靜脈管壁重塑在下肢深靜脈血栓后綜合征發(fā)病機制中的研究進展

張琳杰 王鵬輝 楊成昊 崔超毅 陸信武 殷敏毅

流行病學資料顯示，約有20%～50%的患者會在深靜脈血栓(deep vein thrombosis,DVT)形成后出現(xiàn)相應的深靜脈血栓后綜合征(post-thrombotic syndrome,PTS)癥狀，包括肢體疼痛、沉重感、疲勞、下肢水腫、瘙癢和靜脈性跛行；約10%的患者會發(fā)展至靜脈性潰瘍，是PTS最嚴重的臨床表現(xiàn)。PTS的病理生理機制尚未被完全闡明。目前主流的觀點認為，PTS可能是由于DVT形成后，靜脈血流被部分或完全阻斷，使流出道梗阻、靜脈瓣返流并持續(xù)到急性期，導致靜脈處于高壓狀態(tài)，從而引起各種癥狀。但隨著靜脈血栓的部分或完全再通，流出道梗阻緩解，部分患者的PTS癥狀仍然不斷加重，甚至有需要截肢的可能。這些臨床現(xiàn)象提示，靜脈血栓可能在一定程度上對靜脈造成了不可逆的損傷，而這種損傷極有可能體現(xiàn)在靜脈管壁之中。本文從DVT形成后的細胞成分、細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)成分、分子成分3個方面對目前的PTS靜脈管壁重塑機制進行綜述。

1 PTS的病理性靜脈管壁重塑概述

PTS患者股靜脈阻塞節(jié)段切開可見管壁內(nèi)側有大量的纖維化痕跡，組織病理學檢查結果顯示,管壁中有大量膠原異常沉積，其中80%為Ⅰ型膠原，其余為Ⅲ型膠原，并伴有嚴重營養(yǎng)不良性鈣化[1]。上述結果提示，PTS患者管壁重塑過程中ECM代謝失調(diào)，造成管腔粘連和管壁纖維化改變，從而嚴重影響靜脈順應性，這可能是血栓再通后癥狀仍然加重的原因之一。進一步探索靜脈管壁重塑機制可為PTS的預防和早期治療提供新的干預靶點。

靜脈血管重塑是一種活躍的血管結構改變過程，涉及至少4個細胞過程——細胞生長、細胞死亡、細胞遷移和ECM的產(chǎn)生或降解，且依賴于局部生成的生長因子、血管活性物質(zhì)和血流動力學的刺激。研究發(fā)現(xiàn)，DVT形成兩個月后，血栓發(fā)生透明化，伴有中央彎曲管腔，提示成纖維細胞等產(chǎn)生膠原的初步積累。密集排列的膠原纖維中含有稀疏的免疫細胞，排列較松散的膠原束與新生血管形成有關。而后逐步發(fā)生血栓再通，但是部分以靜脈管壁纖維化、順應性降低為代價，從而引起靜脈功能不全。病理性管壁重塑作為不可或缺的機制參與其中，逐漸演變?yōu)镻TS。

2 細胞成分

2.1 內(nèi)皮細胞(endothelial cell,EC)及內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cell,EPC) EC是靜脈管壁組織與血液之間的第一道屏障，參與物質(zhì)交換、凝血、抗凝、纖維蛋白溶解(簡稱纖溶)等多種病理生理過程。EPC是EC的前體細胞，在DVT的病理刺激下，可從骨髓動員到外周血中參與損傷血管的修復和血栓的溶解。

EC和EPC在PTS的靜脈壁重塑中可發(fā)揮雙重作用[2]。一方面，完整EC的快速恢復可能阻止了靜脈血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)參與病理性管壁重塑的過程。有研究[3]顯示，EC和EPC產(chǎn)生的NO可以抑制VSMC的增殖，增加EPC數(shù)量，加速血管內(nèi)皮化，遏制病理性血管壁重塑[4]。Méndez-Barbero等[5]總結了EC與VSMC間信號交流的方式，提出兩者間信號交流失調(diào)參與病理性血管重塑的機制假說。另一方面，有研究指出EPC產(chǎn)生的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)和尿激酶型纖溶酶原激活物可調(diào)節(jié)血管壁的膠原和基質(zhì)代謝，理論上可使血管壁厚度增加，僵硬度增高，加重PTS。

