基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對紫蘇-百合藥對治療原發(fā)性失眠的作用機制研究

王振亦 常 澤 胡文悅 林景峰 王育純 馬華萍 劉甘露 韓振蘊

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京，100078；2 北京中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院(龍崗)，深圳，518172)

失眠是指盡管有合適的睡眠機會和睡眠環(huán)境，卻依然對睡眠時間和(或)質(zhì)量感到不滿足，并且影響日間社會功能的一種主觀體驗，是最常見的睡眠問題之一[1]。失眠分為原發(fā)性失眠和繼發(fā)性失眠，其中原發(fā)性失眠是指不是因其他疾病、精神障礙和藥物/物質(zhì)濫用所引起的失眠[2]。

中醫(yī)古籍中多稱失眠為“不寐”“目不瞑”“不得眠”等，現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)稱謂相同[3]。紫蘇-百合是中醫(yī)治療失眠的對藥，國醫(yī)大師王琦治療失眠的常用方“高枕無憂湯”就有此藥對[4]。兩藥相合為用最早見于《侶山堂類辨》，其載“余植百合，其花朝開暮合，紫蘇之葉，朝挺暮垂，俱能引陽氣而歸陰分”[5]，但書中并不用本方治療失眠。后陳修園在其著作《醫(yī)學(xué)實在易》中，以上述理論為基礎(chǔ)，用百合、紫蘇、龍骨、牡蠣、茯神、棗仁等治療“陽不歸陰”的失眠[6]。后近代名醫(yī)范文甫以此二藥治療黃振聲“苦不寐，百藥不能治”，最后“三貼而安”[7]。

中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究旨在從系統(tǒng)層次和分子水平揭示中藥方劑的奧秘,促進中藥研究從當(dāng)前的“單一靶標(biāo)，單一藥物”模式轉(zhuǎn)向“網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)，多成分藥物”的新模式[8]。李梢教授在1999年提出了中醫(yī)藥與分子網(wǎng)絡(luò)之間的可能關(guān)系[9]，這一猜想的提出成為了中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的開端。在此之后，李梢教授搭建了中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究框架，并進行了對寒/熱中藥配伍和寒/熱證候的研究[10-11]。在2013年，李梢教授首次運用其建立的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究平臺，進行了清絡(luò)飲(苦參、青風(fēng)藤、黃柏、萆薢)與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的研究，這一研究不僅預(yù)測了清絡(luò)飲的活性成分和協(xié)同成分，而且還解釋了該配方的組合規(guī)則。并且得到了文獻證據(jù)的證實，證明了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的可行性[12]?！妒澜缰嗅t(yī)藥》雜志于2021年發(fā)布了《網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評價方法指南》，為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的規(guī)范發(fā)展提供了基礎(chǔ)[13]。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)策略，通過目前已有的在線數(shù)據(jù)庫，挖掘并整理紫蘇-百合藥對的入血成分及相關(guān)作用靶點，并與疾病數(shù)據(jù)庫中的原發(fā)性失眠靶點相匹配，篩選共有靶點。然后通過基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信號通路富集分析，篩選得到紫蘇-百合藥對治療原發(fā)性失眠的相關(guān)通路，旨在揭示其分子作用機制并為其進一步研究與臨床應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)資料 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https://www.tcmspw.com/tcmsp.php)，中藥綜合數(shù)據(jù)庫(Traditional Chinese Medicine Integrated Database，TCMID，http://119.3.41.228:8000/tcmid)，Uniprot蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)，GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)，在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https://omim.org/)，STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，Cytoscape 3.7.2軟件，R4.0.2軟件，Perl語言。

1.2 研究方法

1.2.1 紫蘇-百合藥對的活性成分的篩選及作用靶點的預(yù)測 使用TCMSP分別檢索紫蘇、百合，以得到紫蘇-百合藥對的化學(xué)成分及作用靶點。以口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%和類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18作為活性化合物的篩選條件。通過TCSMP平臺查詢所得活性成分的靶點信息，運用Perl語言及uniprot數(shù)據(jù)庫得到紫蘇-百合藥對作用的基因靶點。

1.2.2 收集原發(fā)性失眠的靶點并預(yù)測共同作用靶點 本研究以GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫為平臺。以“Primary Insomnia(原發(fā)性失眠)”為檢索詞條，對原發(fā)性失眠相關(guān)基因進行檢索和收集，并去除重復(fù)項，共得到2 405個相關(guān)疾病靶點。然后使用R語言將原發(fā)性失眠相關(guān)基因靶點與之前所得的紫蘇-百合藥對作用相關(guān)靶點進行比較，篩選出共同靶點，繪制韋恩圖。

1.2.3 網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建及分析 使用Cytoscape 3.7.2軟件繪制紫蘇-百合藥對與原發(fā)性失眠的“成分-靶點-基因-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。然后將共同作用靶點輸入到STRING數(shù)據(jù)庫中進行檢索，將蛋白種屬設(shè)置為“Homo Sapiens”，獲得蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)圖，并用Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化。

