基于網(wǎng)絡藥理學的鼻淵通竅顆粒治療過敏性鼻炎的分子機制研究

劉 暢 張慧月 聶 晶 劉麗慧 張 荻 吳記勇

(山東省第二人民醫(yī)院藥學部，濟南，250022)

過敏性鼻炎(Allergic Rhinitis，AR)又被稱為變應性鼻炎，是臨床較為常見的鼻腔黏膜變應性疾病。AR分為常年性和季節(jié)性，常年性AR，致敏物質(zhì)多為塵螨、動物脫屑等；季節(jié)性AR，致敏原多為花粉。以陣發(fā)性噴嚏、清水樣涕、鼻癢和鼻塞為臨床表現(xiàn)，可伴雙側(cè)鼻黏膜蒼白、腫脹、下鼻甲水腫，眼結(jié)膜充血、眼部水腫。AR病程長、易反復，不僅降低患者的生命質(zhì)量，還加重患者的經(jīng)濟負擔。單純西藥治療如糖皮質(zhì)激素、抗組胺藥、抗白三烯藥、減充血劑、抗膽堿藥等可在一定程度上緩解病情，但易復發(fā)且遠期效果不理想[1]。

鼻淵通竅顆粒是由宋代嚴用和的《濟生方》所載“蒼耳散”的基礎上加味而成，組方配伍嚴謹、合理[2]。鼻淵通竅顆粒由辛夷、蒼耳子(炒)、麻黃、白芷、薄荷、藁本、黃芩、連翹、野菊花、天花粉、地黃、丹參、茯苓、甘草，共計14味中藥。具有疏風清熱，扶正祛邪、益氣固表、宣肺通竅之功效，用于急鼻淵屬外邪犯肺證，證見前額或顴骨部壓痛、鼻塞時作、流涕黏白或黏黃，或頭痛，或發(fā)熱，苔薄黃。以往隨機對照試驗臨床研究表明鼻淵通竅顆粒聯(lián)合糖皮質(zhì)激素治療過敏性鼻炎的效果明顯，優(yōu)于單藥治療[3]。然而，鼻淵通竅顆粒治療過敏性鼻炎分子機制不明，有待進一步研究。

網(wǎng)絡藥理學是基于系統(tǒng)生物學理論，利用生物網(wǎng)絡分析法構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡，以網(wǎng)絡靶標為切入點，從藥物網(wǎng)絡穩(wěn)態(tài)角度分析藥物成分與疾病靶點網(wǎng)絡之間的關(guān)系及動態(tài)變化規(guī)律，可提升臨床藥物研究實驗成功率，節(jié)約藥物研發(fā)成本[4]。本文基于網(wǎng)絡藥理學理論，對鼻淵通竅顆粒所含已知有效成分治療過敏性鼻炎的分子機制進行探索。通過構(gòu)建藥物成分、潛在靶點與過敏性鼻炎疾病之間的網(wǎng)絡，為鼻淵通竅顆粒在過敏性鼻炎的臨床治療和相關(guān)科學研究提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 鼻淵通竅顆粒所含的化學成分及作用靶點的獲取 本研究借助中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，獲取鼻淵通竅顆粒中辛夷、蒼耳子、麻黃、白芷、薄荷、藁本、黃芩、連翹、野菊花、天花粉、地黃、丹參、茯苓、甘草所含的化學成分，通過藥物信息數(shù)據(jù)庫DrugBank(http://www.drugbank.ca/)獲得鼻淵通竅顆粒所含成分的作用靶點。

1.2 過敏性鼻炎疾病靶點的獲取和鼻淵通竅顆粒治療過敏性鼻炎的靶點預測 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)，以“Allergic Rhinitis”為關(guān)鍵詞，獲得過敏性鼻炎疾病靶點。利用R語言，找出1.1項下轉(zhuǎn)化為基因簡稱的藥物成分靶點與疾病靶點的共同靶點，作為鼻淵通竅顆粒治療過敏性鼻炎的潛在靶點。

1.3 鼻淵通竅顆粒治療過敏性鼻炎的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)構(gòu)建 將鼻淵通竅顆粒治療過敏性鼻炎的潛在靶點導入STRING據(jù)庫(https://string-db.org/)，物種選擇為“Homo Sapiens”，選擇隱藏網(wǎng)絡之外游離節(jié)點，設置置信度評分為自定義值>0.40，得到鼻淵通竅顆粒治療過敏性鼻炎的PPI網(wǎng)絡，并利用R語言計算各節(jié)點的度值得到柱形圖進行可視化顯示。

