病原微生物負荷及炎癥因子與頸動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的相關性研究

吳鑒今 黃 通 沈 旭 何天嘯 曲樂豐

頸動脈粥樣硬化斑塊(carotid atherosclerotic plaque, CAP)的穩(wěn)定性減弱時，可發(fā)生脫落，引起遠端顱內(nèi)動脈阻塞，造成缺血性腦卒中。約30%～50%缺血性腦卒中由斑塊脫落誘發(fā)，因此CAP穩(wěn)定性的早期評估和有效控制意義重大[1]。近期研究[2]結果顯示，全身或局部持續(xù)感染引起的炎癥反應可能與動脈粥樣硬化進展及斑塊穩(wěn)定性減弱有關。2002年，Epstein[3]提出病原微生物負荷(pathogen burden, PB)的概念，即假設體內(nèi)感染的病原微生物種類、數(shù)目與動脈粥樣硬化的發(fā)生相關；從多種病原微生物的整體視角探討感染在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中的作用。人類軟骨糖蛋白-39(YKL-40)是一種新型炎癥標志物，為肝素和殼質(zhì)酶結合的植物凝集素，可通過促進細胞黏附、血管平滑肌遷移和小血管形成，影響CAP的形成與發(fā)展。目前，尚缺乏PB和YKL-40與CAP穩(wěn)定性的相關性研究。2013年起，本團隊已著手建立CAP的臨床生物樣本庫，收集病原微生物感染與CAP穩(wěn)定性的相關數(shù)據(jù)。目前，樣本庫在不斷豐富中，且長期隨訪納入的樣本隊列。本研究通過回顧性分析前期收集CAP患者臨床資料，旨在探索血清學和斑塊組織學PB值及YKL-40等炎癥因子與CAP穩(wěn)定性之間的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集海軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院血管外科自2013年4月—2015年3月門診收治的經(jīng)頸動脈血管超聲明確診斷為CAP，并收錄于CAP臨床生物樣本庫的232例患者資料，其中男130例、女102例，中位年齡67歲。納入標準：①年齡范圍40～85歲；②依據(jù)美國2011年多學科聯(lián)合制訂的顱外頸動脈與椎動脈治療指南，頸動脈血管超聲檢查明確診斷為CAP；③患者及其家屬均知情同意。排除標準：①合并炎癥性疾病(如感染、自身免疫性疾病等)；②合并嚴重的肝臟或腎臟疾病；③惡性腫瘤；④意識不清或無法交流；⑤頸動脈閉塞。根據(jù)《頸動脈狹窄診治指南》[1]的內(nèi)容，收集符合手術指征且接受頸動脈內(nèi)膜斑塊切除術的58例患者的頸動脈斑塊組織學資料。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核、批準(倫理號：2016SL017)。

1.2 方法

1.2.1 頸動脈情況評估及患者分組 由具有3年及以上臨床經(jīng)驗的同一位超聲科醫(yī)師完成相關檢查。依據(jù)世界超聲醫(yī)學與生物學聯(lián)合會制訂的共識[4]，對斑塊致頸動脈狹窄程度進行評估，分為輕度狹窄(狹窄程度<50%)組(89例)、中度狹窄(狹窄程度50%～69%)組(71例)和重度狹窄(70%～99%)組(72例)。依據(jù)美國心臟協(xié)會(American Heart Association，AHA)分型[5]和《中國健康體檢人群頸動脈超聲檢查規(guī)范》[6]對斑塊的形態(tài)學、內(nèi)部回聲情況、表面纖維帽的完整性等進行綜合分析，以評估斑塊的穩(wěn)定性，將患者分為血清學穩(wěn)定斑塊組(128例)和不穩(wěn)定斑塊組(104例)；同時，對接受頸動脈內(nèi)膜斑塊切除術的58例患者，按照超聲和術后病理學檢查結果，分為組織學不穩(wěn)定斑塊組(21例)和穩(wěn)定斑塊組(37例)。

1.3 觀察指標

1.3.1 一般資料 患者的年齡、性別、BMI、合并癥(高血壓病、糖尿病、冠心病)、吸煙史，LDL-C、TC、TG、高密度脂蛋白(HDL)水平。

1.3.2 血清學病原微生物及炎癥因子資料 患者禁食≥8 h，晨起空腹采血。檢測的血清學病原微生物抗體，包括EB病毒抗體(EBV IgG)、單純皰疹病毒1抗體(HSV1 IgG)、單純皰疹病毒2抗體(HSV2 IgG)、巨細胞病毒抗體(CMV IgG)、幽門螺桿菌抗體(H.pyloriIgG)、肺炎衣原體抗體(CPN IgG)。血液標本交付檢驗科檢測，如上述抗體水平超過Muliskan MK3酶標儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]檢測數(shù)值的正常上限，則以陽性表示。PB值的計算方法為所有陽性抗體數(shù)目求和，例如某患者EBV IgG、H.pyloriIgG和CPN IgG陽性，即PB值記為“3”。血清學炎癥因子包括超敏C反應蛋白(hs-CRP)和YKL-40，采用免疫散射比濁法檢測標本hs-CRP表達水平，應用Human YKL-40/CHI3L1 ELISA LanpaiBio?[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]試劑盒檢測YKL-40表達水平，結果以絕對值表示。

