基于Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法與質(zhì)量綜合評價(jià)優(yōu)化葛根芩連湯煎煮工藝

徐蓓蕾，韓曉宇，劉晶晶，張文君，孫志偉，胡 揚(yáng)，綦 崢，楊雪晶，孫文斌，楊娜娜，李文蘭*

基于Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法與質(zhì)量綜合評價(jià)優(yōu)化葛根芩連湯煎煮工藝

徐蓓蕾1, 2, 3，韓曉宇1，劉晶晶4，張文君1, 2, 3，孫志偉1, 2, 3，胡 揚(yáng)1, 2, 3，綦 崢1, 2, 3，楊雪晶1, 2, 3，孫文斌1，楊娜娜1，李文蘭1, 2, 3*

1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076 2. 抗腫瘤天然藥物教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076 3. 黑龍江省預(yù)防與治療老年性疾病藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150076 4. 中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

優(yōu)化和科學(xué)評價(jià)葛根芩連湯（Gegen Qinlian Decoction，GQD）的煎煮工藝，為其經(jīng)典方劑中藥復(fù)方制劑的研究與開發(fā)奠定基礎(chǔ)以及提供參考。以指紋圖譜概貌結(jié)合多指標(biāo)定量為綜合評價(jià)，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法對加水量、浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。指紋圖譜研究采用Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水溶液（梯度洗脫），體積流量為0.3 mL/min，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為1 μL；采用電噴霧離子源，以正、負(fù)離子模式檢測，在質(zhì)荷比（/）50～1200進(jìn)行掃描，建立29批GQD指紋圖譜并對共有峰進(jìn)行指認(rèn)。對圖譜信息進(jìn)行主成分分析，建立UPLC多波長檢測方法測定木蘭花堿、葛根素、藥根堿、巴馬汀、黃芩苷、大豆苷元、黃芩素、甘草苷8個(gè)成分含量，計(jì)算各樣品綜合得分，優(yōu)化煎煮工藝。建立了29個(gè)試驗(yàn)號GQD樣品的UPLC-Q-TOF-MS正、負(fù)離子模式下指紋圖譜。正、負(fù)離子模式下分別有共有峰23、19個(gè)，并對其進(jìn)行指認(rèn)，指認(rèn)出葛根素、大豆苷元、黃芩素、黃芩苷、巴馬汀、藥根堿、木蘭花堿、甘草苷、甘草次酸、大豆苷、異甘草苷、漢黃芩苷、漢黃芩素、甘草酸、glyasperins D、甘草醇、綠原酸、韌黃芩素II。對共有峰中8個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行含量測定，以計(jì)算綜合得分，綜合得分結(jié)果顯示，26號工藝為最佳工藝。最終確定GQD最佳煎煮工藝為加10倍量水，浸泡0.5 h，煎煮3次，每次0.5 h。所得出的GQD最佳煎煮工藝主要成分溶出率高，穩(wěn)定可行，可為經(jīng)典方劑GQD復(fù)方制劑的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供一定的依據(jù)。

葛根芩連湯；指紋圖譜；Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法；煎煮工藝；UPLC-Q-TOF-MS；葛根素；大豆苷元；黃芩素；黃芩苷；巴馬汀；藥根堿；木蘭花堿；甘草苷；甘草次酸；大豆苷；異甘草苷；漢黃芩苷；漢黃芩素；甘草酸；glyasperins D；甘草醇；綠原酸；韌黃芩素II

葛根芩連湯（Gegen Qinlian Decoction，GQD）始載于張仲景《傷寒論》，由葛根、黃芩、黃連、甘草4味中藥組成，葛根為君藥，歸脾胃經(jīng)，解表退熱散邪、養(yǎng)陰生津；黃芩、黃連為臣藥，入大腸經(jīng)，清泄胃腸里熱、解毒燥濕；炙甘草甘緩和中，調(diào)佐諸藥。本方以清熱堅(jiān)陰止利為主，兼以透表，為解表清里之劑，用于治療太陽表邪內(nèi)陷所致熱下利證，是表里雙解的經(jīng)典方劑[1-2]。臨床常用來治療急性腸炎、細(xì)菌性痢疾、阿米巴痢疾、小兒輪狀病毒性腸炎等，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明GQD具有抗炎、抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等藥理作用[3-6]。課題組前期針對其治療潰瘍性結(jié)腸炎、相關(guān)結(jié)腸癌的作用機(jī)制以及藥效物質(zhì)進(jìn)行了大量研究[7-10]。在經(jīng)典名方研究的大背景下，有必要對該方的煎煮工藝進(jìn)行進(jìn)一步深入探究。歷代本草及文獻(xiàn)報(bào)道中對于GQD煎煮工藝有過記述，葛根半斤，黃芩3兩，黃連3兩，炙甘草2兩，以上4味，以水8升，先煎煮葛根，減2升，內(nèi)諸藥，煮取2升，去滓，分溫再服。古方記述基本確定了該方現(xiàn)代提取工藝的部分參數(shù)，經(jīng)典方劑應(yīng)遵循古方原則，而在實(shí)際生產(chǎn)過程中，提取容器、火力大小、提取、濃縮、干燥等因素皆會(huì)影響提取工藝，從而導(dǎo)致質(zhì)量差異，因此，如何保證現(xiàn)代生產(chǎn)工藝與古方傳統(tǒng)工藝產(chǎn)品質(zhì)量的一致性，是經(jīng)典名方研究成功的重點(diǎn)和難點(diǎn)問題，對于臨床復(fù)方制劑質(zhì)量具有重要意義[11]。

Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法（Box-Behnken design-response surface methodology，BBD-RSM）是近年來廣泛應(yīng)用的多實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化的方法，通過建立多元回歸方程擬合因素和效應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，以尋求最佳提取工藝參數(shù)[12-13]。中藥復(fù)方是復(fù)雜的混合物體系，UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)將UPLC對多組分樣品的高分離能力與質(zhì)譜高分辨率、高靈敏度的優(yōu)勢相結(jié)合，且能提供化合物的元素組成及離子碎片信息等特點(diǎn)，能夠全面反映中藥成分[14-15]，結(jié)合現(xiàn)代數(shù)理分析技術(shù)可更加全面地優(yōu)化中藥復(fù)方提取工藝。因此，本研究在BBD-RSM設(shè)計(jì)基礎(chǔ)上，結(jié)合UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)，以指紋圖譜概貌、共有峰指認(rèn)及含量測定結(jié)果為評價(jià)指標(biāo)，對GQD煎煮工藝進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化，可為后續(xù)中藥經(jīng)典方劑GQD研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

G7116B 6546 LC/Q-TOF型安捷倫液相色譜，安捷倫科技（中國）有限公司；SK3310HP型超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；JM型電子分析天平，諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司；001- 00S型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，湖南蘭思儀器有限公司；TopPette型手動(dòng)單道可調(diào)移液器，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司；HI1210型水浴鍋，德國Leica公司。

1.2 飲片

葛根（批號1901002，產(chǎn)地陜西）、黃芩（批號19030405，產(chǎn)地安徽）、黃連（批號19031603，產(chǎn)地四川）、甘草（批號20211222，產(chǎn)地甘肅）中藥飲片均購買于哈爾濱三棵樹藥材市場，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院中藥學(xué)專業(yè)金哲雄教授鑒定，葛根為豆科葛屬植物野葛(Willd.) Ohwi的干燥根，黃芩為唇形科黃芩屬植物黃芩Georgi的干燥根，黃連為毛茛科黃連屬植物黃連Franch.的干燥根莖，炙甘草為豆科甘草屬植物甘草Fisch.的干燥根及根莖經(jīng)蜜炙的炮制加工品，以上飲片均符合《中國藥典》2020年版要求。

1.3 對照品及試劑

對照品葛根素（批號111025）、大豆苷元（批號wkq16080304）、黃芩素（批號wkq16011504）、黃芩苷（批號wkq16070503）、巴馬?。ㄅ杦kq19042309）、藥根堿（批號wkq19022113）、木蘭花堿（批號140525）、甘草苷（批號wkq16071504）均來自中國食品藥品檢定研究院；屈臣氏蒸餾水，廣州屈臣氏食品飲料有限公司；甲醇（批號20220831）、乙腈（批號20220731），色譜級，德國默克公司；甲酸，批號202674，質(zhì)譜級，美國Fisher公司；娃哈哈純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備

分別精密稱定適量的葛根素、大豆苷元、黃芩苷、黃芩素、巴馬汀、藥根堿、木蘭花堿、甘草苷對照品，加入甲醇定容到10 mL，溶解制成質(zhì)量濃度分別為1.8、2.5、1.5、1.5、1.8、0.8、1.0、0.3 mg/mL的混合對照品儲(chǔ)備母液。0.22 μm微孔濾膜濾過，4 ℃避光保存，備用。

2.2 供試品溶液制備

遵循古方《傷寒論》中GQD的用法用量，參照《中國藥典》2020年版一部葛根芩連片、葛根芩連丸的藥物組成及比例，確定GQD中葛根、黃芩、黃連、炙甘草的藥味比例為8∶3∶3∶2。分別稱取符合藥典標(biāo)準(zhǔn)的葛根8 g、黃芩3 g、黃連3 g、炙甘草2 g，各試驗(yàn)號樣品按表1因素水平進(jìn)行煎煮，濾過藥渣，合并濾液，濃縮至浸膏狀，用甲醇復(fù)溶定容到20 mL，4000 r/min離心（離心半徑為6.21 cm）15 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.3 BBD-RSM因素和水平設(shè)計(jì)

