固定在寫字機器人的懸臂上（圖1B）。將層析紙放置在磁吸底板上用磁鐵進行固定后，通過計算機軟件控制寫字機器人機械懸臂，將點膠針頭和層析紙的距離控制在1 mm左右，確保其結構的重現性和一致性。寫字機器人的精度（表示位置準確和筆畫仿真的精確程度）為0．05 mm，該精度表明在制備過程中懸臂的移動具有很好的穩(wěn)定性以及繪制的水凝膠閥門具有較高的分辨率。同時其懸臂的移動距離足夠長，能夠達到30 cm，因此可以在同一批水凝膠閥門制備完成后一次性產生多條紙基微流控芯片。實驗優(yōu)化了溶液流速、移動速度、點膠針頭尺寸等參數對條帶質量的影響，表明批間差異性可得到控制。最后，本文采用了一種類似制作身份證的方式，對繪制完成的紙帶進行裁剪（圖1C），并使用軋輥復合機生產層壓紙的方式進行紙基微流控芯片的封裝。選取聚酯薄膜作為覆蓋膜，且紙帶尺寸需小于聚酯薄膜和底膜，使覆蓋膜和底膜粘合達到密封保護的作用，制備完成后的成品如圖1D所示。

圖1 寫字機器人涂寫示意圖（A），寫字機器人懸臂實物圖（B），紙基微流控芯片制作工藝示意圖（C），及紙基微流控芯片成品（D）Fig．1 Sketch drawings by writing robot（A），physical picture of the cantilever of the writing robot（B），schematic diagram of paper-based microfluidic chip manufacturing process（C），and finished paper-based microfluidic chip（D）

2.2 紙基微流控芯片制備工藝的優(yōu)化

由于高濃度的海藻酸鈉溶液水分少，繪制時間過長會導致已繪制完畢的海藻酸鈉區(qū)域中的水分自然蒸發(fā)，從而破壞紙基微流控芯片結構。為縮短繪制時間，對寫字機器人懸臂的移動速度以及微流泵的溶液流速進行優(yōu)化。以移動速度15．58 mm/min，溶液流速250 μL/min為基礎速度，考察了移動速度和流速成倍增加32 G、27 G、30 G三種點膠針頭的實驗效果。結果顯示，當溶液流速為基礎速度的5倍時，繪制的水凝膠閥門不會被風干，可以實現凍干操作。因此，在5倍溶液流速下，對比考察了10倍、5倍、4倍移動速度的影響。結果顯示32 G點膠針頭繪制的海藻酸鈉區(qū)域不連續(xù)（圖2A）；27 G點膠針頭因出液量太大而無法控制形狀（圖2B）；30 G點膠針頭只有在4倍移動速度下繪制的海藻酸鈉區(qū)域明顯且連續(xù)（圖2C）。因此，實驗選定4倍移動速度和5倍溶液流速的30 G點膠針頭繪制閥門。

圖2 5倍溶液流速下，32 G點膠針頭（A）、27 G點膠針頭（B）、30 G點膠針頭（C）在不同移動速度下的繪制效果圖Fig．2 Renderings of 32 G dispensing needle（A），27 G dispensing needle（B），30 G dispensing needle（C）with 5 times solution flow rate at different moving speeds moving speed（a-c）：10，5，4 times

2.3 紙基微流控芯片的工作原理

使用紙基微流控芯片時，需將芯片的前后端剪開，以確保液體順利通過紙基微流控芯片（圖3A）。紙基微流控芯片的檢測效果如圖3B所示，當溶液中含Ca2+時，液體的流速變快，芯片通道中溶液流動的速度增快，這是由于海藻酸鈉和Ca2+結合形成凝膠小球，降低了溶液黏度所致（圖3C）。當溶液不含Ca2+時，溶液流速受到水凝膠閥門的阻擋而變慢。因此，在相同時間內，含有Ca2+溶液的實驗組比對照組流速更快。

圖3 紙基微流控芯片示意圖（A），紙基微流控芯片工作原理的宏觀示意圖（B）及微觀示意圖（C）Fig．3 Schematic diagram of paper-based microfluidic chip（A），macroscopic schematic diagram（B）and microscopic schematic diagram（C）of the working principle of paper-based microfluidic chip

