芍藥苷通過調(diào)控腸道菌群改善α-異硫氰酸酯誘導(dǎo)膽汁淤積大鼠的作用機制研究

吳和霏，章方玲，鄧昕雨，李煜兵，陳 沅，胡啟超，馬 驍*，趙艷玲

? 藥理與臨床 ?

芍藥苷通過調(diào)控腸道菌群改善α-異硫氰酸酯誘導(dǎo)膽汁淤積大鼠的作用機制研究

吳和霏1，章方玲1，鄧昕雨1，李煜兵1，陳 沅1，胡啟超1，馬 驍1*，趙艷玲2*

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137 2. 解放軍總醫(yī)院醫(yī)療保障中心 藥劑科，北京 100037

確證芍藥苷對α-異硫氰酸酯（α-isothiocyanate，ANIT）誘導(dǎo)膽汁淤積大鼠的藥效作用，通過16S rRNA技術(shù)探究芍藥苷對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用機制。SD大鼠隨機分為對照組、模型組及芍藥苷高、中、低劑量（200、100、50 mg/kg）組和熊去氧膽酸（60 mg/kg）組，每組10只。給予藥物干預(yù)7 d，第4天ig ANIT（60 mg/kg）誘導(dǎo)膽汁淤積模型。測定膽汁體積流量；檢測血清中血清中天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，γ-GT）活性及總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBIL）、總膽汁酸（total bile acid，TBA）水平；采用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察肝臟組織病理變化；收集大鼠腸內(nèi)容物進(jìn)行腸道菌群測序，探索芍藥苷對腸道菌群的影響。與模型組比較，芍藥苷有效改善膽汁體積流量（＜0.05），顯著下調(diào)大鼠血清中肝功能指標(biāo)AST、ALT、γ-GT活性及膽汁淤積指標(biāo)TBIL、DBIL、TBA水平（＜0.01），改善肝細(xì)胞損傷。腸道菌群測序結(jié)果可知，芍藥苷顯著上調(diào)厚壁菌門與擬桿菌門比值及異桿菌屬、布勞特氏菌屬豐度（＜0.05），降低顫螺菌屬、瘤胃球菌屬豐度（＜0.05、0.01）。芍藥苷可能通過改善ANIT誘導(dǎo)的膽汁淤積大鼠腸道菌群失調(diào)，從而發(fā)揮對膽汁淤積肝損傷的改善作用。

芍藥苷；α-異硫氰酸酯；膽汁淤積；藥效；16S rRNA；腸道菌群

膽汁淤積肝臟疾病是一種因各種內(nèi)外原因，導(dǎo)致有毒膽汁酸過度積累或膽汁流量改變，膽管和肝細(xì)胞受損的肝臟疾病，膽汁淤積本身也會進(jìn)一步加重肝臟的損害[1]。據(jù)統(tǒng)計，我國慢性肝病住院患者膽汁淤積肝臟疾病的發(fā)生率高達(dá)10.26%，在原發(fā)硬化性膽管炎患者中發(fā)生率高達(dá)75%，肝硬化中可達(dá)47.76%[2]。在膽汁淤積疾病過程中，膽汁酸是膽汁的重要成分，約占膽汁固體成分的85%，膽汁酸在肝臟合成后，進(jìn)入膽管分泌到膽囊，后進(jìn)入小腸參與食物消化，最后大部分膽汁酸在回腸末端重新吸收，通過門靜脈返回肝臟，另有5%的膽汁酸通過糞便排出[3]，這個過程為膽汁酸的肝腸循環(huán)。因此，任何造成膽汁酸平衡失調(diào)的因素都能導(dǎo)致膽汁淤積的形成。膽汁酸通過肝腸循環(huán)將腸道與肝臟連接起來，腸道菌群可調(diào)節(jié)經(jīng)肝臟合成排入腸道的膽汁酸，同時腸道菌群的結(jié)構(gòu)和分布又受膽汁酸的影響。

腸道菌群失調(diào)與膽汁淤積性肝病密切相關(guān)[4]，由于肝臟和腸道經(jīng)膽管、門靜脈和體循環(huán)進(jìn)行雙向交流[5]，因此腸道菌群失調(diào)可能通過腸-肝軸引起肝臟的炎癥性疾病[6]。研究表明，腸道菌群失調(diào)，腸內(nèi)代謝產(chǎn)物包括腸源性毒素和微生物代謝物通過門靜脈進(jìn)入肝臟，引起肝細(xì)胞炎癥損傷，激活肝臟免疫應(yīng)答機制，從而導(dǎo)致肝功能改變[7]。此外，腸道微生物在肝臟病理生理過程中發(fā)揮重要作用，能夠通過改變腸道通透性、調(diào)節(jié)膽堿代謝、調(diào)節(jié)膽汁酸代謝等來改善肝臟炎癥和（或）纖維化[8]。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論將膽汁淤積歸屬于“黃疸”范疇，處方數(shù)據(jù)挖掘研究表明，治療淤膽型肝炎的中藥復(fù)方湯劑中最常用的中藥之一為赤芍，使用頻率高達(dá)82.61%[9]。赤芍為毛茛科芍藥屬植物芍藥的干燥根，性涼能瀉肝膽之熱，味苦可入膽而益膽汁，《神農(nóng)本草經(jīng)》中述其“主邪氣腹痛，除血痹，破堅積，寒熱疝瘕，止痛，利小便”[10]?！梆觥必灤┯倌懶透窝资冀K，使用赤芍可清利肝膽熱毒、改善脈道瘀阻的狀態(tài)；現(xiàn)代藥理學(xué)研究也證實，大劑量赤芍可通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)，并調(diào)節(jié)膽汁酸組成和含量，從而改善膽汁淤積[11]。其主要活性成分芍藥苷于1963年作為一種單萜苷首次從芍藥中分離得到[12]，芍藥苷可以改善大鼠肝組織淤膽型炎癥、壞死和膽管增生[13-14]。表明赤芍中的主要效應(yīng)成分芍藥苷具有顯著的保肝利膽作用，能夠通過抗氧化、抗凋亡、抗炎等具體的通路發(fā)揮效應(yīng)，然而對芍藥苷與腸道菌群的調(diào)節(jié)關(guān)聯(lián)卻少有研究。因此，本研究采用α-異硫氰酸酯（α-isothiocyanate，ANIT）致大鼠急性肝內(nèi)膽汁淤積模型對芍藥苷進(jìn)行藥效學(xué)評價，進(jìn)而通過考察芍藥苷對大鼠腸道菌群的影響來研究其作用機制，為芍藥苷通過調(diào)節(jié)腸道菌群從而改善膽汁淤積提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～220 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）2019-0010，動物合格證號No.110324220102750123。動物于成都中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心動物房飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后進(jìn)行實驗。動物實驗經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號2020-0312）。

