山蒼子精油對青貯玉米的霉菌抑制及品質(zhì)影響研究

張福金， 張欣昕， 郭志剛， 劉廣華， 李國銀， 紅格日其其格

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010）

植物精油（EOs）是從植物花、葉、果實等部位提取的植物次生代謝產(chǎn)物（李桂珍等，2021）。目前開發(fā)利用的EOs種類約有300余種（湯友軍等，2020；Tariq等，2019；Barbosa等，2016）。EOs主要從植物組織中提取，來源天然、無毒，具有較強的抑菌性和環(huán)境友好的優(yōu)點，在抑制霉菌生長及毒素產(chǎn)生方面效果理想，目前主要應(yīng)用于醫(yī)療、食品保鮮（姚依妮等，2021）、生態(tài)環(huán)境、畜牧等領(lǐng)域。EOs可抑制真菌生長和真菌毒素的產(chǎn)生。EOs對真菌細胞壁上形成膜電位，降低膜電位，破壞質(zhì)子泵和消耗ATP有關(guān)，破壞ATP組裝，導(dǎo)致細胞壁損傷（Turina等，2016）。同時，這種改變可能引起級聯(lián)效應(yīng)，使其他細胞器受到影響（Carson等，2002）。EOs破壞細胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，破壞細胞膜完整性，增加其通透性，從而導(dǎo)致細胞成分的泄漏和離子損失，影響細胞各種重要過程，如能量的產(chǎn)生、膜輸送及代謝調(diào)節(jié)等（Tariq等，2019；Saad等，2013；Oussalah等，2006）。肉桂醛可以破壞質(zhì)膜，進入細胞中的大分子物質(zhì)空間結(jié)構(gòu)內(nèi)部，從而破壞物質(zhì)的正常吸收、運輸和代謝（Yin等，2020）。生姜、肉桂、馬提尼揮發(fā)油可導(dǎo)致真菌細胞壁損傷，減小分生孢子形狀和減少菌絲數(shù)量，降低伏馬毒素的產(chǎn)生（Castro等，2020）。

青貯玉米、苜蓿等飼草在收獲前、中、干燥和儲存等環(huán)節(jié)中有可能受到黃曲霉等霉菌及霉菌毒素的污染，從而導(dǎo)致糧食、牧草的營養(yǎng)品質(zhì)下降，對食用后的人和動物帶來傷害。當前，控制飼草收儲過程中產(chǎn)生的霉菌污染已成為促進畜牧業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的棘手問題。因此，選擇對生物和環(huán)境沒有傷害及污染，又能保證飼草營養(yǎng)品質(zhì)的防霉劑是近幾年研究的難點及熱點。

山蒼子（Litsea cubeba）是樟科木姜子屬植物，是我國特有的香料植物資源之一（陳梓云等，2021）。山蒼子的花、葉、果肉都可蒸提出山蒼子油，其中果中的油含量最高，約占70%（李桂珍等，2021）。已有研究表明山蒼子精油能抑制霉菌的生長（李欣越等，2021；藍公毅，2020），以及與果蔬的保鮮（殷勇等，2021）等有關(guān)，但山蒼子精油對某種特定霉菌的具體抑制能力研究還處于探索階段，特別是精油在飼草控霉方面的應(yīng)用研究還鮮見報道。因此本試驗選擇以山蒼子精油作為防霉添加劑，研究其對青貯玉米特定霉菌的抑制作用，以及山蒼子精油添加對青貯玉米營養(yǎng)品質(zhì)的影響，為開發(fā)飼草天然植物防霉劑、減少飼草貯藏經(jīng)濟損失等提供應(yīng)用數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 試驗中所用山蒼子精油購自江西恒誠天然香料有限公司，馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基購自北京環(huán)凱科技有限公司，其他藥品聚乙二醇（分析純）、無水乙醇（分析純）、吐溫（分析純）等購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備 試驗中所用的儀器名稱和型號見表1。

表1 試驗所用儀器設(shè)備

1.3 試驗方法

1.3.1 山蒼子精油防霉劑的制備 以0.5 g聚乙二醇、10 mL無水乙醇、20 mL吐溫80和60 mL蒸餾水為分散劑，加入10 mL山蒼子精油，配制成山蒼子精油含量為10%的防霉添加劑，使用時稀釋。

