基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討沙參麥冬湯治療肺癌的作用機(jī)制

李桂民 李耀輝 李 哲 曾 璐 見婷雯

(1 陜西中醫(yī)藥大學(xué)，西安，712046；2 陜西省中醫(yī)醫(yī)院，西安，710003；3 中國中醫(yī)科學(xué)院發(fā)展研究中心，北京，100700)

肺癌是我國乃至世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]，據(jù)全球腫瘤統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(GLOBOCAN)估計(jì)2018年全球有209萬肺癌新發(fā)患者占癌癥發(fā)病總數(shù)的11.6%，以及176萬死亡患者占癌癥總數(shù)18.4%[2]，我國癌癥中心估計(jì)每年新發(fā)肺癌約為78.7萬例，死亡約為63.1萬，發(fā)病率和死亡率居所有癌癥的首位[3]。證據(jù)研究表明吸煙、職業(yè)接觸致癌物、空氣污染、既往肺部疾病等都會(huì)增加患肺癌風(fēng)險(xiǎn)，其中吸煙是最主要的肺癌致病因素[4]。早期肺癌患者臨床癥狀不明顯，篩查診斷難度大，肺癌發(fā)現(xiàn)后多為中晚期且預(yù)后極差，接受一線化療肺癌患者的總生存率中位數(shù)為7～12個(gè)月，肺癌嚴(yán)重威脅人類的生命健康[5]。目前手術(shù)治療、放療、化療、靶向治療是肺癌主要治療手段，但這些方法對(duì)中晚期患者都不能達(dá)到較好療效。同時(shí)放化療靶向治療給患者帶來疼痛、惡心嘔吐、厭食、乏力、便秘、骨髓抑制等嚴(yán)重不良反應(yīng)，同時(shí)大部分患者伴有恐懼、焦慮、抑郁等精神問題，這些都嚴(yán)重影響患者預(yù)后[6]。因此減少患者痛苦、延長生存周期、改善生命質(zhì)量是肺癌治療重要方向。中藥聯(lián)合放化療很好切合了這一方向，使更多患者受益。

沙參麥冬湯出自清代名醫(yī)吳鞠通的《溫病條辨》，全方由沙參、麥冬、玉竹、天花粉、扁豆、甘草、桑葉組成，是清養(yǎng)肺胃、生津潤燥代表方劑。肺癌中醫(yī)證候梳理顯示放化療及靶向治療患者多以陰虛內(nèi)熱、氣陰兩虛多見，沙參麥冬湯是益氣養(yǎng)陰良方，臨床研究證實(shí)可以有效改善肺癌患者臨床癥狀[7]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明沙參麥冬湯可以減少化療藥物導(dǎo)致的不良反應(yīng)，提高患者免疫功能，下調(diào)血清缺氧誘導(dǎo)因子-1α、誘生型一氧化氮合酶、血管生成素-2水平，改變腫瘤基因表達(dá)[8-9]?；颊卟涣挤磻?yīng)降低，治療耐受性提高達(dá)到更好的治療效果?，F(xiàn)為進(jìn)一步研究沙參麥冬湯治療肺癌的藥物作用機(jī)制，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選沙參麥冬湯的主要活性成分、作用靶點(diǎn)、信號(hào)通路及潛在網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，探討其治療肺癌的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 沙參麥冬湯成分與靶點(diǎn)收集 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫[10]，檢索沙參、麥冬、玉竹、天花粉、扁豆、甘草、桑葉全部化學(xué)成分，以口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18為條件篩選主要成分并收集化合物對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，由于TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得“扁豆、玉竹、天花粉”成分較少，且沒有“麥冬”化學(xué)成分，故通過中醫(yī)分子機(jī)制生物學(xué)信息分析工具(BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)[11]進(jìn)行補(bǔ)充，以Score cutoff≥20且P-value cutoff<0.05為篩選條件。將2個(gè)數(shù)據(jù)庫得到的成分靶點(diǎn)去除重復(fù)后合并，得到沙參麥冬湯的成分靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集，借助UniProt(https://www.uniprot.org)數(shù)據(jù)庫對(duì)基因名進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理[12]。

