基于免疫相關(guān)細(xì)胞因子研究理沖湯對子宮肌瘤細(xì)胞凋亡和增殖的影響

李冬華 劉 宇 王文娜

(首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京，100069)

子宮肌瘤(Uterine Fibroid)是女性生殖系統(tǒng)最常見的良性腫瘤，育齡人群發(fā)病率高達(dá)70%[1-2]。因其可導(dǎo)致月經(jīng)量增多、痛經(jīng)甚至不孕等問題，嚴(yán)重影響女性的身心健康[3-4]，故一直備受學(xué)界重視。目前子宮肌瘤的病因尚不完全明確。子宮肌瘤不僅病程較長，而且會伴隨諸多的臨床癥狀。對于體積較大的肌瘤，臨床上通常采用子宮切除術(shù)的終極治療手段，但對于要求保留子宮的肌瘤患者來說這樣的手術(shù)方法往往難以接受。雖然有肌瘤剔除術(shù)可供選擇，但其存在較高的術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[5]，也不是理想的解決方案?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要使用激素類藥物，如促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing Hormone，GnRH)激動劑、米非司酮等，雖然臨床療效明確，但嚴(yán)重的不良反應(yīng)及潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)限制了其長期使用，而且還存在著停藥后極易復(fù)發(fā)等問題[6-7]。目前子宮肌瘤尚缺少理想的治療藥物，因此臨床上仍存在部分患者的治療需求無法得到滿足的問題。

理沖湯是治療子宮肌瘤的中醫(yī)經(jīng)典名方，大量臨床實(shí)踐證實(shí)該方可明顯縮小肌瘤體積，顯著改善臨床癥狀，對子宮肌瘤具有較為理想的療效。前期研究表明理沖湯可抑制腫瘤新生血管生成、阻礙細(xì)胞外基質(zhì)降解以及抑制腫瘤免疫逃逸[8-10]，提示理沖湯對子宮肌瘤微環(huán)境具有改善作用。但是理沖湯調(diào)控免疫應(yīng)答抗子宮肌瘤的作用機(jī)制還不是十分清楚，目前仍存留著諸多科學(xué)問題值得被人們深入研究。因此，本研究通過透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，采用免疫組織化學(xué)染色檢測胱天蛋白酶-3、Ki67的表達(dá)情況，以及使用MSD電化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測白細(xì)胞介素-12p70(Interleukin-12p70，IL-12p70)、IL-1β、IL-6、生長相關(guān)癌基因/角質(zhì)形成細(xì)胞趨化蛋白(Growth-related Oncogene/Keratinocyte Chemoattractant，GRO/KC)的表達(dá)水平，研究理沖湯調(diào)控免疫相關(guān)細(xì)胞因子，促進(jìn)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，為理沖湯的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 CB-17 Scid小鼠[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司，SCXK(京)2016-0001]，雌性，未孕，6～9周齡，共24只，飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部，溫度為25～27 ℃，恒濕為45%～50%，飼養(yǎng)環(huán)境為無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級。本研究通過倫理委員會審批(倫理審批號：AEEI-2017-115)。

1.1.2 藥物 理沖湯的藥物組成為生黃芪9 g、黨參6 g、白術(shù)6 g、生山藥15 g、天花粉12 g、知母12 g、三棱9 g、莪術(shù)9 g、生雞內(nèi)金9 g，上述藥物均購自北京同仁堂飲片有限責(zé)任公司。制備工藝如下，飲片水提2次，煎煮1 h/次，首次加入飲片的8倍量水，第2次加6倍量水，煎成之時(shí)，加少許好醋。合并2次煎液，溫度為60 ℃，壓力為0.05 kPa的條件下過濾減壓，濃縮至浸膏(相對密度為1.3)。最終配置成含生藥1.7 g/mL的濃縮液，-4 ℃低溫保存。

米非司酮(北京紫竹藥業(yè)有限公司，批號：43110911)，用0.5%羧甲基纖維素鈉(Sigma公司，美國，批號：C5678)配制成懸液，濃度為0.7 mg/mL。黃體酮注射液(上海通用公司，批號：130905)；苯甲酸雌二醇注射液(天津金耀氨基酸公司，批號：0703121)；堿性成纖維細(xì)胞生長因子(Signalway Antibody公司，美國，批號：70402)；表皮生長因子(Signalway Antibody公司，美國，批號：70504)。