1.4 “鼻淵通竅顆粒成分-潛在靶點-過敏性鼻炎”的網(wǎng)絡構(gòu)建 將鼻淵通竅顆粒所含的化學成分和其治療過敏性鼻炎的潛在靶點數(shù)據(jù)儲存為.txt格式，導入網(wǎng)絡可視化軟件Cytoscape 3.7.2(https://cytoscape.org/)，構(gòu)建鼻淵通竅顆粒成分-潛在靶點-過敏性鼻炎的可視化PPI網(wǎng)絡圖。

將209個鼻淵通竅顆粒治療過敏性鼻炎的潛在靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫，利用本文1.3項下的方法，最終得到鼻淵通竅顆粒-AR的PPI網(wǎng)絡。網(wǎng)絡中節(jié)點代表靶點，邊代表靶點間的互作關(guān)系，邊數(shù)越多的節(jié)點表明其在網(wǎng)絡中越關(guān)鍵，各節(jié)點的互作關(guān)系具有相關(guān)文獻證據(jù)支持，黃色邊表示證據(jù)來源于文本挖掘、黑色為共表達、淺藍色為蛋白同源性和橙色為基因融合等。

鼻淵通竅顆粒潛在活性成分-靶點”網(wǎng)絡。不同顏色表示不同藥物，其中棕色代表黃芩、粉色代表辛夷、黃色代表丹參、青色代表藁本、墨綠色代表茯苓、粉色代表蒼耳子、淺粉色代表天花粉、橘黃色代表甘草、藍色代表地黃、淺綠色代表野菊花、深綠色代表薄荷，深藍色代表白芷，紫紅色代表多種藥物共有靶點，綠色三角代表藥物與疾病的共有靶點。

鼻淵通竅顆粒存在一個成分同多個靶點相互作用，以及不同成分共同作用于同一個靶點的現(xiàn)象。這體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點、多環(huán)節(jié)作用復雜疾病治療機制。網(wǎng)絡中，節(jié)點的度值表示網(wǎng)絡中同其他節(jié)點相連的數(shù)目，利用節(jié)點度值確定網(wǎng)絡關(guān)鍵節(jié)點是目前網(wǎng)絡分析的重要手段。根據(jù)藥物網(wǎng)絡節(jié)點度(Degree，DC)參數(shù)，篩選關(guān)鍵成分與靶點。

1.5 基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析 通過R語言，使用org.Hs.eg.Db、Colorspace、DOSE、clusterProfiler和Pathview等R包，進行鼻淵通竅顆粒治療過敏性鼻炎的包含生物學過程(Biological Process，BP)、分子功能(Molecular Function，MF)和細胞組分(Cellular Component，CC)三部分的GO功能富集分析，以及鼻淵通竅顆粒調(diào)控的潛在靶點在疾病信號通路中的富集程度，并進行可視化展示。

鼻淵通竅顆粒治療AR的KEGG通路結(jié)果，其中方格部分代表整條通路中出現(xiàn)的節(jié)點，紅色部分表示該節(jié)點出現(xiàn)在鼻淵通竅顆粒調(diào)控AR的疾病網(wǎng)絡中。

1.6 鼻淵通竅顆粒潛在靶點-通路分析 利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建鼻淵通竅顆粒潛在活性成分靶點-信號通路網(wǎng)絡圖。將得到的通路條目、靶點信息導入Cytoscape 3.7.2軟件，繪制得到靶點-通路圖，其中紅色代表通路，橙色代表靶點，圖形的大小表示富集的顯著程度，圖形越大表明富集越顯著。

1.7 鼻淵通竅顆粒潛在活性成分-靶點的分子對接 在PDB數(shù)據(jù)庫中下載PTGS2(PDB ID：1PRH)、PTGS1(PDB ID:5IKV)及AR密切相關(guān)的血清因子IgE(PDB ID:5ANM)抗體3D結(jié)構(gòu)的pdb格式文件，運用Discover Studio軟件對蛋白質(zhì)進行去水、加氫，從PubChem數(shù)據(jù)庫中下載各成分結(jié)構(gòu)，將將鼻淵通竅顆粒治療AR潛在化學成分槲皮素、芹菜素、山柰酚的藥物分子及處理后導入AutoDock軟件進行分子對接并計算潛在活性成分和潛在靶點之間的結(jié)合能以預測他們的結(jié)合活性。