1.2 藥品與試劑

ANIT（批號L2104215，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；芍藥苷（批號CHB-S-068，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95.0%）購自成都生物克洛瑪生物科技有限公司；熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA，批號L21056A，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.5%）購自德國Losan Pharma Gmbh；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒（批號20220210）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒（批號20220304）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyl transpeptidase，γ-GT）試劑盒（批號20220323）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）試劑盒（批號20220407）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBIL）試劑盒（批號20220311）、總膽汁酸（total bile acid，TBA）試劑盒（批號20220209）購自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器

1600R型低溫離心機（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；DG5032型酶標(biāo)儀（南京華東電子集團(tuán)）；JA5003型電子分析天平（上海舜宇平科學(xué)儀器有限公司）；CI-S型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；THZ-92A型氣浴恒溫振蕩器（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；KQ-500DE型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

2 方法

2.1 分組、給藥及造模

SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，采用隨機數(shù)字表法隨機分為對照組、模型組、芍藥苷高、中、低劑量（200、100、50 mg/kg）組和UDCA（60 mg/kg）組，每組10只。各給藥組ig相應(yīng)藥物（10 mL/kg），對照組和模型組ig等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)7 d。實驗第4天，模型組和各給藥組ig ANIT（60 mg/kg）誘導(dǎo)膽汁淤積模型，對照組ig等體積橄欖油，記錄給藥前及給藥7 d后大鼠的體質(zhì)量變化。

2.2 芍藥苷對膽汁淤積大鼠膽汁體積流量的影響

大鼠ip烏拉坦麻醉后，仰臥位固定，劍突下開腹，進(jìn)行膽總管插管手術(shù)留取膽汁，為了確保準(zhǔn)確測量，插管5 min后對膽汁收集取樣20～30 min，于?80 ℃保存直至分析，膽汁收集量與流出時間的比值為膽汁體積流量。

2.3 芍藥苷對膽汁淤積大鼠血清中AST、ALT、γ-GT活性及DBIL、TBIL、TBA水平的影響

大鼠麻醉后，腹主動脈取血，于室溫下靜置4 h后，4 ℃、3000 r/min離心10 min，分離血清，于0 ℃保存，按試劑盒說明書測定血清中AST、ALT、γ-GT活性及DBIL、TBIL、TBA水平。

2.4 芍藥苷對膽汁淤積大鼠肝臟組織病理變化的影響

取各組大鼠肝臟，于4%多聚甲醛中固定24 h后，脫水，石蠟包埋，常規(guī)切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察肝臟病理變化。

2.5 腸內(nèi)容物標(biāo)本采集

于無菌狀態(tài)下取出各組大鼠整個腸道，吸取無菌PBS溶液，沖洗消化道外壁后，切取所需結(jié)腸段，輕柔擠出內(nèi)容物或剖開腸道用無菌手術(shù)刀挖取內(nèi)容物1～3 g置于無菌EP管，立刻放入?80 ℃液氮凍存，1 d內(nèi)轉(zhuǎn)存至?80 ℃低溫冰箱保存。

2.6 大鼠腸道菌群16S rRNA檢測

提取對照組、模型組、芍藥苷高劑量組樣本的基因組DNA，檢測DNA的純度和濃度合格后，取適量的基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，添加樣本特異性Barcode序列，與Pfu高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR，確保擴增效率和提取DNA樣品的準(zhǔn)確性、樣品檢測、純化、建庫、并采用Illumina Miseq平臺進(jìn)行高通量測序。下機數(shù)據(jù)按照QIIME2 DaDa2分析流程或Vsearch軟件的分析流程進(jìn)行序列去噪或操作分類單位（operational taxonomic units，OTU）聚類，進(jìn)行ASV/OTU物種注釋，并與大鼠微生物數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步比對，得到樣本的物種分類信息，進(jìn)行聚類分析及多樣性分析，后通過京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析預(yù)測樣本的菌群代謝功能。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 芍藥苷對膽汁淤積大鼠體質(zhì)量的影響

如圖1所示，自第4天造模后，與對照組比較，各組大鼠體質(zhì)量均降低；第7天，與對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，芍藥苷高、中劑量組和UDCA組大鼠體質(zhì)量均明顯升高（＜0.05、0.01）。