課題組前期以總黃酮及總生物堿的提取率為測定指標(biāo)，分別對加水量、浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1～4。在此基礎(chǔ)上，選取加水量（1）、浸泡時(shí)間（2）、煎煮時(shí)間（3）、煎煮次數(shù)（4）為考察因素，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)，所得因素水平見表5，共得到29個(gè)試驗(yàn)樣品。

表1 加水量對GQD煎煮工藝的影響

表2 浸泡時(shí)間對GQD煎煮工藝的影響

表3 煎煮時(shí)間對GQD煎煮工藝的影響

表4 煎煮次數(shù)對GQD煎煮工藝的影響

2.4 UPLC-Q-TOF-MS指紋圖譜的建立

2.4.1 色譜條件 采用Waters Acquity UPLC?BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；保護(hù)柱Waters Acquity UPLC?BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脫：0 min，5%乙腈；0～5 min，5%～10%乙腈；5～10 min，10%～12%乙腈；10～17 min，12%～22%乙腈；17～20 min，22%～29%乙腈；20～25 min，29%～80%乙腈；25～27 min，80%～95%乙腈；27～28 min，95%乙腈；體積流量0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

表5 GQD煎煮工藝響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)

2.4.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源（ESI）；采用正、負(fù)離子采集模式；毛細(xì)管電壓3 kV，霧化器氣體650 kPa（6.5 bar），錐形電壓35 kV，錐形氣體積流量50 L/h，去溶劑氣溫度350 ℃，去溶劑氣體積流量700 L/h，源溫度180 ℃。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 稱取試驗(yàn)號17樣品，按照“2.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄譜圖，選擇出峰較穩(wěn)定、響應(yīng)值較高、峰面積較大的藥根堿為參照峰，各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD分別小于2.00%、2.17%，表明本方法精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 稱取試驗(yàn)號17樣品，按照“2.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測，分別于0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣，記錄譜圖。選擇出峰較穩(wěn)定、響應(yīng)值較高、峰面積較大的藥根堿為參照峰，各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD分別小于1.97%、2.00%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 平行制備試驗(yàn)號17樣品6份，按照“2.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，分別按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測，記錄譜圖。選擇出峰較穩(wěn)定、響應(yīng)值較高、峰面積較大的藥根堿為參照峰，各共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD分別小于2.26%、2.83%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.6 指紋圖譜分析 分別稱取29個(gè)試驗(yàn)號樣品，按照“2.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，分別按照“2.4.1”“2.4.2”項(xiàng)下色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測，得到29個(gè)試驗(yàn)號樣品UPLC-Q-TOF-MS正、負(fù)離子模式下總離子流圖（total ion chromatogram，TIC），見圖1、2。將譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004A版”進(jìn)行分析。分別確定了正、負(fù)離子模式下出峰明顯、重復(fù)性良好、保留時(shí)間穩(wěn)定的共有峰23、19個(gè)（R為對照圖譜），依據(jù)相對分子質(zhì)量、主要離子碎片等信息對共有峰進(jìn)行指認(rèn)，指認(rèn)結(jié)果如表6所示。

2.4.7 主成分分析（principal component analysis，PCA） 將GQD樣品正、負(fù)離子模式下指紋圖譜的共有峰峰面積分別導(dǎo)入SPSS 20.0軟件，進(jìn)行PCA，正離子模式下PCA結(jié)果見表7和圖3-A；負(fù)離子模式下PCA結(jié)果見表8和圖3-B。主成分特征值、累積方差貢獻(xiàn)率以特征值＞1為提取標(biāo)準(zhǔn)，正離子模式下共提取出8個(gè)主成分，得到主成分的累積方差貢獻(xiàn)率78.57%；負(fù)離子模式下共提取出5個(gè)主成分，得到主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為72.611%；能夠代表樣品中成分的大部分信息。

從表9中可以看出根據(jù)因子載荷矩陣，在主成分1中，除了1～3、8號色譜峰以外，其余19個(gè)成分的因子載荷非常接近，均是主成分1的重要貢獻(xiàn)成分，說明正離子模式下主成分1很好地表達(dá)了GQD多成分物質(zhì)群。

從表10中可以看出根據(jù)因子載荷矩陣，在主成分1中，除了9、19號色譜峰以外，其余17個(gè)成分的因子載荷非常接近，均是主成分1的重要貢獻(xiàn)成分，說明負(fù)離子模式下主成分1很好地表達(dá)了GQD多成分物質(zhì)群。