1.1.3 試劑與儀器 MSD試劑盒(上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司，批號：K15048D-1)；光學(xué)顯微鏡(Olympus公司，日本，型號：CX31)；MSD超敏因子電化學(xué)發(fā)光分析儀(MSD公司，美國，型號：Quick-Plex SQ120)。

1.2 方法

1.2.1 分組和異種移植小鼠子宮肌瘤模型的建立 將24只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字法分為正常組、模型組、理沖湯組和陽性藥組，每組6只。人子宮肌瘤樣本來源于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院因患子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)者，確?；颊咧辽僭谛g(shù)前3個(gè)月未接受過其他藥物治療，實(shí)驗(yàn)樣本通過組織病理學(xué)證實(shí)。取子宮肌瘤組織1 cm3左右，迅速置于磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)(含3%青鏈霉素)中，封閉冰浴轉(zhuǎn)移至細(xì)胞間。把組織塊盡可能切成糜狀，Ⅰ型膠原酶消化約2 h，使用70 μm細(xì)胞篩收集細(xì)胞。細(xì)胞在20%胎牛血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)，傳至2～3代時(shí)將細(xì)胞濃度調(diào)整為1.5×106個(gè)/mL用于細(xì)胞異種移植手術(shù)。除正常組外，其他小鼠腹腔注射雌、孕激素7 d以促進(jìn)子宮發(fā)育。使用戊巴比妥鈉麻醉小鼠，剖腹探查術(shù)剝離Y形子宮，在子宮左側(cè)分角處注入表皮生長因子(0.5 ng/mL)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(2 ng/mL)。注射器吸取100 μL子宮肌瘤細(xì)胞懸液，并與伊文思藍(lán)混合(使注射位點(diǎn)可視化)后注入小鼠子宮右側(cè)分角處，操作結(jié)束后逐層縫合腹膜切口。28 d后各組選取1只小鼠進(jìn)行子宮病理學(xué)鑒定，當(dāng)平滑肌有明顯紊亂或增厚，視為模型制備成功。

1.2.2 藥物干預(yù) 理沖湯組每日灌服理沖湯濃縮液(30 g/kg)。陽性藥組每日灌服米非司酮懸液(2.9 mg/kg)。正常組和模型組每日灌以等量的0.9%氯化鈉溶液。連續(xù)藥物干預(yù)28 d。

1.2.3 檢測方法 透射電子顯微鏡：切取子宮組織1 mm3，戊二醛固定液固定24 h。PBS沖洗3次，加入1%鋨酸，靜置處理1 h。4 ℃環(huán)境下進(jìn)行乙醇梯度脫水3次，之后按1∶1比例配制90%乙醇和90%丙酮混合溶液再次脫水，最后于室溫環(huán)境下100%丙酮中脫水。將組織樣品逐梯度滲透，使包埋劑浸入組織細(xì)胞內(nèi)，之后烘箱進(jìn)行固化。采用超薄切片機(jī)將組織塊切片，切片面積控制在0.5 mm×0.3 mm之內(nèi)，厚度為10～100 μm。檸檬酸鉛和醋酸雙氧鈾染色后，切片移至電鏡下進(jìn)行觀察。

免疫組織化學(xué)染色：使用多聚甲醛固定子宮肌瘤組織，常規(guī)浸蠟、包埋，切成厚度約為5 μm的組織切片。切片常規(guī)脫蠟后進(jìn)行抗原修復(fù)，再浸泡在3% H2O2溶液中，室溫避光25 min。10%正常兔血清封閉后，加入一抗，濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。次日加入二抗室溫孵育50 min。DAB顯色和細(xì)胞核復(fù)染，中性樹膠封片。鏡下觀察拍照，ImageJ軟件對圖片進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

MSD電化學(xué)發(fā)光技術(shù)：將配置完成的標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶室溫平衡15 min，渦旋震蕩，標(biāo)準(zhǔn)品原液4倍稀釋，樣本和質(zhì)控品稀釋2倍。用200 μL洗滌液反復(fù)清洗MSD板3次，每孔加入50 μL樣品，室溫下孵育2 h，每孔中25 μL檢測抗體，室溫孵育2 h，之后加入150 μL的讀板液，使用MSD設(shè)備讀板分析。