1.2 肺癌靶點(diǎn)收集 以“Lung Cancer”“Small Cell Lung Cancer”“Non-Small Cell Lung Cancer”為疾病檢索詞，分別在GeneCards(https://www.genecards.org)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，http://www.omim.org)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca)進(jìn)行搜索，收集肺癌疾病相靶點(diǎn)。

1.3 “活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖的繪制 將獲取的成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)通過Venny2.1.0平臺(tái)進(jìn)行映射得到交集靶點(diǎn)，運(yùn)用Cytoscape 3.8.0軟件繪制“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，并根據(jù)度值(Degree)，篩選出沙參麥冬湯核心成分。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將共有基因?qū)隨TRING(https://string-db.org)數(shù)據(jù)庫獲取蛋白相互作用關(guān)系并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，將獲得的TSV文件導(dǎo)入Cytoscape利用CytoNCA內(nèi)置插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，最終得到核心蛋白。

1.5 基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析 將成分與疾病共有靶點(diǎn)錄入Metascape(http://metascape.org/gp/index.html)平臺(tái)[13]，分析其主要的生物學(xué)過程與代謝通路并進(jìn)行富集分析，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理。將富集分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape繪制“方劑-活性成分-交集靶點(diǎn)-肺癌-信號(hào)通路”圖。

1.6 分子對(duì)接 計(jì)算“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖中活性成分的度值，將Degree>25的6個(gè)活性成分與查閱文獻(xiàn)后保留6個(gè)密切度高的核心蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，在PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)獲取活性成分的2D結(jié)構(gòu)，并借助Chem3D軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化。PDB(http://www.rcsb.org)數(shù)據(jù)庫獲取蛋白結(jié)構(gòu)，通過AutoDockTools軟件進(jìn)行處理蛋白和小分子配體，AutoDock-Vina進(jìn)行分子對(duì)接計(jì)算結(jié)合能，Pymol進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 沙參麥冬湯活性成分與靶點(diǎn)篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共獲得活性成分141個(gè)，其中沙參9個(gè)、玉竹8個(gè)、扁豆1個(gè)、桑葉29個(gè)、天花粉2個(gè)、甘草92個(gè)，TCMSP數(shù)據(jù)庫未收錄麥冬。在BATMAN-TCM檢索麥冬20個(gè)活性成分，因扁豆、玉竹、天花粉檢索成分較少，所以通過BATMAN-TCM予以補(bǔ)充，其中扁豆10個(gè)、玉竹12個(gè)、天花粉8個(gè)。整合2個(gè)數(shù)據(jù)庫刪除重復(fù)成分，因此共獲得沙參麥冬湯活性成分192個(gè)，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)3 585個(gè)，刪除重復(fù)值后對(duì)應(yīng)化合物靶點(diǎn)有866個(gè)。

2.2 肺癌靶點(diǎn)整合 將3個(gè)數(shù)據(jù)庫檢索的肺癌靶點(diǎn)進(jìn)行整合，OMIM獲得508個(gè)，GeneCards獲得11 573個(gè)，根據(jù)文獻(xiàn)經(jīng)驗(yàn)Score值越大相關(guān)性越強(qiáng)，通過(Relevance Score≥16.85)篩選獲得1 450個(gè)，DrugBank獲得310個(gè)，去除重復(fù)值得到1 910個(gè)疾病基因。將疾病基因與藥物靶點(diǎn)取交集，獲得共有基因191個(gè)。見圖1。