2.5 GQD多成分含量測定研究

2.5.1 樣品測定 在共有峰指認(rèn)和PCA的基礎(chǔ)上對29個(gè)試驗(yàn)號樣品中8個(gè)共有成分指認(rèn)并進(jìn)行含量測定。如圖4所示，分別在254 nm（葛根素、大豆苷元）、270 nm（黃芩苷、黃芩素、木蘭花堿、甘草苷）、345 nm（巴馬汀、藥根堿）波長下對相應(yīng)成分進(jìn)行測定。色譜條件同“2.4.1”項(xiàng)下。

圖2 29批GQD樣品疊加圖譜(負(fù)離子模式)

表6 GQD共有峰指認(rèn)結(jié)果

2.5.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.1”項(xiàng)下制備的對照品儲(chǔ)備液，用甲醇通過2倍稀釋法分別稀釋2、4、8、16、32倍，制得各質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，分別按照“2.5.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（）進(jìn)行線性回歸，得各成分的回歸方程分別為木蘭花堿＝32 917＋765.76，＝0.999 0，線性范圍0.071～1.510 mg/mL；葛根素＝18 077＋246.57，＝0.999 3，線性范圍0.020～2.240 mg/mL；藥根堿＝93 737＋1646.8，＝0.999 7，線性范圍0.010～0.150 mg/mL；巴馬?。?0 535－387.09，＝0.999 5，線性范圍0.040～1.370 mg/mL；黃芩苷＝46 102＋2299，＝0.999 3，線性范圍0.020～1.720 mg/mL；大豆苷元＝87 047＋58.59，＝0.999 6，線性范圍0.006～0.600 mg/mL；黃芩素＝50 810＋294.76，＝0.999 3，線性范圍0.004～0.500 mg/mL；甘草苷＝23 347＋2 042.6，＝0.999 2，線性范圍0.060～0.180 mg/mL。

表7 主成分初始特征值和累積方差貢獻(xiàn)率(正離子模式)

圖3 正離子模式(A)和負(fù)離子模式(B)下PCA碎石圖

表8 主成分初始特征值和累積方差貢獻(xiàn)率(負(fù)離子模式)

2.5.3 精密度試驗(yàn) 按試驗(yàn)號17的制備方法制備供試品溶液，按照“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各成分色譜峰峰面積，計(jì)算其RSD。結(jié)果木蘭花堿、葛根素、藥根堿、巴馬汀、黃芩苷、大豆苷元、黃芩素、甘草苷峰面積的RSD分別為1.97%、0.95%、1.64%、1.75%、1.56%、2.15%、1.46%、1.55%，表明儀器精密度良好。

表9 成分得分系數(shù)矩陣(正離子模式)

表10 成分得分系數(shù)矩陣(負(fù)離子模式)

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按試驗(yàn)號17的制備方法制備供試品溶液，室溫放置，分別在制備后0、4、8、12、16、20、24 h時(shí)，按照“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄各成分色譜峰峰面積，計(jì)算其峰面積的RSD。結(jié)果木蘭花堿、葛根素、藥根堿、巴馬汀、黃芩苷、大豆苷元、黃芩素、甘草苷峰面積的RSD分別為1.65%、1.86%、2.41%、2.18%、1.74%、2.55%、1.86%、1.39%，表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 重復(fù)性試驗(yàn) 按試驗(yàn)號17的制備方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄各成分色譜峰峰面積，計(jì)算各組分峰面積的RSD。結(jié)果木蘭花堿、葛根素、藥根堿、巴馬汀、黃芩苷、大豆苷元、黃芩素、甘草苷的峰面積RSD分別為1.45%、1.23%、1.72%、1.63%、1.64%、1.53%、1.28%、1.46%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn) 按試驗(yàn)號17的制備方法制備6份供試品溶液，每份稱取1 mL，分別精密加入8種對照品適量，按照“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄各組分色譜峰峰面積，計(jì)算各成分加樣回收率及其峰面積的RSD。結(jié)果木蘭花堿、葛根素、藥根堿、巴馬汀、黃芩苷、大豆苷元、黃芩素、甘草苷的平均加樣回收率分別為99.2%、99.0%、98.7%、98.6%、99.3%、99.5%、98.5%、99.4%，峰面積RSD分別為1.37%、1.33%、1.47%、1.38%、1.14%、1.5%、1.33%、1.27%。

1-葛根素 2-大豆苷元 3-木蘭花堿 4-甘草苷 5-黃芩素 6-黃芩苷 7-藥根堿 8-巴馬汀 A、C、E分別為254、270、345 nm波長下GQD樣品圖譜 B、D、F分別為254、270、345 nm波長下混合對照品圖譜