2 結(jié)果

2.1 采用透射電鏡觀察子宮平滑肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu) 正常組的子宮平滑肌細(xì)胞呈長梭形，排列整齊，相鄰細(xì)胞體積一致，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整。細(xì)胞核明顯，核仁位于中央，無腫大或固縮。胞質(zhì)內(nèi)各細(xì)胞器數(shù)量、結(jié)構(gòu)均正常；模型組的子宮平滑肌細(xì)胞肥大，細(xì)胞間隙增寬，排列不規(guī)則，細(xì)胞周圍存在大量纖維結(jié)締組織。細(xì)胞膜增厚、缺損，界限不清。細(xì)胞核有明顯皺縮，核仁模糊不清甚至消失。細(xì)胞器均有不同程度的腫大變形，可見線粒體基質(zhì)變淺，嵴變短，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，內(nèi)部形成空泡；理沖湯組的子宮平滑肌細(xì)胞形態(tài)正常，排列有序，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，僅有少量胞膜增厚。細(xì)胞核清晰，呈輕度固縮，核仁無異常。線粒體與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量較模型組明顯減少，部分輕微腫大；陽性藥組的子宮平滑肌細(xì)胞排列紊亂程度較模型組顯著減輕，但細(xì)胞間隙寬窄不等，其間可見少量纖維結(jié)締組織。細(xì)胞膜大體完整，個(gè)別部位有破損，胞膜增厚不明顯。細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，核膜完整，核仁位于中央，略有皺縮。少量發(fā)達(dá)的線粒體圍繞于胞核周圍，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹不明顯。見圖1。

圖1 子宮平滑肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)(×8 000)

2.2 采用免疫組織化學(xué)染色檢測胱天蛋白酶-3、Ki67的表達(dá)情況 與正常組比較，模型組胱天蛋白酶-3表達(dá)明顯降低，Ki67的陽性率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，理沖湯組和陽性藥組的胱天蛋白酶-3的表達(dá)明顯升高，Ki67的陽性率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 子宮組織中胱天蛋白酶-3、Ki67表達(dá)情況

胱天蛋白酶-3主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，表達(dá)胱天蛋白酶-3的細(xì)胞被染成棕黃色。Ki67主要表達(dá)于細(xì)胞核中，表達(dá)Ki67的細(xì)胞核被染成紅色。由此可看出較之于正常組，模型組中的平滑肌細(xì)胞和腺體細(xì)胞中Ki67的表達(dá)較為豐富，胱天蛋白酶-3的表達(dá)較少，而理沖湯組和陽性藥組中Ki67的表達(dá)較少，但胱天蛋白酶-3的表達(dá)增多。見圖2、3。

圖2 4組胱天蛋白酶-3的表達(dá)情況(免疫組織化學(xué)染色，×200)

圖3 4組Ki67的表達(dá)情況(免疫組織化學(xué)染色，×200)

2.3 4組IL-12p70、IL-1β、IL-6、GRO/KC的表達(dá)情況 與正常組比較，模型組IL-12p70的表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，理沖湯組IL-12p70的表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，陽性藥組IL-12p70表達(dá)升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

與正常組比較，模型組IL-1β、IL-6、GRO/KC的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，理沖湯組的IL-1β、IL-6、GRO/KC的表達(dá)明顯降低(P<0.05，P<0.01)，陽性藥組僅IL-6表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，IL-1β、GRO/KC變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 子宮組織中IL-12p70、IL-1β、IL-6、GRO/KC表達(dá)情況

3 討論

腫瘤的發(fā)病和人體自身免疫應(yīng)答異常有著非常緊密的關(guān)系?，F(xiàn)代免疫編輯理論認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生發(fā)展在患者體內(nèi)要經(jīng)歷3個(gè)階段：清除、平衡、逃逸[11]。早期新生腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗原性，易被免疫系統(tǒng)識別并清除。如果此時(shí)腫瘤細(xì)胞逃脫免疫系統(tǒng)的“清除”功能，即會進(jìn)入“平衡”狀態(tài)，此階段腫瘤細(xì)胞的抗原性減弱，不易被免疫系統(tǒng)識別和清除。當(dāng)這種“積累效應(yīng)”達(dá)到一定程度時(shí)，就會打破平衡，最終實(shí)現(xiàn)免疫逃逸，形成實(shí)體腫瘤[12]。腫瘤發(fā)生的實(shí)質(zhì)即是機(jī)體抗腫瘤免疫系統(tǒng)逐漸步入劣勢，腫瘤細(xì)胞逐漸趨于強(qiáng)勢的過程。

