二仙湯治療早發(fā)性卵巢功能不全的網絡藥理學分析

李 敏 郭 淼 孫建華 翟鳳霞 李 娜

(1 河南中醫(yī)藥大學，鄭州，450046；2 河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，鄭州，450000)

早發(fā)性卵巢功能不全(Premature Ovarian Failure，POI)是指40歲之前的女性因卵巢功能減退而出現(xiàn)的一系列臨床綜合征，影響女性生育力及身心健康，其臨床患病率為1%～3%[1]。目前，激素補充是西醫(yī)臨床主要治療方案，即單純雌激素治療，雌孕激素序貫或連續(xù)聯(lián)合治療和陰道局部應用雌激素治療[2]。這些治療方案對調整月經周期，改善低雌激素狀態(tài)，緩解并發(fā)癥狀具有一定的治療作用，但在臨床應用存在一定的禁忌證及潛在的血栓、腫瘤等風險[3]。

現(xiàn)代中醫(yī)學家普遍認為該病虛實夾雜，但總以腎氣虧損為基本病機。因此當以滋補腎氣為主要治療原則。二仙湯是第六批全國名老中醫(yī)藥專家王麗娜教授治療POI的常用方，該方具有溫腎陽，補腎精，交通心腎，調理沖任的功效。二仙湯聯(lián)合西藥治療POI相較于單純西藥，在療效及安全性方面，具有明顯的優(yōu)越性[4]?，F(xiàn)代藥理研究顯示，二仙湯能夠發(fā)揮抑制細胞凋亡，促進卵巢顆粒細胞增殖的作用[5-6]。

基于網絡藥理學的技術支持[7]，本研究旨在活性成分、核心作用靶基因及信號通路方面，系統(tǒng)闡釋二仙湯作用于POI的作用機制，為進一步研究做準備。

1 資料與方法

1.1 篩選、獲取二仙湯活性成分和靶基因 本研究借助中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php),以藥物口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18為條件，篩選二仙湯的6味藥物仙茅、淫羊藿、巴戟天、黃柏、知母、當歸的活性成分[8]。并在該數(shù)據(jù)庫中查詢藥物活性成分所對應的靶基因，建立藥物靶基因數(shù)據(jù)集。

1.2 查詢、收集疾病靶基因 將POI的英文名稱“Premature Ovarian Insufficiency”分別輸入在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，http://www.omim.org)及GeneCards數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org/)進行查詢，以獲得POI相關的疾病靶基因，建立疾病靶基因數(shù)據(jù)集。

1.3 構建藥物活性成分與作用靶基因的網絡 利用ClusterProfiler軟件包進行韋恩分析，取疾病靶基因與藥物活性成分靶基因的交集，建立疾病-藥物數(shù)據(jù)集，將該數(shù)據(jù)集與活性成分數(shù)據(jù)集共同導入Cytoscape 3.7.2軟件，繪制藥物活性成分與作用靶基因網絡圖，進行可視化。

1.4 預測二仙湯作用于POI的核心靶基因 將交集靶基因導入STRING數(shù)據(jù)庫，獲得二仙湯活性成分靶基因和POI相關靶基因的蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)，將數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.7.2，繪制PPI網絡圖，并篩選出核心靶基因。

1.5 二仙湯治療POI的生物學過程與通路分析 采用ClusterProfiler軟件包對作用靶基因先后進行基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)分析，并繪制通路圖，進行可視化。

2 結果

2.1 二仙湯的活性成分篩選 得出92個活性成分，并將其作為候選化合物。這些成分相對應靶基因205個，整理活性成分靶基因數(shù)據(jù)集。

2.2 疾病靶基因篩選 通過OMIM、GeneCards數(shù)據(jù)庫分別收集到靶基因392個、3 032個，去重后共計3 425個，整理為疾病靶基因數(shù)據(jù)集。

2.3 藥物活性成分-作用靶基因網絡圖的構建與分析 由圖1可知，有173交集靶基因，即為二仙湯治療POI的作用靶基因。圖2包括239個節(jié)點，代表藥物活性成分和作用靶基因，1 153條邊。二仙湯的主要活性成分為Stigmasterol(豆甾醇)、Kaempferol(山柰酚)、Beta-Sitosterol(Β-谷甾醇)、Luteolin(木犀草素)、Anhydroicaritin(淫羊藿苷元)、Quercetin(槲皮苷)等。

圖1 二仙湯-POI靶基因韋恩圖

圖2 藥物活性成分-作用靶基因網絡圖

2.4 二仙湯對POI核心靶基因的預測 結果顯示：Degree值最大是36，最小是1。其中排名前4的基因是AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT1)、促分裂原活化的蛋白激酶1(MAPK1)、活化蛋白(AP)-1轉錄因子亞單位(JUN)、核因子κB/p65(RELA)。見圖3。