與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01

3.2 芍藥苷對膽汁淤積大鼠膽汁體積流量的影響

對照組大鼠膽汁體積流量為（21.44±0.66）μL/min；模型組大鼠膽汁體積流量為（7.11±0.36）μL/min，與對照組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（＜0.05）；芍藥苷高劑量組膽汁體積流量為（17.15±0.19）μL/min，與模型組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異（＜0.05）。表明芍藥苷高劑量可以有效改善膽汁淤積大鼠膽汁體積流量。

3.3 芍藥苷對膽汁淤積大鼠血清中AST、ALT、γ-GT活性及DBIL、TBIL、TBA水平的影響

如表1所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中肝功能指標(biāo)ALT、AST、γ-GT活性與膽汁淤積指標(biāo)DBIL、TBIL、TBA水平均明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中肝功能指標(biāo)ALT、AST、γ-GT活性與膽汁淤積指標(biāo)DBIL、TBIL、TBA水平均明顯降低（＜0.01），且呈劑量相關(guān)性。

通過地下水系統(tǒng)脆弱性評價分析，可以掌握不同等級脆弱性的地下水分布，特別是了解地下水水質(zhì)脆弱性高，即易于污染地區(qū)的狀況。這樣，地下水水質(zhì)保護(hù)就能做到更有針對性。地下水系統(tǒng)的脆弱性，除了地下水系統(tǒng)固有的對污染物的敏感性外，還與天然或人為造成的污染源的位置和類型以及污染物距離含水層的相對位置和污染物的運移情況等因素有關(guān)。因此，應(yīng)了解和掌握受水區(qū)地下水系統(tǒng)對污染物的固有敏感性，研究評價受水區(qū)地下水系統(tǒng)的脆弱性。

3.4 芍藥苷對膽汁淤積大鼠肝臟組織病理變化的影響

如圖2所示，對照組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞索狀排列整齊，肝細(xì)胞間肝竇明顯，未見明顯組織病理損傷改變；模型組大鼠肝細(xì)胞萎縮呈嚴(yán)重長梭狀形態(tài)，肝竇和匯管區(qū)見炎性細(xì)胞浸潤，匯管區(qū)見膽管上皮細(xì)胞及纖維細(xì)胞增生；芍藥苷高劑量組大鼠肝臟組織可見炎性細(xì)胞浸潤；芍藥苷中劑量組大鼠肝細(xì)胞萎縮，纖維細(xì)胞增生，見有肝竇和匯管區(qū)見炎性細(xì)胞浸潤；芍藥苷低劑量組大鼠肝細(xì)胞空泡變性可見，肝竇和匯管區(qū)見炎性細(xì)胞浸潤，匯管區(qū)見膽管上皮細(xì)胞及纖維細(xì)胞增生；UDCA組大鼠肝組織匯管區(qū)可見少量炎性細(xì)胞浸潤，肝竇內(nèi)可見數(shù)個灶性炎性細(xì)胞浸潤區(qū)。

3.5 大鼠腸道菌群測序變化與物種注釋

對對照組、模型組、芍藥苷高劑量組樣本進(jìn)行16S rRNA檢測，3組大鼠腸道菌群測序結(jié)果中，高質(zhì)量序列數(shù)目為2 377 872，堿基數(shù)目為1 005 993 655，平均長度為418 bp，序列長度分布在400～440 bp（圖3-A），符合16S rRNA V3～4要求，可知后續(xù)分析較為可靠，測序結(jié)果能夠反映樣本的真實情況。物種分類注釋圖表明腸道菌群各分類單元門、綱、目、科、屬、種水平的ASV/OTU數(shù)（圖3-B）。統(tǒng)計后得，對照組、芍藥苷高劑量組、模型組門水平及以下ASV/OTU數(shù)分別為2204、2223、2413，屬水平ASV/OTU數(shù)分別為623、632、659。

表1 芍藥苷對膽汁淤積大鼠血清中AST、ALT、γ-GT活性及DBIL、TBIL、TBA水平的影響(, n = 10)

與對照組比較：**＜0.01；與模型組比較：##＜0.01

**< 0.01control group;##< 0.01model group

“↑↑”表示細(xì)胞增生或者細(xì)胞纖維化；“↑”表示細(xì)胞空泡萎縮形態(tài)變性；“?”表示炎性浸潤

A-高質(zhì)量序列長度分布統(tǒng)計圖 B-物種分類注釋圖 C-對照組 M-模型組 HP-芍藥苷高劑量組，下圖同

3.6 大鼠腸道菌群α多樣性分析

如圖4-a所示，Shannon和Simpson指數(shù)表征多樣性，與對照組比較，模型組Shannon和Simpson指數(shù)均升高；與模型組比較，芍藥苷高劑量組Shannon和Simpson指數(shù)均降低，群落多樣性降低，表明芍藥苷能夠降低膽汁淤積大鼠腸道菌群多樣性。Pielou’s evenness指數(shù)表征均勻度，與對照組比較，模型組Pielou’s evenness指數(shù)升高；與模型組比較，芍藥苷高劑量組Pielou’s evenness指數(shù)降低，表明芍藥苷能夠降低膽汁淤積大鼠腸道菌群均勻度。豐度等級曲線反映各樣本中ASV/OTU豐度的分布規(guī)律，各組在橫軸上的范圍較大且平緩下降，表明各組大鼠腸道菌群物種豐富度高和物種分布均勻（圖4-b）。物種累積曲線隨樣本量的增加，曲線始終保持上升趨勢，表明樣本量還須補充（圖4-c）。