1.3.2 霉菌分離純化 采集300 g生長霉菌的青貯玉米樣品，使用高速多功能搖擺粉碎機進行粉碎處理，稱取適量的粉碎樣品加至生理鹽水中，用無菌均質(zhì)器搖勻。獲得樣品溶液加到盛有生理鹽水的試管里進行稀釋。將已經(jīng)稀釋的溶液涂至PDA培養(yǎng)基上，在霉菌培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)5 d。用接種環(huán)將不同顏色的純霉菌菌落挑取，將其接種到新察氏瓊脂平板上。培養(yǎng)5 d后對平板進行觀察。若菌落中未生長出雜菌，則將純菌種接種到新察氏培養(yǎng)基的斜面上，4℃甘油保存。

1.3.3 霉菌鑒定 利用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒（B518259，生工生物），提取分離到的霉菌基因組，并通過引物擴增出基因中ITS序列，與NT數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得相似序列的物種信息，借助Blast輔助判斷物種信息。引物為ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。

PCR反應(yīng)體系（20 μL）：10×PCRBuffer 2.0 μL；引物F（10 μM）0.5 μL；引物R（10 μM）0.5 μL；dNTP（each 10 mM）2.0 μL；模板（DNA）2.0 μL；ddH2O 14 μL；Taq Plus DNA酶（5 U/μL）0.5 μL。

PCR反應(yīng)程序：95℃5 min，94℃30 s，57℃30 s，72℃90 s，72℃10 min，30個循環(huán)。

1.3.4 山蒼子精油最低抑菌濃度的測定 用鐮刀菌、黃曲霉菌、雜色曲霉菌、青霉菌、根霉菌5株純化菌分別制成濃度為106cfu/mL的菌懸液或孢子懸液后，分別取1 mL涂布于馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上平板，在25℃下培養(yǎng)120 h，制作含菌平板。無菌條件下，取不同濃度山蒼子精油處理直徑1 cm濾紙片，置于新的馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，然后用直徑8 mm打孔器移取含菌平板上的單個菌落至上述馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，同時吸取同體積無菌水代替山蒼子精油作為空白對照。

1.3.5 山蒼子精油的GC-MS分析 氣相色譜條件：HP-5MS色譜柱；載氣為高純度氦氣（99.999%），流速20 mL/min。升溫程序：進樣量1 μL，50℃保持1 min，以5℃/min升至260℃，保持5 min。質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源，離子源溫度為230℃，四級桿溫度為150℃，電子能量為70 e；掃描范圍：50~600 amu。數(shù)據(jù)庫：NIST Chemistry WebBook。

1.3.6 山蒼子精油的抑霉效果及品質(zhì)影響試驗取青貯玉米原料，分別添加化學(xué)添加劑（0.15%丙酸）、山蒼子精油（0.20%，制備方法見1.3.1），未加添加劑為對照組，原料與藥劑混勻后分別裝填于1 L青貯罐中，密封。青貯發(fā)酵45 d后開罐，自然狀態(tài)放置2周有氧發(fā)酵后，測定不同處理霉菌數(shù)量、細菌和真菌多樣性，生物重復(fù)3次。同時，測定其干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗纖維、酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維、氨基酸、脂肪等營養(yǎng)成分。測定方法分別為：干物質(zhì)，GB/T 6435-2014；粗蛋白質(zhì)，凱氏定氮法；粗纖維，GB/T 6434；酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維，濾袋法；氨基酸，LC-MS/MS；脂肪GB/T 6433-2006。

2 結(jié)果與分析

2.1 霉菌鑒定 從青貯玉米中共分離到的霉菌提取基因組進行PCR擴增，同時獲得的ITS序列在NCBI中進行BLAST對比，鑒定到9種霉菌（圖1），分別為鏈格孢屬、帚霉屬、根霉屬、青霉屬、鐮刀菌屬、曲霉屬、分支孢子菌屬。本研究主要對分離鑒定較多的根霉、曲霉菌、雜曲霉、鐮刀菌和青霉進行了進一步的研究（圖2）。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖

圖2 從青貯玉米中分離到的霉菌

2.2 最小抑制濃度測定結(jié)果 將用不同濃度山蒼子精油處理過的紙片放在培養(yǎng)基上，對培養(yǎng)基上的霉菌生長情況進行觀察。曲霉抑制見圖3，不同濃度的山蒼子精油對霉菌的抑霉效應(yīng)不同。同一種精油對不同霉菌的抑霉效果不同（表2）。山蒼子精油對鐮刀菌、黃曲霉、雜色曲霉、青霉、根霉的最小抑制濃度分別為0.14%、0.20%、0.20%、0.16%和0.12%，整體上，0.20%山蒼子精油可抑制上述5種霉菌的生長。

表2 山蒼子精油的最小抑制濃度

圖3 不同濃度山蒼子精油對曲霉菌的抑制作用

2.3 山蒼子精油對不同霉菌的抑菌效果 將不同霉菌菌落分別涂布于含0.20%山蒼子精油的馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，作為處理組，同時未添加山蒼子精油的為對照組。由圖4可知，對照組中均發(fā)生了霉菌生長，其中黃曲霉、雜色曲霉、青霉和根霉菌在培養(yǎng)基上已長滿。而在含0.20%山蒼子精油的處理組培養(yǎng)基上霉菌未生長，抑菌率達100%，抑制效果顯著。

圖4 0.20%山蒼子精油對不同霉菌的抑霉效果

2.4 山蒼子精油抗菌成分的GC-MS分析 對山蒼子精油進行GC-MS定性定量分析顯示（圖5），從山蒼子精油分離出來的化合物有15種（表3），其中含量百分比大于20%的主要成分有（Z）-檸檬醛（20.66%）、（E）-檸檬醛（21.67%）、肉桂醛（23.31%）、β-石竹烯（23.76%）、石竹素（29.23%）。由此可說明，山蒼子精油抑霉主要成分是檸檬醛。精油對霉菌的抑制作用與其主要化學(xué)成分相關(guān)，相關(guān)抑制霉菌的機理還需進一步地研究。

表3 山蒼子精油主要成分

圖5 山蒼子精油GC-MS總離子流譜圖

2.5 不同添加劑對青貯玉米中霉菌的抑制效果在青貯玉米儲存過程中加入添加劑可防止霉菌生長。在青貯玉米原料中加入化學(xué)添加劑（0.15%丙酸）、山蒼子精油（0.20%），未加入任何添加劑的作為空白對照，45 d后，對霉菌數(shù)量進行統(tǒng)計分析（表4）。結(jié)果顯示，青貯玉米中的霉菌數(shù)量由多到少分別是空白對照>0.15%丙酸處理>0.20%山蒼子精油處理，加入0.15%丙酸和山蒼子精油處理45 d對青貯玉米中霉菌的抑制率分別達到72.4%和98.0%。說明山蒼子精油的抑霉效果遠高于其他化學(xué)添加劑，可作為代替化學(xué)防霉劑的天然生物制劑使用。

表4 青貯玉米中添加不同防霉劑后的霉菌數(shù)量

2.6 山蒼子精油對青貯玉米營養(yǎng)品質(zhì)的影響霉菌影響青貯玉米的營養(yǎng)品質(zhì)，為鑒定山蒼子精油的影響程度，試驗對比了添加0.15%丙酸和0.20%山蒼子精油與空白對照之間的青貯玉米營養(yǎng)品質(zhì)。結(jié)果如表5所示，青貯之前（0 d），玉米的粗蛋白質(zhì)、粗纖維、酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維、脂肪酸和氨基酸的含量分別為7.78%、22.85%、48.73%、38.87%、1.55 g/100 g、95.86 mg/g，隨著青貯時間延長，玉米的營養(yǎng)價值出現(xiàn)流失。加入山蒼子精油防霉劑45 d后，青貯玉米的蛋白、脂肪酸和氨基酸含量顯著高于對照組和0.15%丙酸組（P<0.05）。對照組（45 d）的蛋白、脂肪酸和氨基酸對比對照組（0 d）降低了3%、42%、17%，而加入0.20%山蒼子精油后青貯玉米的粗蛋白質(zhì)、脂肪酸和氨基酸的含量對比對照組（0 d）降低了1%、9%、8%，對比對照組（45 d）的粗蛋白質(zhì)、脂肪酸、氨基酸減少了2%、31%、9%的損失；加入0.15%丙酸后粗蛋白質(zhì)、脂肪酸和氨基酸對比對照組（0 d）降低了6%、45%、21%；說明添加山蒼子精油能顯著減緩青貯玉米蛋白、脂肪酸和氨基酸的損失，并且其效果高于加入化學(xué)添加劑。