2.5.7 多指標(biāo)含量測定評價(jià)結(jié)果 計(jì)算各成分含量測定結(jié)果，并賦予8成分相同權(quán)重（8成分分別為4味藥的核心代表性成分，賦予相同權(quán)重），以綜合評分進(jìn)行評價(jià)[13]，綜合評分＝(1/max＋2/max＋3/max＋4/max＋5/max＋6/max＋7/max＋8/max)/8，如表5所示。綜合得分結(jié)果顯示26號工藝為最佳工藝。

2.6 BBD-RSM回歸模型的建立及分析

采用Design Expert 10軟件，通過響應(yīng)面法進(jìn)行工藝優(yōu)化。分別對各因素水平進(jìn)行多元線性和非線性回歸，建立各指標(biāo)綜合評分（）對4個(gè)因素（1、2、3、4）的回歸方程模型Y＝8.42－1.351－0.282－0.263－1.424－0.0912－0.1013＋0.1114＋0.7123＋0.1024－0.2434＋0.0612＋0.2822＋0.6332＋0.1642，相關(guān)系數(shù)＝0.886 5，校正系數(shù)0.870 4，說明該模型擬合度良好，試驗(yàn)誤差小，可用此模型對綜合評分進(jìn)行分析和預(yù)測。根據(jù)軟件擬合得到回歸方程等高線及響應(yīng)面圖，評價(jià)試驗(yàn)因素之間的交互強(qiáng)度，來確定最佳煎煮工藝參數(shù)。通過等高線的形狀反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓表示交互作用強(qiáng)，圓形則交互作用較弱，結(jié)果見圖5。根據(jù)模型擬合結(jié)果，加水量8.9倍、浸泡時(shí)間0.57 h、煎煮時(shí)間0.81 h、煎煮次數(shù)2.75次。

因此，以本實(shí)驗(yàn)中BBD-RSM設(shè)計(jì)為依據(jù)，整合指紋圖譜、化學(xué)模式識別以及多指標(biāo)含量測定結(jié)果，從煎煮及后續(xù)生產(chǎn)工藝實(shí)際情況出發(fā)，并參考GQD經(jīng)典名方制備工藝，本著成本節(jié)約及最大限度提取有效成分的原則，最終確定GQD最佳工藝為10倍量水、浸泡0.5 h、煎煮0.5 h、煎煮3次。

2.7 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

選擇最佳煎煮工藝條件（加10倍量水，浸泡0.5 h，煎煮3次，每次0.5 h）進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，按上述方法進(jìn)行指紋圖譜和含量測定，計(jì)算得到指紋圖譜相似度分別為0.983、0.992、0.987，3次驗(yàn)證樣品含量測定的綜合得分如表11所示，與最佳工藝所得樣品綜合評分基本吻合，說明優(yōu)化得到的提取工藝條件較為穩(wěn)定可行。

3 討論

提取工藝是中藥復(fù)方藥效物質(zhì)與質(zhì)量控制領(lǐng)域的核心環(huán)節(jié)，優(yōu)化中藥復(fù)方提取工藝參數(shù)，是高效充分提取藥效物質(zhì)，保障臨床有效性的前提，也是影響中藥制劑質(zhì)量的關(guān)鍵因素。古方記載GQD用法為葛根、黃芩、黃連、炙甘草，上四味，以水八升，先煮葛根，減兩升，內(nèi)諸藥，煮取二升，去滓，分溫再服。因現(xiàn)代煎煮工具、條件、技術(shù)手段與古代相去甚遠(yuǎn)，導(dǎo)致現(xiàn)代煎煮工藝與古法記載存在一定差異[11,16]。遵循古方優(yōu)化現(xiàn)代煎煮工藝參數(shù)成為經(jīng)典名方研究的重中之重環(huán)節(jié)。本研究依據(jù)劉昌孝院士提出的“傳承不泥古，創(chuàng)新不離宗，論證以求真”的基本科研精神，參照古籍記載，綜合考慮現(xiàn)代提取工藝的實(shí)際情況，最終優(yōu)化GQD煎煮工藝。模型擬合結(jié)果得到的最佳工藝為加水量8.9倍、浸泡時(shí)間0.57 h、煎煮時(shí)間0.81 h、煎煮次數(shù)2.75次。結(jié)合煎煮工藝的實(shí)際情況以及研究過程中指紋圖譜和化學(xué)模式識別多指標(biāo)含量測定結(jié)果得到并確定GQD最佳工藝。