3.7 大鼠腸道菌群β多樣性分析

β多樣性分析可比較不同樣本腸道菌群的物種多樣性，探索各組菌群組成的差異性。Adonis顯示組間差異大于組內(nèi)差異（2＝0.201、＝0.001），提示各組腸道菌群結(jié)構(gòu)具有顯著差異性。主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA）與非量度多維尺度分析（non-metric multidimensional scaling，NMDS）如圖5所示，各組內(nèi)樣本點相對聚集，說明各組組內(nèi)樣本點之間的變異度較小；組間較為離散，說明各組組間樣本具有物種差異，NMDS結(jié)果的stress值＝0.156＜0.2，表明NMDS分析的結(jié)果可靠。提示芍藥苷高劑量一定程度上可以調(diào)節(jié)ANIT誘導(dǎo)的膽汁淤積大鼠腸道菌群組成變化。

3.8 大鼠腸道菌群物種組成分析

3.8.1 門水平下各組腸道菌群組成及物種豐度分析 如圖6-a、b所示，各組大鼠菌群優(yōu)勢種類差異不大，主要由厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）等構(gòu)成，其中厚壁菌門與擬桿菌門比例最高，占80%以上。與對照組比較，模型組擬桿菌門、變形菌門相對豐度顯著升高（＜0.01），厚壁菌門相對豐度顯著降低（＜0.05）；與模型組比較，芍藥苷高劑量組擬桿菌門相對豐度顯著降低（＜0.01），厚壁菌門、放線菌門相對豐度顯著升高（＜0.05、0.01），厚壁菌門與擬桿菌門比值（F/B）升高。表明芍藥苷能夠調(diào)控ANIT誘導(dǎo)的膽汁淤積大鼠腸道菌群優(yōu)勢物種厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門的群落豐度。

a-Simpson、Shannon和Pielou’s evenness指數(shù) b-豐度等級曲線 c-物種累積曲線

A-PCoA分析 B-NMDS分析

a-門水平下各組腸道菌群組成及物種豐度柱狀圖 b-門水平下優(yōu)勢種類 c-屬水平下各組腸道菌群組成及物種豐度柱狀圖 d-屬水平下優(yōu)勢種類 e-物種組成熱圖 與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01

3.8.2 屬水平下各組腸道菌群組成及物種豐度分析 如圖6-c、d所示，各組大鼠菌群優(yōu)勢種類分布列有前20種，菌屬組成所占百分比不同，其中乳桿菌屬、異桿菌屬、布勞特氏菌屬、顫螺菌屬、梭菌屬是相對豐度前5位的菌屬。與對照組比較，模型組異桿菌屬、布勞特氏菌屬、擬桿菌屬相對豐度顯著升高（＜0.05）；與模型組比較，芍藥苷高劑量組異桿菌屬、布勞特氏菌屬相對豐度顯著升高（＜0.05），顫螺菌屬、瘤胃球菌屬相對豐度顯著降低（＜0.05、0.01）。表明芍藥苷能夠調(diào)控ANIT誘導(dǎo)的膽汁淤積大鼠腸道菌群優(yōu)勢物種異桿菌屬、布勞特氏菌屬、顫螺菌屬的群落豐度。

3.9 大鼠腸道菌群標(biāo)志物種差異分析

為直觀展示菌群物種的重要性，排序繪制帶柱狀圖的熱圖，將重要性前100的物種從上到下，在影響分組的重要性上依次遞減，重要性靠前的物種可認(rèn)為是組間差異的標(biāo)志物種（圖7-I）。通過標(biāo)志物種差異分析（LDA effect size，LEfSe），LEfSe分析結(jié)果包括3部分：一是顯著差異物種LDA值分布柱狀圖（圖7-II），展示各個組內(nèi)顯著富集的標(biāo)志物種及其重要性程度，LDA效應(yīng)量＞2以及＜0.05具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，可見對照組具有豐度差異的物種為螺旋體門（p-Spirochaetes）、螺旋體目（o-Spirochaetales）、螺旋體科（f-Spirochaetaceae）、螺旋體綱（c-Spirochaetes）、密螺旋體屬（g-）、副帕拉普氏菌屬（g-）；芍藥苷高劑量組具有豐度差異的物種為紅蝽菌目（o-Coriobacteriales）、紅蝽菌科（f-Coriobacteriaceae）、紅蝽菌綱（c-Coriobacteriia）、多爾氏菌屬（g-）、羅爾斯頓菌屬（g-）；模型組具有豐度差異的物種為糞熱桿菌屬（g-）、熱脫硫桿菌科（f-Thermodesulfobiaceae）、熱袍菌綱（c-Thermotogae）、熱袍菌目（o-Thermotogales）、熱袍菌科（f-Thermotogaceae）、熱袍菌（p-Thermotogae）、熱袍菌科（g-S1）、副擬桿菌屬（g-）、紫胞菌科（f-Porphyromonadaceae）、嗜熱厭氧菌目（o-Thermoanaerobacterales）、梭狀芽孢桿菌MBA08（Bacteria-MBA08）。二是物種分類學(xué)分枝圖，將LDA值圖中各組樣品中標(biāo)志物種進(jìn)一步按照分類學(xué)層次進(jìn)行分布，由內(nèi)至外輻射的圓圈代表了由門至屬（或種）的分類級別（圖7-III）。三是組間豐度柱狀圖，將不同分組樣品中的標(biāo)志物種進(jìn)一步組間比較，如圖8所示，與對照組比較，模型組紅蝽菌綱、梭狀芽孢桿菌MBA08、多爾氏菌屬、紫胞菌科、熱袍菌綱相對豐度上升，羅爾斯頓菌屬、副帕拉普氏菌屬、螺旋體綱相對豐度下降；與模型組比較，芍藥苷高劑量組紅蝽菌綱、多爾氏菌屬、羅爾斯頓菌屬相對豐度上升，梭狀芽孢桿菌MBA08、紫胞菌科、熱袍菌綱相對豐度下降。此外，對照組與芍藥苷高劑量組HP組梭狀芽孢桿菌MBA08、紫胞菌科、熱袍菌綱相對豐度極低，其中梭狀芽孢桿菌MBA08、熱袍菌綱相對豐度在對照組中并無體現(xiàn)，為膽汁淤積大鼠腸道菌群顯著標(biāo)志物種。