表5 山蒼子精油防霉劑對青貯玉米營養(yǎng)品質(zhì)的作用

3 討論

3.1 山蒼子精油的抑霉效果 植物精油能抑制霉菌生長，可通過改變細胞通透性、抑制生物膜合成、減少可溶性蛋白質(zhì)含量、改變細菌形態(tài)結(jié)構(gòu)來影響霉菌的新陳代謝，從而起到抑菌、殺菌作用（Cabral等，2013）。山蒼子精油具有用作生物殺菌劑的潛力，并且可能取代合成殺菌劑。山蒼子精油具有抑制輪枝鐮刀菌的菌絲生長發(fā)育、FB1和FB2合成以及改變形態(tài)結(jié)構(gòu)的作用（Pante等，2021）。Li等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，山蒼子精油可以有效抑制甘草中黃曲霉AFB1的積累（Li等，2016）。

在本試驗中，與對照組相比，在含0.20%山蒼子精油的培養(yǎng)基上霉菌未生長，抑菌率達100%，抑制效果顯著。對山蒼子精油分離到抑霉主要成分為檸檬醛，與Wang等（2018）研究山蒼子精油成分分析結(jié)果一致，Wang等（2018）從山蒼子精油中分離到18個揮發(fā)性化合物，包括α-蒎烯、β-水芹烯、β-蒎烯、檸檬醛、香茅醛等，其中檸檬醛的主要活性成分為α-檸檬醛和β-檸檬醛，相對含量最高。同時，加入化學(xué)添加劑和山蒼子精油后對青貯玉米中霉菌的抑制率分別達到72.4%和98.0%，說明山蒼子精油的抑霉效果遠高于其他化學(xué)添加劑，可代替化學(xué)防霉劑。這與陳梓云等（2021）對山蒼子精油對玉米粉、小麥粉的抑霉以及殷勇等（2021）研究山蒼子精油對辣椒貯藏期間抑霉效果一致。

3.2 山蒼子精油對青貯玉米營養(yǎng)品質(zhì)的影響精油被美國食品和藥物管理局 （FDA）視為“GRAS”（一般認為是安全的）級化學(xué)品，可應(yīng)用于食品行業(yè)中。山蒼子精油來源廣泛，價格低廉，具有副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)勢。根據(jù)GB2760-86標準，我國已批準山蒼子精油用于食品、醫(yī)藥、化工等行業(yè)中（方學(xué)軍，2007）。因此，以山蒼子精油為原料，將其制成食品保鮮劑或藥食同源產(chǎn)品有良好前景。此外，山蒼子精油的抗氧化活性也可以防止農(nóng)產(chǎn)品腐爛（Pante等，2021）。

青貯玉米飼料的營養(yǎng)價值較高，其貯藏期長等優(yōu)勢成為世界公認的草食牲畜不可或缺的優(yōu)質(zhì)飼料（王安貴等，2021）。徐生陽等（2021、2020）研究不同添加劑對青貯羊草的營養(yǎng)品質(zhì)的影響發(fā)現(xiàn)，加入孜然精油有利于保存牧草蛋白質(zhì)，并能提高體外消化率（IVDMD），提高牧草飼料的營養(yǎng)價值。在本試驗中，添加山蒼子精油能減緩青貯玉米中粗蛋白質(zhì)、脂肪酸和氨基酸的損失，而粗纖維、中性洗滌纖維及酸性洗滌纖維的差別不明顯，相比化學(xué)添加劑其效果更好。這說明添加山蒼子精油可保持青貯玉米品質(zhì)，其植物提取物屬性更符合綠色生物防霉劑的選擇目標。目前，有關(guān)山蒼子精油對飼草在儲存過程中對營養(yǎng)品質(zhì)的影響相關(guān)研究很少，生物添加劑的篩選為飼草產(chǎn)品高質(zhì)量發(fā)展提供了新的選擇方向。

4 結(jié)論

從抑菌作用來看，0.20%山蒼子精油可抑制鐮刀菌、黃曲霉、雜色曲霉、青霉、根霉，其主要抑菌成分為檸檬醛。從品質(zhì)調(diào)控來看，在青貯玉米中加入0.20%山蒼子精油可減緩粗蛋白質(zhì)、脂肪酸和氨基酸的損失，效果優(yōu)于化學(xué)添加劑。