本研究將鼻淵通竅顆粒治療AR潛在化學成分槲皮素、芹菜素、山柰酚同潛在靶點PTGS2(PDB ID：1PRH)、PTGS1(PDB ID:5IKV)及AR密切相關(guān)的血清因子IgE(PDB ID:5ANM)抗體進行分子對接計算潛在活性成分和潛在靶點之間的結(jié)合能，結(jié)合能的絕對值越高，結(jié)合形成的構(gòu)象越穩(wěn)定。在AutoDock環(huán)境下，結(jié)合能的絕對值>0.5說明該結(jié)果有意義，結(jié)合能絕對值>5，表明結(jié)果良好。

2 結(jié)果

2.1 鼻淵通竅顆粒所含成分獲取結(jié)果 通過TCMSP數(shù)據(jù)平臺，檢索辛夷、蒼耳子(炒)、麻黃、白芷、薄荷、藁本、黃芩、連翹、野菊花、天花粉、地黃、丹參、茯苓、甘草中化合物，除重后鼻淵通竅顆粒的主要化合物有849種。見表1。2.2 鼻淵通竅顆粒治療過敏鼻炎潛在靶點獲取結(jié)果 通過藥物信息數(shù)據(jù)庫DrugBank獲取鼻淵通竅顆粒所含成分靶點共計543個，利用GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得AR靶點1 865個。最后，通過R語言運行VennDiagram程序，得到藥物成分靶點與AR的共同靶點209個，作為鼻淵通竅顆粒治療過敏性鼻炎的潛在靶點，表明鼻淵通竅顆?？蛇^調(diào)控多個靶點，發(fā)揮治療AR的作用。見圖1。

圖1 鼻淵通竅顆粒治療AR的潛在靶點

2.3 鼻淵通竅顆粒治療過敏性鼻炎PPI分析結(jié)果 整個網(wǎng)絡包含邊4 196條，節(jié)點數(shù)207個，平均節(jié)點度值40.5。見圖2。

圖2 鼻淵通竅顆粒-AR的PPI網(wǎng)絡

結(jié)果顯示，IL6、ALB、INS、AKT1、VEGFA、MAPK3、IL1B、STAT3、PTGS2等靶蛋白的節(jié)點度值高，表明這些靶蛋白在網(wǎng)絡中處于關(guān)鍵地位，是其他節(jié)點之間的連接紐帶。見圖3。

圖3 鼻淵通竅顆粒-AR關(guān)鍵節(jié)點信息柱形圖

2.4 “鼻淵通竅顆粒成分-潛在靶點-過敏性鼻炎”的網(wǎng)絡構(gòu)建結(jié)果 通過網(wǎng)絡分析得到鼻淵通竅顆粒成分與潛在靶點相互作用關(guān)系共計1 073個。結(jié)果顯示，鼻淵通竅顆粒所含成分中的，槲皮素(MOL000098)、芹菜素(MOL000008)、山柰酚(MOL000422)、熊果酸(MOL000511)、迷迭香酸(MOL011865)和基因中PTGS2、PTGS1、CHRM2、CHRM3、ADRB2等的節(jié)點度值較高，是該網(wǎng)絡的重要節(jié)點，表明其可能是鼻淵通竅顆粒治療AR的關(guān)鍵。見圖4。

圖4 鼻淵通竅顆粒潛在活性成分-潛在靶點-過敏性鼻炎網(wǎng)絡

表2 鼻淵通竅顆粒成分-潛在靶點-過敏性鼻炎的關(guān)鍵節(jié)點

2.5 GO富集分析 GO富集分析得出2 320個生物學過程(BP)，涉及脂多糖應答、細菌產(chǎn)生、細胞因子、生物刺激、炎癥反應、營養(yǎng)水平、氧化應激等過程的調(diào)控；69個細胞組分(CC)，涉及細胞質(zhì)、細胞膜、膜小凹、膜區(qū)、膜筏、微血管、特異性顆粒、溶酶體等。138個分子功能(MF)，涉及細胞因子受體、核受體、腎上腺素能受體、趨化因子受體、G蛋白偶聯(lián)受體、轉(zhuǎn)錄因子、血紅素等。見圖5～7。縱坐標為GO名稱，橫坐標表示基因富集數(shù)目，顏色表示基因富集的顯著性。

圖5 鼻淵通竅顆粒關(guān)鍵靶點BP柱形圖

圖7 鼻淵通竅顆粒關(guān)鍵靶點MF柱形圖

2.6 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析得到24條通路，其共同靶點主要富集于促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK)、低氧誘導因子1(Hypoxia Inducible Factor 1，HIF-1)、鈣信號通路、趨化性細胞因子、叉頭轉(zhuǎn)錄因子、環(huán)磷酸腺苷(Cyclic AMP，cAMP)、核因子κB(Nuclear Factor Kappa-B，NF-κB)等信號通路?？v坐標為KEGG名稱，氣泡的大小表示基因富集數(shù)目，越大則富集基因數(shù)目越多，顏色表示基因富集的顯著性，越紅則富集越顯著。見圖8。