2.4 水凝膠紙基微流控芯片的性能分析

2.4.1 不同濃度鈣離子擬合工作曲線分析為了考察寫字機器人制備的紙基微流控芯片的準確性，采用紙基微流控芯片對不同濃度的Ca2+溶液進行檢測。如圖4所示，接觸待測溶液后，液體會按照紙基微流控芯片的通道流動，盡管流動距離相同，但不同濃度Ca2+溶液所需的時間不同。為減少毛細作用對實驗結果的影響，需考察最佳的流動距離。本文選取不同濃度的Ca2+溶液，分別對流經1、2、3、4 cm處所需的時間進行統(tǒng)計，取5次平行試驗的均值。結果顯示，在水凝膠雙閥門的阻擋下，溶液流經紙基微流控芯片不同距離所用的時間與Ca2+濃度的對數均呈指數函數關系，其在1、2、3、4 cm處的相關系數分別為0．992 1、0．993 8、0．973 4、0．855 5（見圖5）。由于相關系數越接近1，回歸模型的擬合效果越好，因此以2 cm處時間和Ca2+溶液濃度對數的指數函數相關性最佳，其擬合函數為：1．977 7，相關系數為0．993 8，利用該紙基微流控芯片可實現不同濃度（0．1~50 mmol/L）Ca2+溶液的定量檢測。

圖4 50 mmol/L Ca2+溶液在紙基微流控芯片上的流動距離實物圖Fig．4 Flow distance of 50 mmol/L Ca2+solution on paper-based microfluidic chip

圖5 溶液流經紙基微流控芯片不同距離處所用時間與Ca2+濃度的對數關系Fig．5 Relationship between solution flow time and logarithm of Ca2+concentration at different distances of paper chip distance of paper chip（A-D）：1，2，3，4 cm

2.4.2 易用性與重現性分析為驗證紙基微流控芯片的易用性和重現性，招募10名志愿者對10 mmol/L Ca2+溶液進行10次獨立檢測，得到相對標準偏差（RSD）為3．8%（圖6A），說明該紙基微流控芯片操作簡單，使用較為方便。對同一批次的樣品（10 mmol/L Ca2+溶液）進行10次平行檢測，其相對標準偏差為3．1%（圖6B），說明該紙基微流控芯片具有較好的重現性。

圖6 10名志愿者操作紙基微流控芯片（A），及10個同一批次制備的紙基微流控芯片（B）對10 mmol/L Ca2+溶液的檢測結果Fig．6 Test results of 10 mmol/L Ca2+solution with paper-based microfluidic chip operated by 10 laboratory volunteers（A）and 10 paper-based microfluidic chips prepared in the same batch（B）

2.4.3 顯示設備的優(yōu)化為實現紙基微流控芯片測量結果的自動讀取，進行了數字顯示部分的設計。如圖7A所示，將紙基微流控芯片放置于線性傳感器檢測平臺，芯片前端浸入待測溶液，根據紙帶陰影中不同光強部分的長度可實現對溶液流過距離的檢測。首先，感光元件選擇ILX506線性傳感器，對最小系統(tǒng)PCB進行焊接（圖7B）。其次，系統(tǒng)的主要控制單元選擇STM32F103CBT6為線性傳感器提供外部時鐘和中斷，以獲取實時數據以及向上位機發(fā)送處理好的數據。為獲得控制單元所需的3．3 V電壓，電源選用LM7805穩(wěn)壓芯片將9 V電壓轉換為5 V，然后使用LM1117IMPX-5．0將5 V的電壓穩(wěn)壓到3．3 V。對于顯示模塊部分，則采用分辨率高、體積小、功耗低的液晶12864模塊。

圖7 線性傳感器檢測Ca2+濃度示意圖（A），及ILX506最小系統(tǒng)PCB與焊接完原器件的PCB（B）Fig．7 Schematic diagram of linear sensor for detection of Ca2+concentration（A），and ILX506 minimum system PCB and PCB welded to the original device（B）

系統(tǒng)軟件設計部分采用操作便捷、運行速度快、功能強大的C語言編寫。在每個循環(huán)周期中，傳感器經過對光信號的采樣，將光信號轉變?yōu)殡妷盒盘枺汚/D轉換進行信號處理后輸入單片機，數據檢測結果如圖8A所示。最后，設計了用戶操作流程以及上位機通訊系統(tǒng)，采用線性CCD調試助手完成通信處理的同時將數據繪制成圖像（圖8B）。

圖8 數字顯示結果（A）及上位機窗口顯示界面（B）Fig．8 Digital display of results（A）and display interface of the upper machine window（B）

3 結論

本文借助寫字機器人在纖維素層析紙上成功繪制出紙基微流控芯片的水凝膠閥門，并對其進行切割和封裝。研究表明，寫字機器人繪制出的海藻酸鈉水凝膠閥門可實現0．1~50 mmol/L Ca2+溶液的定量檢測，同時也驗證了該紙基微流控芯片具有很好的易用性和重現性。在此基礎上，本文采用ILX506 CCD傳感器完成了數字顯示裝置的制作，實現了紙基微流控芯片“樣本進、結果出”的檢測效果。該方法為紙基微流控芯片的普適化制備提供了新的研究思路。