I-組間差異的標(biāo)志物熱圖 II-物種LDA值分布柱狀圖 III-基于分類等級樹的組間差異分類單元展示圖（以0.01%為閾值）

3.10 大鼠腸道菌群通路富集差異分析

KEGG數(shù)據(jù)庫的核心為生物代謝通路分析數(shù)據(jù)庫，如圖9所示，3組大鼠腸道菌群KEGG通路主要富集在代謝、遺傳信息處理2大代謝通路方面，功能類別主要富集在碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔酶因子和維生素代謝、萜類多酮類代謝、脂質(zhì)代謝等。

圖8 大鼠腸道菌群物種LEfSe分析組間豐度柱狀圖

圖9 腸道菌群KEGG通路富集差異分析

4 討論

在基礎(chǔ)研究中，ANIT引起動物的肝臟中出現(xiàn)各種生物化學(xué)和組織病理學(xué)變化，包括膽管上皮和膽管上皮細(xì)胞壞死，因此被廣泛用于誘發(fā)膽汁淤積。早期有關(guān)ANIT誘導(dǎo)膽汁淤積模型的研究中，ANIT可能通過消耗肝細(xì)胞或膽管上皮細(xì)胞的還原型谷胱甘肽或其他硫醇而引起毒性，進(jìn)而引起動物的肝臟中出現(xiàn)各種生物化學(xué)和組織病理學(xué)變化，包括膽管上皮和膽管上皮細(xì)胞壞死，從而造成肝功能損傷[15]。AST、ALT、γ-GT、TBIL、DBIL、TBA是臨床診斷肝功能的重要指標(biāo)，反映了肝臟生理病理狀況，肝臟受損時，以上指標(biāo)會明顯升高。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中肝功能相關(guān)指標(biāo)明顯升高，肝臟病理切片觀察到肝細(xì)胞萎縮呈嚴(yán)重長梭狀形態(tài)，肝竇和匯管區(qū)見炎性細(xì)胞浸潤，匯管區(qū)見膽管上皮細(xì)胞及纖維細(xì)胞增生，膽汁體積流量明顯降低，表明本研究中ANIT誘導(dǎo)的膽汁淤積明顯。

芍藥在中醫(yī)中廣泛用于腦血管疾病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和肝臟疾病的治療[16]，其味酸，故能入肝以生肝血，味苦故能入膽而益膽汁，味酸而兼苦，且又性涼，又善泄肝膽之熱。同時現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實芍藥活性成分不僅有保肝作用，還能減輕膽汁淤積癥狀[17]。芍藥中提取的主要生物活性成分芍藥苷因其對肝臟具有強大的療效，深有藥用研究價值而深受關(guān)注[18]，但芍藥苷抗膽汁淤積的具體作用機制尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，給予不同劑量的芍藥苷干預(yù)1周后，大鼠血清中肝功能指標(biāo)AST、ALT、γ-GT活性與膽汁淤積指標(biāo)TBIL、DBIL、TBA水平呈劑量相關(guān)性降低，肝臟組織病理損傷明顯減輕，肝小葉內(nèi)肝細(xì)胞腫脹變性得到緩解，肝竇內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤、匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤和纖維組織增生均減少。膽汁淤積是由各種復(fù)雜原因?qū)е掠卸灸懼岱e聚，造成膽汁體積流量改變。芍藥苷高劑量組膽汁體積流量較模型組明顯升高，表明芍藥苷能夠改善膽汁淤積狀況，這也體現(xiàn)了芍藥能夠疏肝利膽退黃的功效。上述結(jié)果說明芍藥苷在治療膽汁淤積癥狀時有一定療效。

本研究成功建立了ANIT誘導(dǎo)的膽汁淤積大鼠模型，并基于16S rRNA技術(shù)評價芍藥苷對膽汁淤積大鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，從腸道菌群角度初步探討芍藥苷改善膽汁淤積的作用機制。多樣性分析表明膽汁淤積疾病進(jìn)展過程會伴隨腸道菌群失調(diào)，高劑量的芍藥苷一定程度上可以調(diào)節(jié)ANIT誘導(dǎo)的膽汁淤積大鼠腸道菌群組成及結(jié)構(gòu)變化。進(jìn)一步對各組腸道菌群組成及物種豐度進(jìn)行分析，門水平上，相較于對照組，模型組擬桿菌門、變形菌門豐度顯著升高；相較于模型組，芍藥苷高劑量組擬桿菌門豐度顯著降低，厚壁菌門、放線菌門豐度顯著升高。屬水平上，相較于對照組，模型組異桿菌屬、布勞特氏菌屬、擬桿菌屬豐度顯著升高；相較于模型組，芍藥苷高劑量組異桿菌屬、布勞特氏菌屬豐度顯著升高，顫螺菌屬、瘤胃球菌屬豐度顯著降低。LEfSe組間標(biāo)志物種差異分析結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組紅蝽菌綱、梭狀芽孢桿菌MBA08、多爾氏菌屬、紫胞菌科、熱袍菌綱相對豐度升高，羅爾斯頓菌屬、副帕拉普氏菌屬、螺旋體綱相對豐度下降；與模型組比較，芍藥苷高劑量組紅蝽菌綱、多爾氏菌屬、羅爾斯頓菌屬相對豐度升高，梭狀芽孢桿菌MBA08、紫胞菌科、熱袍菌綱相對豐度下降，并發(fā)現(xiàn)梭狀芽孢桿菌MBA08、紫胞菌科、熱袍菌綱為膽汁淤積大鼠腸道菌群顯著標(biāo)志物種。大鼠腸道菌群KEGG功能富集差異分析表明，菌群功能類別主要富集在碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔酶因子和維生素代謝、萜類多酮類代謝、脂質(zhì)代謝等。