圖3 二仙湯與POI的PPI網絡

2.5 二仙湯治療POI核心靶基因GO富集分析 生物過程(Biological Process，BP)條目1 939個，富集基因數(shù)量較大的有對營養(yǎng)水平的反應(Response to Nutrient Levels)、氧化應激反應(Response to Oxidative Stress)、對金屬離子的響應(Response to Metal Ion)、對脂多糖反應(Response to Lipopolysaccharide)、對細菌源性分子的反應(Response to Molecule of Bacterial Origin)、類固醇激素反應(Response to Steroid Hormone)等。見圖4。細胞組分(Cellular Component，CC)條目72個，富集基因數(shù)量較大的有膜筏(Membrane Raft)、膜微結構域(Membrane Microdomain)、膜區(qū)域(Membrane Region)、轉錄因子復合物(Transcription Factor Complex)、神經元胞體(Neuronal Cell Body)等。見圖5。分子功能(Molecular Function，MF)條目141個，富集基因數(shù)量較大的有DNA結合轉錄激活劑活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性(DNA-Binding Transcription Activator Activity，RNA Polymerase II-Specific)、泛素樣蛋白連接酶結合(Ubiquitin-Like Protein Ligase Binding)、細胞因子受體結合(Cytokine Receptor Binding)、受體配體活性(Receptor Ligand Activity)等。見圖6。KEGG通路富集篩選得到164條信號通路，根據(jù)富集基因數(shù)量進行排序，選擇前20個通路進行柱狀圖展示，其基因靶基因主要富集于Toll樣受體信號通路(Toll-Like Receptor Signaling Pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF Signaling Pathway)、低氧因子信號通路(HIF-1 Signaling Pathway)、T細胞受體信號通路(T Cell Receptor Signaling Pathway)等相關信號通路。

圖4 作用靶基因的GO-BP分析氣泡圖(前20條)

圖5 作用靶基因的GO-CC分析氣泡圖(前20條)

圖6 作用靶基因的GO-MF分析氣泡圖(前20條)

2.6 二仙湯治療POI信號通路的KEGG富集分析 圖7X軸代表富集在信號通路上的基因數(shù)目，顏色代表富集的相關性。由圖可知，主要涉及PI3K-AKT Signaling Pathway、MAPK Signaling Pathway、TNF Signaling Pathway等信號通路。

圖7 作用靶基因的KEGG分析柱狀圖(前20條)

3 討論

二仙湯通過包括槲皮苷、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇、木犀草素等在內的66個有效成分作用于POI。槲皮苷是一種能促進卵泡發(fā)育和卵巢顆粒細胞增殖的黃酮類化合物，可促使雌激素分泌，以改善雷公藤多苷致POF動物模型的卵巢功能[9]。山柰酚也是在植物中提取的黃酮類化合物。有研究發(fā)現(xiàn)山柰酚可通過下調Notch胞內結構域(Notch Intracellular Domain，NICD)mRNA的表達，降低Notch1蛋白的表達而發(fā)揮抑制卵巢細胞SKOV-3細胞增殖，從而誘導其凋亡的作用[10]。曾莉萍等[11]研究觀察到β-谷甾醇具有雌激素活性，具有誘導卵巢顆粒細胞分化，促進雌激素合成的作用。豆甾醇與β-谷甾醇同為植物甾醇類雌激素，具有降低血清中膽固醇水平的功能[12]，改善低雌激素水平下的心腦血管的功能。木犀草素在卵巢顆粒細胞的體外培養(yǎng)中，當其濃度達到12.5 μg/mL時，能促進卵巢顆粒細胞分泌雌激素[13]。

根據(jù)PPI網絡可知，二仙湯治療POI可能主要通過作用MAPK1、AKT1、JUN、RELA等靶標來發(fā)揮作用。細胞外因子激活MAPK，由此可將信號由細胞表面?zhèn)魉椭良毎藘炔?。MAPK1基因蛋白在卵巢發(fā)育后期的前期卵巢中的表達明顯增強，在卵母細胞及卵巢的發(fā)育和成熟過程中該基因可能起重要作用[14]。AKT1參與增殖、存活、生長等多種生物學過程。活化的蛋白激酶B可激發(fā)下游的叉頭盒O類1A(Forkhead Box，Class O，1A，F(xiàn)oxo1a)mRNA的表達，從而影響卵巢顆粒細胞的增殖[15]?；罨鞍?1是有堿性亮氨酸拉鏈結構的JUN蛋白，在不同疾病中表現(xiàn)出上調或下調的表達。作為核因子κB家族的重要成員之一，RELA通過對靶的調節(jié)，發(fā)揮在顆粒細胞的增殖、凋亡、免疫應答等過程中相關作用[16]。

KEGG分析結果顯示，二仙湯通過PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路、TNF信號通路等作用于POI。PI3K-AKT信號通路參與原始卵泡的發(fā)育、顆粒細胞的增殖和分化等生物過程[17]。促卵泡素促進顆粒細胞中蛋白激酶B的磷酸化，并通過PI3K-AKT信號通路抑制顆粒細胞凋亡[18]。MAPK信號通路對卵巢的顆粒細胞增殖發(fā)揮促進或抑制雙面作用，即，各種因子可通過MAPK信號通路能夠發(fā)揮對卵巢顆粒細胞上調、下調的作用[19]。國內回顧性研究發(fā)現(xiàn)POI患者血清中TNF-α水平低于正常水平，而在POI的發(fā)病過程中，TNF-α起著重要作用[20]。研究發(fā)現(xiàn)，加入TNF-α的卵泡內膜細胞,表現(xiàn)出更強的細胞增殖能力,即TNF-α能促進卵泡膜細胞增殖[21]。

綜上所述，就活性成分、靶基因、信號通路三方面而言，二仙湯治療POI是具有多途徑的，這為之后開展動物與臨床試驗研究，提供一定的依據(jù)。