圖5 4因素對綜合評分的響應(yīng)面圖

表11 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，加水量、浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)對GQD的提取工藝有較大影響，其中煎煮次數(shù)是對復(fù)方提取質(zhì)量影響最大的因素。在此基礎(chǔ)上，本研究采用BBD-RSM設(shè)計(jì)對GQD提取工藝的加水量、浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)合UPLC-Q-TOF-MS指紋圖譜概貌分析與多指標(biāo)成分綜合評價(jià)分析，確定了GQD最佳煎煮工藝。

BBD-RSM設(shè)計(jì)法近年來廣泛應(yīng)用于經(jīng)典中藥復(fù)方提取工藝研究[17-19]，是一種通過建立多元回歸方程擬合因素和效應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系尋求最佳提取工藝參數(shù)的設(shè)計(jì)方法[20]，將響應(yīng)面設(shè)計(jì)法應(yīng)用于古方提取工藝研究相比于正交試驗(yàn)更簡化，相對于均勻設(shè)計(jì)更全面[21]，能夠有效減少試驗(yàn)次數(shù)，操作起來更高效同時(shí)更節(jié)約試驗(yàn)成本。運(yùn)用現(xiàn)代分析技術(shù)UPLC-Q-TOF-MS構(gòu)建中藥復(fù)方GQD的指紋圖譜，方法精密度、穩(wěn)定性良好，并依據(jù)分子量和離子碎片信息等對正、負(fù)離子模式下的共有峰分別進(jìn)行指認(rèn)，可以更加精準(zhǔn)更加全面地反映GQD全成分及主要成分的信息[22-23]?！吨袊幍洹?020年版要求葛根芩連方中只對葛根素、鹽酸小檗堿、黃芩苷3個(gè)成分進(jìn)行定量分析，本實(shí)驗(yàn)建立了GQD不同煎煮工藝指紋圖譜，結(jié)合主成分分析，選擇分離良好，峰形穩(wěn)定，峰面積較大、易于定量的共有峰所對應(yīng)的8個(gè)成分作為指標(biāo)成分定量分析[24-25]，設(shè)計(jì)質(zhì)量綜合評分。

相較于傳統(tǒng)提取工藝在中藥生產(chǎn)過程中的局限性，基于現(xiàn)代設(shè)計(jì)手段的提取工藝研究優(yōu)勢逐漸突顯，在遵古而不泥古的原則下，明顯提高了提取效率，節(jié)約資源，節(jié)省時(shí)間[26-27]，本實(shí)驗(yàn)首次基于BBD-RSM設(shè)計(jì)，結(jié)合UPLC-Q-TOF-MS指紋圖譜概貌分析與多指標(biāo)成分質(zhì)量綜合評價(jià)優(yōu)化GQD最佳現(xiàn)代煎煮工藝，UPLC-Q-TOF-MS能更加準(zhǔn)確全面地從定性角度反映GQD全成分信息，通過共有峰指認(rèn)、主成分分析以及在此基礎(chǔ)上所展開的關(guān)鍵指標(biāo)成分含量測定，做到從“定性”和“定量”2個(gè)角度綜合優(yōu)化GQD煎煮工藝。所得提取工藝縮短了煎煮時(shí)間，簡化操作，有利于藥效物質(zhì)的提取，是GQD更為高效的提取工藝，避免了不必要的中藥資源浪費(fèi)，為經(jīng)典方劑GQD的進(jìn)一步研究與開發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)參考和依據(jù)，為保障臨床藥效奠定基礎(chǔ)[28]。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 任偉光, 郭麗麗, 張翠英. 葛根芩連湯的研究進(jìn)展及質(zhì)量標(biāo)志物的預(yù)測分析 [J]. 中國新藥雜志, 2021, 30(18): 1675-1679.

[2] 陳麗紅, 唐于平, 王強(qiáng). 葛根芩連湯的現(xiàn)代研究進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2010, 41(4): 676-680.

[3] 滕健樣. 葛根芩連湯方證研究 [D]. 北京: 北京中醫(yī)藥大學(xué), 2012.

[4] 劉蓮萱, 吳威, 龐琳琳, 等. 葛根芩連湯化學(xué)成分、藥理作用及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展 [J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2022, 40(3): 147-154.

[5] 曾瀞儀. 基于數(shù)據(jù)挖掘的葛根芩連湯方證研究 [D]. 北京: 北京中醫(yī)藥大學(xué), 2017.

[6] 孫婷, 李新民, 孫丹, 等. 基于整合藥理學(xué)平臺(tái)研究葛根芩連湯治療小兒肺炎的作用機(jī)制 [J]. 藥物評價(jià)研究, 2019, 42(1): 78-83.

[7] 徐蓓蕾, 張貴君, 崔向微, 等. 葛根芩連湯藥效組分抑菌生物效價(jià)測定 [J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2013, 28(1): 230-233.