在子宮肌瘤形成的過程中，免疫微環(huán)境內(nèi)的不同細(xì)胞因子發(fā)揮了不同作用。IL-12p70是抗腫瘤免疫應(yīng)答反應(yīng)中的重要細(xì)胞因子。目前有研究證實(shí)，IL-12p70可以增強(qiáng)CD8+T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞對腫瘤的殺傷作用[13]。同時(shí)，IL-12p70還可以誘導(dǎo)免疫淋巴細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素，進(jìn)而改變腫瘤細(xì)胞增殖周期，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[14]。IL-1β與腫瘤的增殖、分化及侵襲過程密切相關(guān)。IL-1β在產(chǎn)生生物活性前，需要經(jīng)過胱天蛋白酶-1的剪切加工，IL-1β成為成熟體后可以介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Cell Growth Factor，VEGF)的生成，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤新生血管的形成，促進(jìn)腫瘤生長[15]。IL-6主要通過JAK激酶2(Janus Kinase 2，JAK2)以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signal Transduction and Activator of Transcription 3，STAT3)信號通路促進(jìn)局部炎癥反應(yīng)的發(fā)生，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。腫瘤細(xì)胞同樣通過STAT3信號通路促進(jìn)IL-6的分泌[16]。腫瘤生長相關(guān)基因(Growth Related Oncogene)GRO/KC是ELR-CXC趨化因子家族中的一員，GRO與受體CXCR2結(jié)合可誘發(fā)多種生理效應(yīng)，如炎癥反應(yīng)、病毒感染等[17]。近年來發(fā)現(xiàn)，GRO在肺癌、胃癌、膀胱癌等癌癥中呈高表達(dá)狀態(tài)，后續(xù)研究也證實(shí)GRO與腫瘤的增殖、侵襲等過程具有一定相關(guān)性[18]。胱天蛋白酶-3是細(xì)胞凋亡通路下游的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)水平反映了細(xì)胞的凋亡程度。通常胱天蛋白酶-3在細(xì)胞質(zhì)中處于無活性狀態(tài)，凋亡程序啟動時(shí)胱天蛋白酶-3被激活，并對局部結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行切割，最終引起細(xì)胞凋亡[19]。抑制細(xì)胞增殖因子Ki67分布于細(xì)胞核內(nèi)，其活性與細(xì)胞增殖過程密切相關(guān)，是衡量細(xì)胞增殖水平的標(biāo)志物，也是評估腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)[20]。

理沖湯是治療正虛血瘀型子宮肌瘤的中醫(yī)經(jīng)典名方，出自張錫純所著醫(yī)書《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，用來治療“婦女閉經(jīng)不行或產(chǎn)后惡露不盡，……治一切臟腑癥瘕、積聚、氣郁、脾弱、滿悶、痞脹、不能飲食”。該方具有扶正祛瘀之功效，為消補(bǔ)兼施的良方。方中黃芪與黨參為君藥，用以扶正祛邪、益氣活血，使瘀血去，新血生；三棱與莪術(shù)為臣藥，以活血祛瘀；白術(shù)、山藥、知母、天花粉共為佐藥，其中白術(shù)、山藥補(bǔ)氣健脾，助參芪扶正，防化瘀太過傷氣，知母、天花粉涼潤解毒，可制參芪之熱，又可滋腎水之枯；生雞內(nèi)金為使藥，消積散結(jié)而不傷正。理沖湯配伍嚴(yán)謹(jǐn)，用藥精當(dāng)，攻補(bǔ)兼施，體現(xiàn)了扶正祛邪兼顧，消癥瘕而不傷正，益氣血而不留瘀的特點(diǎn)。因此，理沖湯被廣泛應(yīng)用于治療正虛血瘀之婦科癥瘕，十分契合子宮肌瘤的中醫(yī)病機(jī)。

本研究結(jié)果顯示，理沖湯能夠改善子宮組織的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡因子胱天蛋白酶-3的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖因子Ki67的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)IL-12p70，抑制IL-1β、IL-6、GRO/KC的表達(dá)，說明理中湯可以通過調(diào)控免疫相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平進(jìn)而促進(jìn)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡、抑制其細(xì)胞增殖，達(dá)到抑制子宮肌瘤的目的。

中醫(yī)藥治療子宮肌瘤具有突出優(yōu)勢，但基礎(chǔ)研究較為薄弱，存在著物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理作用機(jī)制不明確等問題，一定程度上阻礙了中醫(yī)藥進(jìn)一步邁向科學(xué)化和國際化的進(jìn)程。本研究闡釋了理沖湯在免疫調(diào)控方面的部分作用機(jī)制，旨在為理沖湯的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，為中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展做出積極貢獻(xiàn)。