圖1 藥物-疾病交集靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 “中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖”的分析 將191個(gè)共有靶點(diǎn)使用Cytoscape 3.8.0構(gòu)建的“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖包含330個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 750條邊。并通過內(nèi)置數(shù)據(jù)分析計(jì)算出每個(gè)節(jié)點(diǎn)的度值(Degree)，度值越大則表示該化合物發(fā)揮治療作用的可能越大。通過網(wǎng)絡(luò)分析篩選出度值最大的10個(gè)成分?；衔餅?Quercetin、Stigmasterol、Beta-Carotene、Kaempferol、Beta-Sitosterol、Glabrene、Naringenin、Arachidonic Acid、Formononetin、Glabridin。見表1。因此我們預(yù)測(cè)上述10個(gè)化合物可能是沙參麥冬湯治療肺癌的重要成分。見圖2。

表1 度值前10活性成分

圖2 “中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將獲得的數(shù)據(jù)錄入Cytoscape進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，得到106個(gè)節(jié)點(diǎn)，742條邊。平均Degree值為7，PPI網(wǎng)絡(luò)圖Degree值越大顏色越深節(jié)點(diǎn)越大。見圖3。CytoNCA是蛋白互作網(wǎng)絡(luò)集中性分析和評(píng)估的算法之一,使用CytoNCA插件對(duì)核心聚類蛋白進(jìn)行分析，以Betweenness、Closeness、Degree、Eigenvector、Information、LAC等6個(gè)值為篩選條件,篩選流程見圖4。經(jīng)過2次篩選得到10個(gè)基因核心互作網(wǎng)絡(luò)。見表2。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 CytoNCA篩選流程

表2 CytoNCA核心蛋白

2.5 GO富集分析 借助Metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO富集分析，得到2 684條生物過程(BP)，主要與無機(jī)物的反應(yīng)、血管發(fā)育、凋亡信號(hào)通路、細(xì)胞死亡的正調(diào)控、細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)控、細(xì)胞分化負(fù)調(diào)控等功能有關(guān)；得到117條細(xì)胞組分(CC)，主要與轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物、細(xì)胞體、細(xì)胞外基質(zhì)、早期內(nèi)小體、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)等有關(guān)；得到210條分子功能(MF)，主要與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、激酶結(jié)合、蛋白質(zhì)同聚活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合等功能相關(guān)。根據(jù)富集基因數(shù)目繪制柱狀圖。見圖5。

圖5 交集靶點(diǎn)GO富集分析

2.6 KEGG通路分析 使用Metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG富集分析，得到366條富集通路，結(jié)果顯示基因主要富集在癌癥途徑、TNF信號(hào)通路、蛋白多糖在癌癥中的作用、癌組織中的微RNA、鉑耐藥、腫瘤的轉(zhuǎn)錄調(diào)控失調(diào)、核因子κB信號(hào)通路等信號(hào)通路。見圖6。使用Cytoscape繪制“沙參麥冬湯-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-肺癌-信號(hào)通路”見圖7。

圖6 交集靶點(diǎn)KEGG富集分析

圖7 “沙參麥冬湯-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)-肺癌-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 分子對(duì)接分析 為了進(jìn)一步探討沙參麥冬湯對(duì)肺癌的作用關(guān)系，借助AutoDock Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接，將度值最高的6個(gè)活性成分(Quercetin、Stigmasterol、Beta-Carotene、Kaempferol、Beta-Sitosterol、Naringenin)與6個(gè)密切度最高的蛋白(STAT3、MAPK14、TP53、TNF、IL-6、MYC)進(jìn)行分子對(duì)接。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)研究成分與蛋白結(jié)合自由能小于-5 kcal/mol(1 cal=4.184 J)認(rèn)為二者結(jié)合穩(wěn)定[14]。結(jié)果顯示活成成分與蛋白結(jié)合能均小于-5 kcal/mol。見表3。以上對(duì)接結(jié)果表明了沙參麥冬湯中活性成分與肺癌的靶點(diǎn)基因有著很好的結(jié)合作用。

表3 核心活性化合物與核心蛋白結(jié)合能(kcal/mol)