圖8 鼻淵通竅顆粒潛在靶點KEGG通路富集分析氣泡圖

2.6 鼻淵通竅顆粒潛在靶點-通路分析結(jié)果 富集在各通路上的關(guān)鍵靶點主要有:AKT1、MAPK1、MAPK3、RELA等。見圖9。

圖9 鼻淵通竅顆粒作用靶點-通路分析

結(jié)果顯示，鼻淵通竅顆粒所含的化學成分可通過調(diào)節(jié)細胞能量代謝與物質(zhì)轉(zhuǎn)換、細胞周期增殖、細胞分裂與分化、細胞衰老與凋亡、釋放抗體抑制病毒復制、免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤細胞的增殖和分化等多通路對AR進行治療。見圖10。

圖10 鼻淵通竅顆粒治療AR相關(guān)通路作用靶點

2.7 鼻淵通竅顆粒潛在活性成分-靶點的分子對接結(jié)果 由鼻淵通竅顆粒潛在活性成分-靶點的分子對接結(jié)果可知，在AutoDock環(huán)境下，分子對接結(jié)合能的絕對值>0.5說明該結(jié)果有意義，結(jié)合能絕對值>5，表明結(jié)果良好。由表3和圖11可知，槲皮素、芹菜素和山柰酚與受體蛋白PTGS1、PTGS2和IgE形成構(gòu)象能量低，結(jié)合構(gòu)象穩(wěn)定。

圖11 鼻淵通竅顆粒潛在活性成分-靶點的分子對接

表3 鼻淵通竅顆粒潛在活性成分-靶點的分子對接結(jié)果——蛋白/PDB ID結(jié)合能(kcal/mol)

3 討論

中醫(yī)認為慢性鼻竇炎屬“鼻淵”范疇，治療應以宣肺通竅為主，鼻淵通竅顆?？砂l(fā)揮宣肺通竅功效。網(wǎng)絡藥理學研究發(fā)現(xiàn)，鼻淵通竅顆粒含有的槲皮素、芹菜素、山柰酚、熊果酸、迷迭香酸可能是鼻淵通竅顆粒治療AR的活性成分。其中，槲皮素、芹菜素、山柰酚均為黃酮類化合物。黃酮類化合物具有抗氧化、清除自由基和提高機體免疫的功能。槲皮素是一種富含抗氧化劑的天然多酚類黃酮，具有抗過敏、抑制組胺和促炎癥介質(zhì)生成功能，能夠調(diào)節(jié)Th1/Th2的穩(wěn)定性，減少B細胞釋放抗原特異性IgE抗體，適用于治療過敏性疾病[5-6]；芹菜素作為生物黃酮類化合物，具有良好的抗過敏作用潛力，其對抗卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)誘導的AR具有潛在作用機制，芹菜素通過抑制Th2細胞應答的表達和激活Th1細胞應答來調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，在OVA誘導的AR小鼠模型中發(fā)揮抗過敏作用[7]；炎癥反應與多種疾病的發(fā)展都密切相關(guān)，因此，控制炎癥發(fā)展在炎癥治療中尤為重要，山柰酚具有明顯抗炎作用，研究發(fā)現(xiàn)，山柰酚能夠顯著抑制脂多糖誘導的人單核細胞THP-1的MAPK通路表達，降低巨噬細胞衍生趨化因子、γ干擾素誘導蛋白-10、白細胞介素-8等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，從而有效抑制炎癥的發(fā)生。此外，Cao等[8]的研究也發(fā)現(xiàn)山柰酚可作為治療非IgE介導的過敏反應或炎癥的候選藥物；熊果酸是一種存在于多種植物中的五環(huán)三萜類化合物，宋瑗瑗等[9]通過對熊果酸C28位進行結(jié)構(gòu)修飾得到熊果酸衍生物，分子對接研究發(fā)現(xiàn)，該衍生物可能通過影響白細胞介素-1受體相關(guān)激酶1表達，從抑制炎癥反應；有研究發(fā)現(xiàn)，富含迷迭香酸的紫蘇提取物可抑制小鼠過敏性免疫球蛋白反應，為證實其療效，一項隨機對照試驗研究篩選29例有2年以上病史輕度AR患者，在為期21 d的給藥觀察得出高劑量給藥組AR改善率高達70%，表明迷迭香酸能有效改善輕度AR[10]。