1.2.4 通路富集分析 利用David網(wǎng)站中的Functional Annotation Tool功能，對藥物-疾病共同作用基因靶點進行GO功能與KEGG信號通路富集分析，并將結(jié)果以條形圖和氣泡圖的形式輸出。

2 結(jié)果

2.1 紫蘇-百合藥對的活性成分的篩選及作用靶點的預(yù)測 通過在TCMSP、TCMIP數(shù)據(jù)庫中檢索紫蘇的全部化學(xué)成分共116個、百合的全部化學(xué)成分共21個。紫蘇的主要有效成分為紫蘇醛[(S)-p-Mentha-1，8-dien-7-al]，雖然未滿足篩選條件，仍納入到有效成分中，共得到紫蘇有效活性成分16個；得到百合的有效化學(xué)成分共7個，其中Beta-sitosterol(已在表1中標(biāo)黃)為二者共有，故總共得到紫蘇-百合藥對22個有效化學(xué)成分，化合物詳細(xì)信息見表1。在TCSMP數(shù)據(jù)庫查詢上述22個有效化合物的作用靶點，除去Supraene無相應(yīng)靶點，并刪除重復(fù)靶點，共得到120個藥物作用靶點。用Uniprot數(shù)據(jù)庫和perl語言對120個藥物作用靶點尋找靶基因，共得到97個藥物作用靶基因。

表1 紫蘇-百合藥對活性成分基本信息

2.2 篩選紫蘇-百合藥對活性成分與原發(fā)性失眠共同作用靶點 在GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫中，以“Primary Insomnia”為檢索詞條，對原發(fā)性失眠相關(guān)基因進行檢索和收集，并去除重復(fù)項，共得到2 402個相關(guān)疾病靶點。然后將這2 402個靶點與97個紫蘇-百合藥對活性成分靶點運用R語言繪制韋恩圖，圖中綠色圓形代表原發(fā)性失眠相關(guān)基因，橙色圓形代表紫蘇-百合藥對活性成分靶點，圖中交集即為藥物-疾病共同靶點53個即紫蘇-百合藥對治療原發(fā)性失眠的重要靶點。見圖1。

圖1 紫蘇-百合治療原發(fā)性失眠共同靶點的韋恩圖

2.3 藥物-活性成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 “藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖中粉紅色正方形節(jié)點代表“原發(fā)性失眠”，綠色菱形節(jié)點分別代表“紫蘇”和“百合”；紫色六邊形圓形節(jié)點代表作用靶點，淡藍(lán)色圓形節(jié)點代表藥物活性成分，二者之間的連線代表相互作用關(guān)系。使用Cytoscape軟件對圖2進行分析后，得到度值排名前五的活性成分為木犀草素(Luteolin)、豆甾醇(Stigmasterol)、β-谷甾醇(Beta-sitosterol)、β-胡蘿卜素(Beta-carotene)、3-去甲基秋水仙堿(3-Demethylcolchicine)。見圖2。

圖2 紫蘇-百合藥對“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 在STRING數(shù)據(jù)平臺輸入所得藥物—疾病共同靶點，分析得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，共包含53個節(jié)點，477條邊，平均度值為18，用Cytoscape 3.7.2軟件，按度值從大到小，由內(nèi)向外排列可視化后可得到圖3。其中度值越大圖中圓形面積越大、顏色越深，度值越小，圓形面積越小、顏色越淺，每條邊代表PPI關(guān)系，線條越多代表關(guān)聯(lián)度越大，PPI圖中的靶點排序如圖4。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 PPI圖中靶點排序

2.5 關(guān)鍵靶點GO生物功能注釋 將上述53個藥物—疾病共同靶點經(jīng)過David網(wǎng)站GO富集分析選取生物學(xué)過程(Biological Process)、細(xì)胞組分(Cellular Component)及分子功能夠(Molecular Function)3部分。結(jié)果顯示，交集基因集合共富集至284條生物學(xué)過程通路中；富集至35條細(xì)胞組分通路中；富集至58條分子功能通路中，按照富集基因數(shù)由多到少排序，按基因富集數(shù)目由多到少排序，前10個GO功能富集柱狀圖和氣泡圖見圖5，柱狀圖中縱坐標(biāo)表示基因富集數(shù)量，氣泡圖中縱坐標(biāo)表示通路名稱。由柱狀圖可以看出，生物學(xué)過程通路主要涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(Positive Regulation of Transcription from RNA Polymerase Ⅱ Promoter)、藥物應(yīng)答(Response to Drug)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控(Negative Regulation of Apoptotic Process)等通路；細(xì)胞組分通路主要涉及細(xì)胞質(zhì)膜(Plasma Membrane)、膜的組成部分(Integral Component of Membrane)、細(xì)胞質(zhì)(Cytoplasm)等通路；分子功能通路主要涉及蛋白結(jié)合(Protein Binding)、相同蛋白結(jié)合(Identical Protein Binding)、酶結(jié)合(Enzyme Binding)等通路。表明紫蘇-百合藥對可能通過多個GO生物功能發(fā)揮治療作用。