此外，EC還有可能在TGF-β等分子的誘導下進行內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-mesenchymal transition,EndMT)，促進血管壁鈣化及纖維化，造成靜脈閉塞，但該作用僅在門靜脈纖維化中得到證實，而在DVT形成中尚須進一步驗證[6-8]。

2.2 VSMC VSMC位于靜脈的中膜和外膜，是具有高度可塑性的特化細胞。在血栓等應激條件下，高度分化的VSMC可重新進入細胞周期并發(fā)生去分化，轉(zhuǎn)化為合成型VSMC，并發(fā)生增殖和遷移行為。

血管內(nèi)膜增厚是DVT后不良靜脈管壁改變的標志之一，其特征是血管壁中平滑肌過度浸潤，ECM過度沉積[9]。作為慢性靜脈管壁損傷中最主要的血管駐留細胞，VSMC增殖并失去部分收縮性，表型轉(zhuǎn)化為合成型，通過釋放MMP等蛋白酶和TGF-β等生長因子以促使ECM中的膠原代謝發(fā)生紊亂[10]，導致管壁出現(xiàn)肥厚區(qū)，收縮性降低，剛性增高，彈性受損，使靜脈壁順應性更低，保持生理形狀的能力更差[11]。

2.3 肌成纖維細胞(Myofibroblasts) 肌成纖維細胞是一個異質(zhì)性的細胞群，具有多種來源的病理特異性前體細胞，包括常駐的成纖維細胞和血管壁的各種細胞，如周細胞、內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞。纖維化疾病中ECM順應性降低的主要原因是被激活的成纖維細胞使ECM合成和重塑失調(diào)。在病理狀態(tài)下，這些成纖維細胞去分化為肌成纖維細胞，并且這種激活是持續(xù)的，并不會發(fā)生凋亡或靜止[12]。肌成纖維細胞兼具分泌和收縮表型，其在局部組織中施加高的收縮力，結合分泌導致過量的ECM沉積，局部微環(huán)境剛度便逐漸增加[13]，而這很可能是PTS管壁順應性降低的機制之一。

2.4 血小板 血小板富含TGF-β和纖溶酶原激活物(plasminogen activator-1,PAI-1)，前者是已知的組織纖維化的驅(qū)動因子，后者則是纖溶的抑制劑[14-15]。最近一項針對循環(huán)血小板參與PTS血管重塑的研究[16]發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，血小板耗竭的實驗組中靜脈管壁的增厚程度更低，病理性管壁重塑更少，這種作用可能是通過血小板源性TGF-β的減少而發(fā)生。此外，實驗組中血栓的纖維化程度更低、VSMC對血栓侵襲程度更低，這也提示了血小板極有可能參與到血栓后組織纖維化進程中，并參與VSMC的表型轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)。

2.5 單核細胞和巨噬細胞(monocyte/macrophage，Mo/M?) Mo/M?是DVT形成后局部管壁炎癥調(diào)節(jié)及血栓再通的重要細胞成分，也是MMP、TGF-β的重要來源之一。Myers等[17]研究發(fā)現(xiàn)，口服P-選擇素抑制劑與靜脈管壁硬化程度降低有關，同時介導Mo等炎癥細胞的黏附聚集，間接提示Mo/M?在DVT形成后靜脈管壁纖維化損傷中起作用。此外，Mo能轉(zhuǎn)分化為成纖維細胞，并通過產(chǎn)生趨化因子配體21(CCL21)引導封閉重構。CCL21是一種被趨化因子體(CCR)7識別的趨化因子，位于靜脈壁某些間充質(zhì)祖細胞(纖維細胞)的表面。在CCL21的引導下，纖維細胞可以侵入被阻塞的靜脈壁中，通過釋放MMP-2/MMP-9和沉積膠原等方式支持閉塞性重構[18]。

3 ECM和MMP

ECM是包圍、支持組織和細胞的結構實體，Ⅰ型和Ⅲ型膠原是血管ECM的主要亞型。靜脈管壁ECM可以動態(tài)地與VSMC、成纖維細胞等細胞相互作用。ECM中膠原蛋白和彈性蛋白的絕對數(shù)量和相對數(shù)量決定了血管的生物力學特性——彈性蛋白缺乏或膠原蛋白過剩導致靜脈血管硬度增加和纖維化。