[8] Xu B L, Zhang G J, Ji Y B. Active components alignment of Gegenqinlian Decoction protects ulcerative colitis by attenuating inflammatory and oxidative stress [J]., 2015, 162: 253-260.

[9] 徐蓓蕾, 吳迪, 楊娜娜, 等. 基于“通路-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)的葛根芩連湯及其指標(biāo)成分組合物干預(yù)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌的作用 [J]. 中草藥, 2020, 51(19): 4991-4998.

[10] Xu B L, Li P Y, Zhang G J. Comparative pharmacokinetics of puerarin, daidzin, baicalin, glycyrrhizic acid, liquiritin, berberine, palmatine and jateorhizine by liquid chromatography-mass spectrometry after oral administration of Gegenqinlian Decoction and active components alignment (ACA) to rats [J]., 2015, 988: 33-44.

[11] 代珊, 李帥, 張愛軍, 等. 基于基準(zhǔn)關(guān)聯(lián)度和AHP-熵權(quán)法綜合評價(jià)經(jīng)典名方小續(xù)命湯古今提取工藝 [J]. 中草藥, 2022, 53(3): 726-734.

[12] 栗煥煥, 毛營營, 張國琴, 等. 響應(yīng)面分析法優(yōu)化吳茱萸提取工藝及多指標(biāo)定量指紋圖譜研究 [J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2020, 35(11): 5716-5720.

[13] 何瑤, 江華娟, 成顏芬, 等. 基于Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法與質(zhì)量綜合評價(jià)優(yōu)化經(jīng)典名方桃紅四物湯煎煮工藝 [J]. 中草藥, 2021, 52(22): 6845-6855.

[14] 陳明曦, 李艷梅, 孫婷, 等. 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在中藥質(zhì)量研究中的應(yīng)用 [J]. 中國藥劑學(xué)雜志, 2021, 19(1): 12-17.

[15] Yu Y, Yao C L, Guo D A. Insight into chemical basis of traditional Chinese medicine based on the state-of-the-art techniques of liquid chromatography-mass spectrometry [J]., 2021, 11(6): 1469-1492.

[16] 文謹(jǐn), 劉起華, 章軍, 等. 葛根芩連湯煮散煎煮工藝優(yōu)化 [J]. 中成藥, 2016, 38(9): 2070-2073.

[17] 王蕊嬌, 張育龍, 董培良, 等. 基于Box-Behnken設(shè)計(jì)和主成分分析法研究當(dāng)歸-苦參藥對的提取工藝及不同比例配伍對急性心肌缺血大鼠的影響 [J]. 中草藥, 2022, 53(12): 3632-3642.

[18] 曾海蓉, 李婷娜, 冉倩, 等. 基于熵權(quán)法結(jié)合Box- Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化桂枝芍藥知母顆粒復(fù)方提取工藝 [J]. 中草藥, 2020, 51(1): 84-90.

[19] 吳振起, 高暢, 楊璐, 等. 基于層次分析法結(jié)合Box- Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)選養(yǎng)陰清肺湯加味提取工藝 [J]. 中草藥, 2019, 50(12): 2862-2867.

[20] 宋佳, 黃飛龍, 段樹卿, 等. Plackett-Burnman設(shè)計(jì)聯(lián)合Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化心神寧片的提取工藝 [J]. 中草藥, 2016, 47(3): 430-435.

[21] 王萍, 王宇鶴, 許剛, 等. 大葉秦艽總環(huán)烯醚萜苷3種提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究 [J]. 中成藥, 2022, 44(8): 2435-2443.

[22] 程斌, 童靜玲, 周愛珍, 等. 基于UPLC-Q-TOF-MS譜-效分析的浙貝母化痰質(zhì)量標(biāo)志物的初步篩選及含量差異研究 [J]. 中國藥學(xué)雜志, 2021, 56(6): 462-471.

[23] 程斌, 周愛珍, 彭昕, 等. 浙貝母UPLC-Q-TOF-MS/ MS指紋圖譜的建立及其抗炎質(zhì)量標(biāo)志物的分析 [J]. 中國藥房, 2020, 31(17): 2129-2135.

[24] 王鈺樂, 劉文, 楊道斌, 等. 葛根芩連湯的UPLC-MS/ MS指紋圖譜研究 [J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2017, 28(2): 206-211.

[25] 吳億晗, 王迪, 楊曉琴, 等. 葛根芩連丸UPLC指紋圖譜建立及7種成分測定 [J]. 中成藥, 2018, 40(5): 1083-1087.