腸道微生態(tài)紊亂引起腸道內(nèi)潛在有害物質(zhì)如病原菌、內(nèi)毒素、炎癥因子等增加，導(dǎo)致腸道上皮細(xì)胞間緊密連接破壞，腸道滲透性增加以及腸黏膜結(jié)構(gòu)改變，繼而通過門靜脈作用于肝臟，促進(jìn)肝臟炎癥[19]。近年研究強調(diào)了微生物組和腸道屏障在肝臟疾病中的作用，導(dǎo)致將腸-肝軸概念作為一種常見的致病原理和潛在的治療靶點[20]，通過抗生素、益生菌等調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)減少有害菌和有害物質(zhì)產(chǎn)生，或通過改善腸道屏障減少腸道細(xì)菌及有害物質(zhì)進(jìn)入肝臟，或調(diào)節(jié)肝臟免疫功能增加其抗菌反應(yīng)[21]。人體和大鼠腸道內(nèi)細(xì)菌多半屬于厚壁菌門和擬桿菌門，顯著影響機體生理功能，F(xiàn)/B變化作為一種生物失調(diào)標(biāo)志與多種疾病進(jìn)展相關(guān)[22-][23]，如在間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷實驗中，治療組F/B值升高[24]，在本研究中，芍藥苷高劑量組主要表現(xiàn)為厚壁菌門相關(guān)菌群增加，擬桿菌門相關(guān)菌群減少，F(xiàn)/B值升高。變形菌門屬于對宿主有害的內(nèi)毒素產(chǎn)生菌，在本研究中，膽汁淤積大鼠腸道菌群豐度較高。乳桿菌屬是最主要的益生菌類群之一，研究表明，在膽總管結(jié)扎誘導(dǎo)的膽汁淤積小鼠中，乳桿菌通過作用于法尼醇X受體-成纖維細(xì)胞生長因子15信號通路抑制膽汁酸合成，從而減少膽汁酸分泌，并增強膽汁酸排泄，從而防止膽汁酸誘導(dǎo)的小鼠過度肝損傷和纖維化[25]，更有報道突出了乳酸桿菌對膽汁淤積小鼠腸道和肝臟穩(wěn)態(tài)的潛在治療效果[26]。布勞特氏菌屬、異桿菌屬廣泛分布于哺乳動物的糞便和腸道，并顯示出潛在的益生菌特性[27]，在緩解炎癥疾病和代謝紊亂方面發(fā)揮著有利作用，對特定微生物具有抗菌活性[28]。研究發(fā)現(xiàn)，布勞特氏菌屬能夠產(chǎn)生短鏈?zhǔn)街舅嵋跃S持腸道黏膜屏障的完整性，且通過相關(guān)性分析，布勞特氏菌與血清中ALT、γ-GT活性呈負(fù)相關(guān)[29]。顫螺菌屬、布勞特氏菌屬、瘤胃球菌屬、羅氏菌屬等腸道微生物通過產(chǎn)生短鏈脂肪酸為腸上皮細(xì)胞提供能量和營養(yǎng)，能夠恢復(fù)腸道黏膜[30]。梭菌屬通過7α-脫羥基化將未結(jié)合的初級膽汁酸轉(zhuǎn)化為次級膽汁酸，臨床研究表明膽汁淤積患者梭菌屬豐度低于正常組[31]，本研究發(fā)現(xiàn)，相較于對照組和芍藥苷高劑量組，ANIT誘導(dǎo)的膽汁淤積大鼠腸道菌群梭菌屬豐度低。羅氏菌屬豐度與葡萄糖和脂質(zhì)代謝之間存在關(guān)聯(lián)，且具有預(yù)防免疫性肝損傷和改善保護(hù)性修復(fù)腸道屏障的功能[32]。擬桿菌屬抑制腸道微生物群衍生的7α-脫羥基酶對膽酸向脫氧膽酸的轉(zhuǎn)化[33]。膽汁淤積大鼠腸道菌群顯著標(biāo)志物種紫胞菌科豐度的增加、血漿內(nèi)毒素水平的升高和肝臟炎癥與慢性肝病的并發(fā)癥密切相關(guān)[34]。另外，布勞特氏菌屬豐度與胰島素敏感性和脂質(zhì)代謝的負(fù)面影響顯著正相關(guān)，瘤胃球菌屬可以降解抗性淀粉，從而增加腸道能量吸收[35]，本研究中3組大鼠腸道菌群KEGG功能富集主要在代謝通路方面，因此芍藥苷可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群豐度影響碳水化合物、氨基酸及脂質(zhì)等的代謝，從而減輕膽汁淤積性肝損傷。