膠原溶解是正常靜脈血栓再通過程中炎性管壁重塑的關鍵一環(huán)，MMP是主要參與者之一。Deatrick等[19]在DVT形成的小鼠瘀血模型中發(fā)現(xiàn)，靜脈壁有類似于無菌性傷口愈合的晚期纖維化反應，Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的基因表達增多，MMP-2和MMP-9基因表達和活性增高。MMP與靜脈管壁的纖維化有較高相關性：Deatrick等[20]研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9與DVT形成后靜脈壁纖維化反應有關，MMP-9缺失與血栓損傷后中期(8 d左右)靜脈壁膠原蛋白減少有關，但是這種效應在21 d左右就有所減弱，MMP-9水平增高可能增加靜脈壁中的膠原蛋白沉積，促進纖維化的發(fā)生；相比于野生型大鼠，MMP-2基因敲除型大鼠管壁在8 d左右時膠原蛋白減少約35%，但是在21 d左右時無顯著差異，表明MMP-2缺失與血栓形成后中期靜脈壁膠原蛋白減少有關；此外，在MMP-9和MMP-2共敲除或MMP-9敲除聯(lián)合使用MMP-2抑制劑的動物模型中，靜脈壁的膠原蛋白沉積較單敲除MMP-2組顯著減少，血栓后靜脈壁也顯著變薄，膠原蛋白沉積減少[21]。MMP-9與MMP-2是目前研究較多的2種MMP，兩者對于管壁ECM中膠原纖維沉積的作用都有一定的時間窗，并且都可能對VSMC的遷移分化活性產(chǎn)生影響，從而介導管壁重塑的進程。

此外，小鼠模型證實體內(nèi)骨髓p53可以通過增強炎癥性管壁重塑調(diào)節(jié)靜脈血栓再通，p53的基因缺陷可能導致靜脈管壁ECM纖維化增加，MMP-2水平改變[22]。PTS相關基因多態(tài)性分析顯示，MMP、IL-6、Toll樣受體(TLR4、TLR9)、TIMP、膠原蛋白1型α2(COL1A2)、前膠原蛋白(procollagen)等基因與ECM纖維化改變有相關性[23]。但目前仍缺乏進一步的實驗數(shù)據(jù)支持上述觀點。

4 分子成分

4.1 TGF-β信號通路 TGF-β是一種組織修復相關的多功能生長因子。研究[24]結果表明，TGF-β通路與ECM相關基因表達及纖維化發(fā)生密切相關。VSMC、EC、肌成纖維細胞、巨噬細胞和一些血細胞(如血小板)被證明是TGF-β的主要來源。大量的臨床前研究[25]已經(jīng)證明，在不同的動物模型的不同器官中，抑制TGF-β信號通路具有抗纖維化作用。

研究[26]顯示，TGF-β主要通過調(diào)節(jié)ECM代謝參與管壁重塑。在VSMC、EC和成纖維細胞中，即使在低水平下，TGF-β1也能增加ECM蛋白的合成，如纖維連接蛋白(fibronectin,FN)、膠原和PAI-1。TGF-β可減少MMP的生成，刺激組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMP)的表達，從而抑制MMP對ECM蛋白的降解作用，導致基質(zhì)過度積累[26]。

TGF-β下游信號主要通過胞漿蛋白Smad傳導，Smads復合物轉(zhuǎn)運到細胞核中，充當轉(zhuǎn)錄因子，通過上調(diào)ECM完成關鍵基因的轉(zhuǎn)錄，如前膠原蛋白、FN、結締組織生長因子(CTGF)和PAI-1，引起ECM代謝改變。動脈粥樣硬化相關研究[27]結果顯示，TGF-β-Smad3通路的下調(diào)可以通過VSMC調(diào)節(jié)ECM代謝，表明內(nèi)源性Smad3在損傷反應中具有血管保護作用。動脈相關的研究顯示，TGF-β可以誘導管壁收縮性重塑，但這些結論仍須在靜脈管壁中進一步驗證。