[26] 李丹, 石沁, 張李, 等. 基于逆流動(dòng)態(tài)提取技術(shù)的紅丹通絡(luò)顆粒提取工藝優(yōu)化研究 [J]. 中藥材, 2022, 45(2): 419-421.

[27] 代珊, 李帥, 張愛軍, 等. 基于基準(zhǔn)關(guān)聯(lián)度和AHP-熵權(quán)法綜合評價(jià)經(jīng)典名方小續(xù)命湯古今提取工藝 [J]. 中草藥, 2022, 53(3): 726-734.

[28] 豐茂秀, 楊穎, 溫柔, 等. 經(jīng)方百合知母湯提取工藝優(yōu)化 [J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2021, 39(7): 127-130.

Decocting process of Gegen Qinlian Decoction was optimized based on Box-Behnken design-response surface methodology and comprehensive quality evaluation

XU Bei-lei1, 2, 3, HAN Xiao-yu1, LIU Jing-jing4, ZHANG Wen-jun1, 2, 3, SUN Zhi-wei1, 2, 3, HU Yang1, 2, 3, QI Zheng1, 2, 3, YANG Xue-jing1, 2, 3, SUN Wen-bin1, YANG Na-na1, LI Wen-lan1, 2, 3

1. School of Pharmacy, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China 2. Engineering Research Center of Natural Anti-cancer Drugs, Ministry of Education, Harbin 150076, China 3. Heilongjiang Key Laboratory of Preventive and Therapeutic Drug Research of Senile Diseases, Harbin 150076, China 4. National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China

To optimize and scientifically evaluate the decoction process of Gegen Qinlian Decoction (GQD, 葛根芩連湯) based on Box-Behnken design-response surface methodology in order to lay the foundation and provide reference for the research and development of traditional Chinese medicine compound preparations.Taking fingerprint profile combined with multi-index quantification as the comprehensive evaluation, the amount of water, soaking time, decocting time and decocting times were optimized by Box-Behnken design response surface method. The fingerprint analysis was performed on a Waters Acquity UPLC BEH C18column (100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm) with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% formic acid aqueous solution (gradient elution) at the volume flow of 0.3 mL/min. The column temperature was 35 ℃, and the injection volume was 1 μL. The fingerprints of 29 batches of GQD were established by scanning in the range of mass charge ratio (/) of 50—1200 with ESI source and detected in positive and negative ion modes, and common peaks were identified. The principal components were analyzed, and contents of 8 main components, including magnoflorine, puerarin, jatrorrhizine, palmatine, baicalin, daidzein, baicalein and liquiritin were determined by UPLC multi-wavelength detection method. And the comprehensive score of each sample was calculated to optimize the decoction process..The UPLC-Q-TOF-MS fingerprints of 29 test number of GQD samples were established in positive and negative ion mode. There were 23 and 19 common peaks in positive and negative ion mode respectively, and 18 components of them were identified, including puerarin, daidzein, baicalein, baicalin, palmatine, jatrorrhizine, magnoflorine, liquiritin, glycyrrhetinic acid, daidzin, isoliquiritin, wogonoside, wogonin, glycyrrhizic acid, glyasperins D, glycyrol, chlorogenic acid and tenaxin II. The content of eight index components of the common peaks was determined to calculate the comprehensive score, and the comprehensive score results showed that test number 26 was the optimal preparation process condition. Finally, the best decoction process for GQD was determined as follows, 10 times amount of water, soaking for 0.5 h, decocting for 3 times, and each time for 0.5 h.The optimal decoction technology with high dissolution rate of main components obtained by this experiment was stable and feasible, which could provide a certain basis for further research and development of the classical prescription compound preparation of GQD.

Gegen Qinlian Decoction; fingerprints; Box-Behnken design-response surface methodology; decoction technology; UPLC-Q-TOF-MS; puerarin; daidzein; baicalein; baicalin; palmatine; jatrorrhizine; magnoflorine; liquiritin; glycyrrhetinic acid; daidzin; isoliquiritin; wogonoside; wogonin; glycyrrhizic acid; glyasperins D; glycyrol; chlorogenic acid; tenaxin II

R283.6

A

0253 - 2670(2022)22 - 7070 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.22.010

2022-06-15

黑龍江省自然科學(xué)基金聯(lián)合指導(dǎo)計(jì)劃（LH2020H069）；哈爾濱商業(yè)大學(xué)青年學(xué)術(shù)骨干支持計(jì)劃（2020CX12）

徐蓓蕾（1983—），女，博士，副教授，主要研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)與質(zhì)量評價(jià)研究。Tel: 15124515866 E-mail: xubeilei2006@163.com

李文蘭（1967—），女，博士，教授/院長，主要研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)與質(zhì)量評價(jià)研究。Tel: 13936169153 E-mail: lwldzd@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]