本研究通過大鼠體質(zhì)量變化、血清肝功能與膽汁淤積指標(biāo)、膽汁酸體積流量測定及肝臟病理切片等一系列綜合評定芍藥苷對ANIT誘導(dǎo)的膽汁淤積大鼠藥效學(xué)研究，結(jié)果均表明芍藥苷可以有效緩解由于膽汁淤積導(dǎo)致的肝損傷，減少肝內(nèi)膽汁淤積帶來的危害。此外，通過腸內(nèi)容物菌群測序分析，膽汁淤積疾病進(jìn)展過程會伴隨腸道菌群的失調(diào)，且高劑量的芍藥苷一定程度上可以調(diào)節(jié)ANIT誘導(dǎo)的膽汁淤積大鼠腸道菌群組成及結(jié)構(gòu)變化，F(xiàn)/B值升高，降低腸道有害菌擬桿菌門及膽汁淤積大鼠腸道菌群顯著標(biāo)志物種梭狀芽孢桿菌MBA08、紫胞菌科、熱袍菌綱豐度，提升腸道有益菌厚壁菌門、布勞特氏菌屬、異桿菌屬豐度，促進(jìn)膽汁淤積大鼠腸道菌群向正常水平恢復(fù)。綜上，芍藥苷對膽汁淤積的治療作用與其對膽汁淤積大鼠腸道菌群失調(diào)的改善作用具有相關(guān)性。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Wu H H, Chen C B, Ziani S,. Fibrotic events in the progression of cholestatic liver disease [J]., 2021, 10(5): 1107.

[2] 中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會, 中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會, 中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會. 膽汁淤積性肝病診斷和治療共識 (2015) [J]. 實用肝臟病雜志, 2016, 19(6): 2-12.

[3] Martinot E, Sedes L, Baptissart M,. Bile acids and their receptors [J]., 2017, 56: 2-9.

[4] Isaacs-Ten A, Echeandia M, Moreno-Gonzalez M,. Intestinal microbiome-macrophage crosstalk contributes to cholestatic liver disease by promoting intestinal permeability in mice [J]., 2020, 72(6): 2090-2108.

[5] Li X V, Leonardi I, Iliev I D. Gut mycobiota in immunity and inflammatory disease [J]., 2019, 50(6): 1365-1379.

[6] Schneider K M, Candels L S, Hov J R,. Gut microbiota depletion exacerbates cholestatic liver injury via loss of FXR signalling [J]., 2021, 3(9): 1228-1241.

[7] 黃倩, 張海博, 李京濤, 等. 腸道微生態(tài)在肝內(nèi)膽汁淤積中的作用機制 [J]. 臨床肝膽病雜志, 2019, 35(10): 2355-2359.

[8] Floch M H, Walker W A, Sanders M E,. Recommendations for probiotic use: 2015 update: Proceedings and consensus opinion [J]., 2015, 49(Suppl 1): S69-S73.

[9] 李晨冰. 中藥復(fù)方湯劑治療淤膽型肝炎的薈萃分析及臨床用藥規(guī)律探討 [D]. 武漢: 湖北中醫(yī)藥大學(xué), 2021.

[10] 清·莫枚士輯注. 郭君雙, 米鵬, 周揚校注. 神農(nóng)本經(jīng)校注 [M]. 北京: 中國中醫(yī)藥出版社, 2015: 41, 90.

[11] Xie T J, Li K, Gong X,. Paeoniflorin protects against liver ischemia/reperfusion injury in mice via inhibiting HMGB1-TLR4 signaling pathway [J]., 2018, 32(11): 2247-2255.

[12] Zhang H Y, Wang H L, Zhong G Y,. Molecular mechanism and research progress on pharmacology of traditional Chinese medicine in liver injury [J]., 2018, 56(1): 594-611.

[13] Chen L S, Zhao X, Wei S Z,. Mechanism of paeoniflorin on ANIT-induced cholestatic liver injury using integrated metabolomics and network pharmacology [J]., 2021, 12: 737630.

[14] Chen L S, Wei S Z, Liu H H,. Paeoniflorin protects against ANIT-induced cholestatic liver injury in rats via the activation of SIRT1-FXR signaling pathway [J]., 2021, 2021: 8479868.

[15] Carpenter-Deyo L, Marchand D H, Jean P A,. Involvement of glutathione in 1-naphthylisothiocyanate (ANIT) metabolism and toxicity to isolated hepatocytes [J]., 1991, 42(11): 2171-2180.

[16] Zhao D D, Jiang L L, Li H Y,. Chemical components and pharmacological activities of terpene natural products from the genus[J]., 2016, 21(10): 1362.

[17] Zhang H Y, Wang H L, Zhong G Y,. Molecular mechanism and research progress on pharmacology of traditional Chinese medicine in liver injury [J]., 2018, 56(1): 594-611.

[18] Zhou H Q, Liu W, Wang J,. Paeoniflorin attenuates ANIT-induced cholestasis by inhibiting apoptosisvia mitochondria-dependent pathway [J]., 2017, 89: 696-704.

[19] Juanola O, Hassan M, Kumar P,. Intestinal microbiota drives cholestasis-induced specific hepatic gene expression patterns [J]., 2021, 13(1): 1-20.

[20] Kummen M, Hov J R. The gut microbial influence on cholestatic liver disease [J]., 2019, 39(7): 1186-1196.

[21] Jasirwan C O M, Muradi A, Hasan I,. Correlation of gut Firmicutes/Bacteroidetes ratio with fibrosis and steatosis stratified by body mass index in patients with non-alcoholic fatty liver disease [J]., 2021, 40(1): 50-58.

[22] Ahlawat S, Asha, Sharma K K. Gut-organ axis: A microbial outreach and networking [J]., 2021, 72(6): 636-668.