圖5 GO富集分析中BP、CC、MF通路的柱狀圖和氣泡圖

2.6 KEGG信號通路富集分析 將53個藥物-疾病共同靶點經(jīng)David網(wǎng)站運行，共得到102條KEGG信號通路，按照富集基因數(shù)由多到少排序，前25個GO功能富集柱狀圖見具體信號通路圖見圖6。P代表富集的顯著性，顏色越紅則顯著性越高。主要涉及HIF-1信號通路(HIF-1 Signaling Pathway)腫瘤壞死因子信號通路(TNF Signaling Pathway)，5-羥色胺突觸(Serotonergic Synapse)，PI3K-AKT信號通路(PI3K-AKT Signaling Pathway)等。

圖6 KEGG信號通路富集分析

3 討論

失眠對個人和社會均有很大的危害，失眠不僅會導(dǎo)致患者罹患內(nèi)科疾病的發(fā)生率顯著高于非失眠人群，也會導(dǎo)致精神障礙的發(fā)病率增高。失眠除了會導(dǎo)致精神和身體的疾病，對公共衛(wèi)生也會造成影響，如社會經(jīng)濟損害、醫(yī)療設(shè)施使用增加、工作表現(xiàn)下降，甚至死亡率增加[14]。

由“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖可知，紫蘇-百合藥對主要的活性成分是木犀草素。木犀草素是一種常見的膳食類黃酮，廣泛存在于中草藥中。Kim等[15]在一項小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)，口服木犀草素可以降低睡眠潛伏期，增加總睡眠時間，并通過腦電圖和肌電圖發(fā)現(xiàn)了木犀草素增加了非快速眼動睡眠時間，減少了清醒時間。而且現(xiàn)已有研究證實木犀草素可以抑制多種炎癥介質(zhì)[16]，而失眠與炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生有著一定的相關(guān)性[17]，推測木犀草素是通過抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生來調(diào)控睡眠。在對豆甾醇的研究中發(fā)現(xiàn)，小鼠在經(jīng)過20 d的豆甾醇給藥后，會導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)中氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽活性增高[18]。而已有研究發(fā)現(xiàn)非器質(zhì)性失眠的患者血清中氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽含量均降低[19]，我們可以推測豆甾醇可能會通過提高氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽活性來治療失眠。

由PPI網(wǎng)絡(luò)圖可知，紫蘇-百合治療原發(fā)性失眠的關(guān)鍵基因靶點是蛋白激酶B1、白蛋白、白細(xì)胞介素6、血管內(nèi)皮生長因子A、腫瘤壞死因子等。蛋白激酶B是PI3K/AKT信號通路的一部分，此通路也是本研究發(fā)現(xiàn)的紫蘇-百合治療原發(fā)性失眠的可能通路之一。目前已有研究表明，該信號通路與失眠存在相關(guān)性[20-21]。在動物實驗中發(fā)現(xiàn)，慢性睡眠剝奪可以導(dǎo)致小鼠海馬組織中磷酸化蛋白激酶B表達(dá)下降，從而抑制下游部分蛋白的表達(dá)，進而影響周圍炎性環(huán)境，促進炎癥介質(zhì)腫瘤壞死因子-α的釋放[22]。通過比較原發(fā)性失眠患者與健康患者血清中腫瘤壞死因子-α的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性失眠患者血清中腫瘤壞死因子-α的含量明顯高于健康對照組，證明了腫瘤壞死因子-α的表達(dá)水平與原發(fā)性失眠有密切的相關(guān)性[23]。Irwin等[24]在一項研究成人睡眠障礙、睡眠持續(xù)時間和炎癥的Meta分析中發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素-6與睡眠障礙有相關(guān)性，同時Nowakowski等[25]在一項對295名圍絕經(jīng)期婦女的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)較低的睡眠效率與較高的白細(xì)胞介素-6水平有關(guān)。

KEGG富集分析表示，紫蘇-百合藥對可能從多個通路對原發(fā)性失眠發(fā)揮治療作用。失眠患者體內(nèi)腫瘤壞死因子-α含量增高，而增多的腫瘤壞死因子-α可以通過腫瘤壞死因子信號通路激活核因子κB的釋放[26]，而王志偉等在臨床研究中發(fā)現(xiàn)原發(fā)性失眠患者血清中核因子κB水平升高[27]。我們可以推測紫蘇-百合藥對可以減少患者體內(nèi)腫瘤壞死因子-α的含量從而減少核因子κB的釋放，以改善失眠。

5-羥色胺突觸通路具有動態(tài)調(diào)節(jié)的體內(nèi)5-羥色胺受體水平作用，當(dāng)升高5-羥色胺水平后，會導(dǎo)致5-羥色胺2A[28]、5-羥色胺2C[29]的功能下調(diào)，Landolt等[30]通過回顧性研究發(fā)現(xiàn)5-羥色胺2A、5-羥色胺2C受體拮抗劑可以延長慢波睡眠和深慢波睡眠時間，有臨床試驗發(fā)現(xiàn)在對失眠患者進行有效治療后，血清5-羥色胺水平也會明顯升高[31]。

綜上所述，紫蘇-百合藥對治療原發(fā)性失眠具有多成分、多靶點、多通路的作用機制特點，為紫蘇-百合藥對治療原發(fā)性失眠提供了實驗研究的方向。