通過PPI網(wǎng)絡分析研究可知，PTGS2、PTGS1、CHRM2、ADRB2、NOS2等靶蛋白節(jié)點度高，是鼻淵通竅顆粒所含化學成分與AR疾病基因網(wǎng)絡的核心靶點，也是其他節(jié)點之間的連接紐帶。文獻研究發(fā)現(xiàn)，PTGS2、PTGS1和NOS2與炎癥正相關(guān)，前列腺素內(nèi)過氧化物合酶(Prostaglandin-endoperoxide Synthase,PTGS)又稱環(huán)加氧酶，是前列腺素生物合成中的關(guān)鍵酶。PTGS有2種同工酶：組成型PTGS1和誘導型PTGS2。通常，他們由特定的刺激事件調(diào)節(jié)，與炎癥反應和相關(guān)前列腺素生物合成相關(guān)。一氧化氮合成酶(Nitric Oxide Synthase,NOS)2是NO生成的關(guān)鍵酶，一項隨機對照試驗研究探討NOS2基因單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)與單純塵螨過敏性鼻炎發(fā)生的相關(guān)性，通過采集受試者外周靜脈血，提取基因組DNA研究發(fā)現(xiàn)單純塵螨過敏性鼻炎患者NOS2基因單核苷酸多態(tài)性改變，揭示了NOS2可能是中國漢族人群單純塵螨過敏性鼻炎易感基因[11]。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，鼻淵通竅顆粒治療AR的潛在基因顯著富集在MAPK、HIF-1、NF-κB、cAMP等信號通路。MAPK是信號從細胞表面?zhèn)鬟f至胞核內(nèi)部的重要傳遞者，能被不同點胞外刺激，如細胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、細胞應激等激活，同時具有調(diào)節(jié)細胞生長、分化、適應環(huán)境及炎癥反應等多種細胞生理和病理過程；HIF-1是缺氧條件下哺乳動物體內(nèi)存在的一種快速轉(zhuǎn)錄因子，隨胞內(nèi)氧濃度變化而調(diào)節(jié)靶基因表達。它能促進血管內(nèi)皮細胞生產(chǎn)因子，誘導型一氧化氮合成酶等基因表達，在免疫和炎癥反應中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。研究證實，過敏伴隨的炎癥反應均需要HIF-1活化，在炎癥組織中，炎癥介質(zhì)均會引起HIF-1水平上升，該指標能支持炎癥細胞能力代謝，促進炎癥介質(zhì)表達[12]；核因子κB一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，它是介導細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導最重要的核轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)和免疫因子。江雪等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在AR患者中核因子κB水平顯著升高，表明該信號通路在AR發(fā)病過程中具有重要作用。第二信使cAMP是細胞內(nèi)信息傳遞過程中細胞功能重要的調(diào)節(jié)物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，健康人體內(nèi)cAMP的代謝呈動態(tài)平衡，炎癥反應時，二者比值發(fā)生變化，因此cAMP可以作為AR的療效評價指標，對AR治療具有指導意義[14]。

為進一步研究鼻淵通竅顆粒治療AR藥效物質(zhì)基礎，本研究采用分子對接技術(shù)對鼻淵通竅顆粒治療AR關(guān)鍵成分及靶點進行分子對接驗證。在AutoDock環(huán)境下，分子對接結(jié)合能的絕對值>0.5說明該結(jié)果有意義，結(jié)合能絕對值>5，表明結(jié)果良好。槲皮素、芹菜素和山柰酚與受體蛋白PTGS1、PTGS2和IgE形成構(gòu)象能量低，結(jié)合構(gòu)象穩(wěn)定。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡藥理學方法，對鼻淵通竅顆粒治療AR的分子機制進行挖掘并分析，結(jié)果表明，鼻淵通竅顆粒所含化學成分槲皮素、芹菜素、山柰酚、熊果酸、迷迭香酸可能是該方治療AR的關(guān)鍵，各組分可能通過PTGS2、PTGS1、CHRM2、ADRB2、NOS2等靶點介導MAPK、HIF-1、NF-κB、cAMP信號通路，發(fā)揮治療AR作用。然而，藥物在體內(nèi)作用受身體生理功能、年齡、性別以及體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄因素影響。另外，網(wǎng)絡藥理學研究基于開源數(shù)據(jù)庫，其研究存在一定局限性。網(wǎng)絡藥理學研究雖處于初級階段，但其給傳統(tǒng)中藥的研究帶來新的現(xiàn)代化思路。隨著系統(tǒng)生物學、生物信息學等學科的發(fā)展以及中藥信息數(shù)據(jù)庫的完善，中藥復方網(wǎng)絡藥理學多成分、多靶點治療疾病的機制將會進一步揭示，不斷推進藥學研究發(fā)展。