圖8 部分蛋白和活性成分分子對(duì)接圖

3 討論

肺癌是嚴(yán)重威脅人類生命健康的惡性腫瘤，沙參麥冬湯聯(lián)合放化療治療肺癌有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)?，F(xiàn)代藥理研究表明麥冬湯具有提高人體免疫力、保護(hù)胃黏膜、抗炎、抗腫瘤的作用[15]。通過上調(diào)Smad7信號(hào)變大與抑制TGF-β1信號(hào)通路，減緩腫瘤微環(huán)境及腫瘤血管生成，而控制人類癌細(xì)胞的生長、黏附和轉(zhuǎn)移[16]。降低患者白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α水平，減輕炎癥反應(yīng)[17]。提高患者CD3+T、CD4+T淋巴細(xì)胞比例，提高CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值，提高患者免疫力，減輕患者惡心、嘔吐、腹瀉、食欲不振、乏力等不良反應(yīng)[9,18-19]。

本研究通過對(duì)沙參麥冬湯的活性成分篩選，發(fā)現(xiàn)槲皮素、豆甾醇、β-胡蘿卜素、山柰酚、β-谷甾醇、柚皮素、花生四烯酸等化合物分子與肺癌的靶點(diǎn)具有高度活性。基礎(chǔ)研究報(bào)道槲皮素具有抑制腫瘤細(xì)胞傳導(dǎo)、增強(qiáng)化療敏感性、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或自噬等作用，通過激活A(yù)MPK-mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞自噬抑制細(xì)胞增殖[20]。抑制ADAM9(解整聯(lián)蛋白和金屬蛋白酶家族成員)的表達(dá)，降低肺癌細(xì)胞的侵襲能力，促進(jìn)組織纖溶酶原激活物介導(dǎo)的遷移蛋白的裂解抑制細(xì)胞遷移和侵襲，還可以抑制腫瘤骨轉(zhuǎn)移并延長壽命[21]。豆甾醇具有抗炎、抗氧化、抗癌的藥理作用，抑制肝癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，降低腫瘤壞死因子-α的轉(zhuǎn)錄，破壞腫瘤血管生成抑制膽管癌生長，通過抑制JAK/STAT信號(hào)通路，降低胃癌細(xì)胞增殖遷移，與肺癌的關(guān)聯(lián)性有待研究證明[22]。β-胡蘿卜素具有抗氧化作用，通過抑制細(xì)胞核分裂，誘導(dǎo)肺癌YTMLC-90細(xì)胞凋亡[23]，調(diào)節(jié)DNA甲基化，修復(fù)DNA損傷，增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)，同時(shí)攝入β-胡蘿卜素可以降低患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)[24]。山柰酚是一種可以抑制腫瘤發(fā)生的飲食類黃酮，研究證明山柰酚抑制肺癌A549細(xì)胞形成和損傷修復(fù)，通過TGF-β通路降低癌細(xì)胞侵襲和遷移能力[25]，調(diào)節(jié)miR21/PTEN信號(hào)通路抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖[26]。上調(diào)miR-340的表達(dá)使PI3K/AKT通路失活而抑制肺腺癌A549細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬[27]。β-谷甾醇抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,發(fā)揮抗腫瘤作用[28]。柚皮素通過P38 MAPK通路誘導(dǎo)細(xì)胞肺癌發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，使A549細(xì)胞產(chǎn)生凋亡和增殖抑制[29]，抑制TNF-α的血管平滑肌細(xì)胞因子，限制腫瘤細(xì)胞生長并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[30]。由此可見，這些活性成分通過影響癌細(xì)胞周期、凋亡、增殖、侵襲，血管生成、轉(zhuǎn)移和炎癥等多途徑實(shí)現(xiàn)抗癌作用，是沙參麥冬湯治療肺癌的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將獲得的191個(gè)疾病藥物共有靶點(diǎn)進(jìn)行PPI核心網(wǎng)絡(luò)分析，得到10個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)為JUN、MAPK8、MYC、MAPK14、STAT3、MAPK1、RELA、TP53、IL-6。其中MAPK8、MAPK14、MAPK1皆為促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogenactivated Protein Kinase，MAPK)家族蛋白。MAPK調(diào)控異常與腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲密切相關(guān)[31]。JUN是活化蛋白-1(Activating Protein-1,AP-1)轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)鍵亞基，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化中起著至關(guān)重要的作用，與多種蛋白和信號(hào)通路直接相互作用使癌細(xì)胞的增殖抑制[32]。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal Transduction and Activator of Transcription，STAT)3的激活與惡性腫瘤之間的關(guān)系十分密切，是致癌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要分子，直接參與肺癌的發(fā)生發(fā)展[33]，提高肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。腫瘤蛋白P53(Tumor Protein P53，TP53)是腫瘤相關(guān)性較高的抑癌基因，在肺癌中易發(fā)生基因突變，破壞腫瘤抑制因子的功能，對(duì)臨床用藥和預(yù)后具有指導(dǎo)意義[34-35]。MYC可以消除干擾素反應(yīng)性的障礙，增強(qiáng)T細(xì)胞的吸引力，并引起直接的抗腫瘤細(xì)胞增殖作用[36]。沙參麥冬湯的以上靶點(diǎn)發(fā)揮了對(duì)肺癌的治療功效，分子對(duì)接驗(yàn)證了篩選的有效成分和蛋白靶點(diǎn)之間密切結(jié)合。