[23] Zhang W W, Zhang X L, Zhang Y Y,. Analysis of changes of intestinal flora in elderly patients with Alzheimer’s disease and liver cancer and its correlation with abnormal gastrointestinal motility [J]., 2021, 2021: 7517379.

[24] Dong X T, Feng X D, Liu J Q,. Characteristics of intestinal microecology during mesenchymal stem cell-based therapy for mouse acute liver injury [J]., 2019, 2019: 2403793.

[25] Liu Y H, Chen K F, Li F Y,. ProbioticGG prevents liver fibrosis through inhibiting hepatic bile acid synthesis and enhancing bile acid excretion in mice [J]., 2020, 71(6): 2050-2066.

[26] Santos A A, Afonso M B, Ramiro R S,. Host miRNA-21 promotes liver dysfunction by targeting small intestinalin mice [J]., 2020, 12(1): 1840766.

[27] Chen T Y, Ding R R, Chen X R,. Firmicutes andin gut microbiota lessened in chronic liver diseases and hepatocellular carcinoma patients: A pilot study [J]., 2021, 12(1): 8233-8246.

[28] Liu X M, Mao B Y, Gu J Y,.-a new functional genus with potential probiotic properties? [J]., 2021, 13(1): 1-21.

[29] Shi L T, Pan R L, Lin G P,. Lactic acid bacteria alleviate liver damage caused by perfluorooctanoic acid exposure via antioxidant capacity, biosorption capacity and gut microbiota regulation [J]., 2021, 222: 112515.

[30] Song W, Sun L Y, Zhu Z J,. Characteristics of gut microbiota in children with biliary atresia after liver transplantation [J]., 2021, 12: 704313.

[31] Xiao Y T, Zhou K J, Lu Y,. Administration of antibiotics contributes to cholestasis in pediatric patients with intestinal failure via the alteration of FXR signaling [J]., 2018, 50(12): 1-14.

[32] Pan X F, Kaminga A C, Liu A Z,. Gut microbiota, glucose, lipid, and water-electrolyte metabolism in children with nonalcoholic fatty liver disease [J]., 2021, 11: 683743.

[33] Hegade V S, Pechlivanis A, McDonald J A K,. Autotaxin, bile acid profile and effect of ileal bile acid transporter inhibition in primary biliary cholangitis patients with pruritus [J]., 2019, 39(5): 967-975.

[34] Huang H P, Lin Z H, Zeng Y L,. Probiotic and glutamine treatments attenuate alcoholic liver disease in a rat model [J]., 2019, 18(6): 4733-4739.

[35] Zhao T, Zhan L B, Zhou W,. The effects of Erchen Decoction on gut microbiota and lipid metabolism disorders in Zucker diabetic fatty rats [J]., 2021, 12: 647529.

Mechanism of paeoniflorin in improving α-isothiocyanate induced cholestasis by regulating intestinal flora in rats

WU He-fei1, ZHANG Fang-ling1, DENG Xin-yu1, LI Yu-bing1, CHEN Yuan1, HU Qi-chao1, MA Xiao1, ZHAO Yan-ling2

1. State Key Laboratory of Southwest Characteristic Chinese Medicine Resources, College of Pharmacy, Chengdu University of Chinese Medicine, State Key Laboratory of Southwest Characteristic Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, China 2. Department of Pharmacy, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100037, China

To verify the pharmacodynamic effect of paeoniflorin on α-isothiocyanate (ANIT)-induced cholestasis in rats, and explore the regulatory mechanism of paeoniflorin on intestinal flora by 16S rRNA technology.SD rats were randomly divided into control group, model group, paeoniflorin high-, medium-and low-dose (200, 100, 50 mg/kg) groups and ursodeoxycholic acid (60 mg/kg) group, with 10 rats in each group. After 7 d of drug intervention, model of cholestasis was induced by ig ANIT (60 mg/kg) on 4th day. Bile volume flow was measured; Activities of aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), γ-glutamyl transpeptidase (γ-GT) and levels of total bilirubin (TBIL), direct bilirubin (DBIL), total bile acid (TBA) in serum were detected; Hematoxylin eosin (HE) staining was used to observe the pathological changes of liver tissue; Intestinal contents of rats was collected for intestinal flora sequencing to explore the effect of paeoniflorin on intestinal flora.Compared with model group, paeoniflorin effectively improved bile volume flow (< 0.05), significantly down-regulated liver function index AST, ALT, γ-GT activities and cholestatic index TBIL, DBIL and TBA levels (< 0.01), improved the damage of liver cells. The sequencing results of intestinal flora showed that paeoniflorin significantly increased the ratio of Firmicutes/Bacteroides and abundance ofand(< 0.05), and decreased the abundance ofand(< 0.05, 0.01).Paeoniflorin may improve the liver injury of cholestasis by improving the imbalance of intestinal flora in ANIT-induced cholestasis rats.

paeoniflorin; α-isothiocyanate; cholestasis; pharmacodynamic effect; 16S rRNA; intestinal flora

R285.5

A

0253 - 2670(2022)22 - 7091 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.22.012

2022-08-24

國家自然科學(xué)基金資助項目（82274187）；四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)項目（2019YJ0492）

吳和霏（1998—），女，碩士研究生，研究方向為臨床中藥學(xué)。E-mail: hefei5725737@163.com

馬 驍（1987—），男，副教授，研究方向為臨床中藥學(xué)。E-mail: tobymaxiao@163.com

趙艷玲（1965—），女，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向為臨床中藥學(xué)。E-mail: zhaoyl2855@126.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]