除了經(jīng)典的Smad信號傳導通路之外，TGF-β還可以激活其他通路中的細胞外周調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、p38、JNK等蛋白。在VSMC中，TGF-β信號可以激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成員中的ERK。ERK與Smad之間存在一定聯(lián)系，ERK可以使Smad1/2/3連接區(qū)的絲氨酸殘基磷酸化。抑制ERK可以減少TGF-β信號激活的Smad磷酸化和下游的膠原生成啟動子激活，這表明ERK活性對TGF-β的最佳應答是必要的[28]。完全抑制ERK通路可以下調(diào)MMP-9表達，這些都與血管重塑密切相關[29-30]。此外，GTP結合蛋白Rho家族中的RhoA則是Smad激活的調(diào)節(jié)器。轉(zhuǎn)染顯性陰性RhoA可阻斷TGF-β1引起的Smad2和Smad3的磷酸化和核轉(zhuǎn)位[31]。RhoA和p38 MAPK通過激活血清反應因子SRF、GATA和依賴于MEF2的增強子參與TGF-β1誘導的VSMC分化[32]。

TGF-β在細胞層面通過影響VSMC、肌成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化，從而對這些關鍵細胞的命運產(chǎn)生影響；在分子層面，TGF-β影響管壁中局部MMP等ECM代謝因子的表達水平，參與管壁重塑。在PTS易感患者中，血栓后的靜脈管壁中由于慢性炎癥刺激、ECM僵硬度增高等因素導致TGF-β信號促纖維化作用被放大。其機制可能是由于激活TGF-β的因素同時被放大、抑制TGF-β信號傳導的通路被抑制，以及其他信號通路對TGF-β靶向促纖維化基因的協(xié)同作用[25]。TGF-β促纖維化機制在皮膚、腎、肝臟、肺中已有一定的研究基礎，但是靜脈中似乎少有涉及，具體的機制仍須進一步驗證。

4.2 PAI-1 PAI-1是組織型纖溶酶原激活物和尿激酶型纖溶酶原激活物的主要生理抑制劑，屬于絲氨酸蛋白酶超家族。纖溶酶對于靜脈血栓的再通具有非常重要的作用，PAI-1是纖溶酶的主要調(diào)節(jié)器之一。Baldwin等[33]發(fā)現(xiàn)，DVT形成后纖溶酶的活性改變可以導致不同的靜脈壁反應，PAI-1的減少導致的纖溶酶活性增高，雖然靜脈血栓再通有所改善，但是靜脈壁卻發(fā)生了更加嚴重的纖維化。隨后的研究對玻璃體結合蛋白敲除大鼠DVT模型進行評估發(fā)現(xiàn)，循環(huán)PAI-1水平的增高對靜脈壁纖維化具有保護作用，且與靜脈壁MMP活性呈負相關。無論是PAI-1的配體玻璃體結合蛋白敲除還是轉(zhuǎn)基因過表達，循環(huán)PAI-1水平增高都與血栓后靜脈管壁纖維化程度降低有關[34]。

5 總結與展望

病理性靜脈管壁重塑是PTS長期演變的重要一環(huán)，涉及EC、VSMC、粒細胞、M?、血小板等細胞成分，以及眾多細胞因子和信號通路的調(diào)節(jié)。早期靜脈壁纖維化發(fā)生在與血栓直接接觸后，粒細胞浸潤管壁，隨后Mo浸潤，DVT形成后靜脈壁早期損傷與膠原蛋白和彈性蛋白溶解有關[35]。后期靜脈壁纖維化可能是由血栓新生血管和慢性炎癥等其他因素驅(qū)動[36]。DVT形成后，不同時空條件下，不同的細胞通過復雜的分子交流，共同導致了病變段管壁僵硬、纖維化甚至閉塞。目前,PTS管壁重塑的研究聚焦于管壁纖維化機制，以ECM代謝和TGF-β為重點，探討不同的細胞表型轉(zhuǎn)變造成的管壁病理性結局。但是缺乏對DVT形成后不同時期的管壁中各種細胞成分及信號通路的研究。今后通過對相同時間窗內(nèi)的各種細胞的作用及協(xié)調(diào)關系進行深入研究，進一步闡明DVT形成后不同階段管壁的重塑反應，能夠為深入探究PTS預防方法提供理論依據(jù)。