在KEGG候選靶標(biāo)的通路富集分析中，蛋白多糖在癌癥中充當(dāng)癌癥生物學(xué)的負(fù)調(diào)節(jié)劑，抑制生長信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)影響細(xì)胞增殖，作用于血管內(nèi)皮生長因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)腫瘤中的血管生成[37]。作用于上皮細(xì)胞黏附分子從而在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的黏附和遷移[38]。TNF信號(hào)通路屬腫瘤壞死因子超家族。參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物過程的調(diào)節(jié)。研究表明微RNAs參與了肺癌的發(fā)病機(jī)制，參與細(xì)胞生長、凋亡、發(fā)育和分化等多種生物學(xué)過程[39]。微RNA-134被證明能調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換，降低EGFR的表達(dá)抑制腫瘤生長?？勺鳛楸砥どL因子受體靶向治療的抗腫瘤藥物[40]；微RNA-34a通過調(diào)節(jié)Bcl-2、SIRT1、E2F3、Fra-1通路能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞遷移和腫瘤生長[41]；微RNA-31通過靶向BAP-1mRNA降低BAP-1蛋白水平，誘導(dǎo)肺癌增殖和抑制凋亡[42]。微RNA15/16直接調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞周期蛋白D1、D2和E1，誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1期阻滯[43]，微RNA-16通過靶向Bcl-2使對(duì)紫杉醇耐藥肺癌細(xì)胞重新敏感[44]。核因子κB信號(hào)通路與惡性腫瘤的發(fā)展關(guān)系密切，能抑制腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、干預(yù)炎癥，過度活化干擾腫瘤微環(huán)境，改變腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特征，加劇腫瘤發(fā)展[45]。

綜上所述，沙參麥冬湯治療肺癌的作用機(jī)制，是中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多通路、協(xié)同治療的過程，沙參麥冬湯可能通過槲皮素、豆甾醇、山柰酚等成分與STAT3、MAPK1、TP53等蛋白結(jié)合，通過蛋白多糖、微RNA、腫瘤的轉(zhuǎn)錄調(diào)控失調(diào)等信號(hào)通路，通過影響細(xì)胞周期、凋亡、增殖、自噬，腫瘤血管生成，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，減少炎癥反應(yīng)，提高機(jī)體免疫能力，提高化療藥物敏感性等多方面達(dá)到肺癌協(xié)同治療作用。