1.3.3 組織學病原微生物及炎癥因子資料 頸動脈內(nèi)膜斑塊切除術后30 min內(nèi)進行斑塊的組織修整、編號和保存，以10%甲醛溶液行組織固定，并行免疫組織化學染色。檢測組織斑塊中是否存在EBV IgG、H.pyloriIgG、CMV IgG、CPN IgG的陽性表達。組織學PB值的計算方法同血清學PB值。應用IMAGE-PRO PLUS軟件分析組織學hs-CRP和YKL-40的表達情況，計算染色陽性面積百分比。

2 結 果

2.1 血清學PB值及炎癥因子水平與頸動脈狹窄程度的關系 輕度、中度、重度狹窄組間患者的年齡、BMI值，以及男性性別、各合并癥、有吸煙史的占比的差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。中度和重度狹窄組的TC水平均較輕度狹窄組顯著增高(P值均<0.001)，重度狹窄組的TG較輕度和中度狹窄組顯著增高(P=0.001、0.004)，重度狹窄組的HDL較中度狹窄組顯著降低(P<0.05)。3組間血清學炎癥因子水平、各病原微生物抗體的陽性率和PB值的差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。見表1。

2.2 血清學PB及炎癥因子與CAP穩(wěn)定性的關系

2.2.1 一般資料、血清學PB值及炎癥因子比較 血清學穩(wěn)定斑塊組與不穩(wěn)定斑塊組一般資料比較的差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。血清學不穩(wěn)定斑塊組HSV1 IgG陽性率、H.pyloriIgG陽性率、CPN IgG陽性率、PB值及YKL-40水平均顯著高于穩(wěn)定斑塊組(P值均<0.01)；兩組hs-CRP水平的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 不同狹窄程度的CAP患者的臨床資料及血清學標志物的比較

與輕度狹窄組比較：①P<0.001。與中度狹窄組比較：②P<0.05

表2 不同斑塊穩(wěn)定性的CAP患者的臨床資料及血清學標志物的比較

2.2.2 血清學標志物與CAP穩(wěn)定性的相關性分析 Spearman 相關性分析結果顯示，HSV1 IgG陽性、H.pyloriIgG陽性、CPN IgG陽性、PB值、YKL-40水平與CAP穩(wěn)定性均呈正相關(P值均<0.01)；其中，血清學PB值和YKL-40水平與CAP穩(wěn)定性的相關性較強(r=0.436、0.823)。見表3。

2.2.3 CAP穩(wěn)定性的血清學多因素分析 校正混雜因素后，以CAP穩(wěn)定性作為因變量進行二元有序logistic回歸分析結果示， 不穩(wěn)定斑塊組血清學PB值和YKL-40水平增高均為CAP不穩(wěn)定的獨立危險因素。見表4。

表3 血清學標志物與CAP穩(wěn)定性的相關性分析

表4 CAP穩(wěn)定性的血清學指標的logistic回歸分析

2.3 組織學PB值及炎癥因子與CAP穩(wěn)定性的相關性

2.3.1 一般資料、組織學PB值及炎癥因子比較 組織學不穩(wěn)定斑塊組和穩(wěn)定斑塊組的一般資料比較的差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。組織學不穩(wěn)定斑塊組H.pyloriIgG陽性率、CPN IgG陽性率、PB值均顯著高于穩(wěn)定斑塊組,hs-CRP和YKL-40染色陽性面積均顯著大于穩(wěn)定斑塊組(P值均<0.05或0.001)。見表5和圖1、2。

表5 不同斑塊穩(wěn)定性CAP患者臨床資料及組織學標志物比較

A 穩(wěn)定斑塊組 B 不穩(wěn)定斑塊組圖1 CAP的hs-CRP免疫組織化學染色(脂質(zhì)池右側細胞呈棕黃色陽性反應)示意圖(×200)

A 穩(wěn)定斑塊組 B 不穩(wěn)定斑塊組圖2 CAP的YKL-40免疫組織化學染色(斑塊基底部細胞呈棕黃色陽性反應)示意圖(×200)

2.3.2 組織學標志物與CAP穩(wěn)定性的相關

性分析 Spearman相關性分析結果顯示，H.pyloriIgG陽性率、CPN IgG陽性率、PB值、hs-CRP和YKL-40陽性染色面積與CAP穩(wěn)定性呈正相關(P值均<0.05)；其中，組織學hs-CRP和YKL-40陽性染色面積與CAP穩(wěn)定性的相關性較強(r=0.509、 0.809)。見表6。

表6 組織學標志物與CAP穩(wěn)定性的相關性分析

2.3.3 CAP穩(wěn)定性的組織學多因素分析 校正混雜因素后，以CAP穩(wěn)定性作為因變量進行二元有序logistic回歸分析結果示，不穩(wěn)定斑塊組組織學YKL-40陽性染色面積為CAP不穩(wěn)定的獨立影響因素。見表7。

表7 CAP穩(wěn)定性的組織學指標logistic回歸分析

3 討 論

據(jù)2021年發(fā)布的全球疾病負擔(global burden of disease, GBD)研究[7]統(tǒng)計，腦卒中是造成我國老年人壽命年損失的第1位病因，且發(fā)病率以每年8.7%的速率上升。流行病學研究[5]顯示，約30%～50%的缺血性卒中由不穩(wěn)定CAP脫落導致顱內(nèi)栓塞引起。不穩(wěn)定斑塊又被稱為“易損斑塊”,其最主要的病理特征為含較大的壞死核心，表面附以較薄的纖維帽(厚度<65 μm)，伴單核細胞、巨噬細胞浸潤及炎癥活動，血管內(nèi)皮損傷及表面血小板聚集，斑塊內(nèi)破裂出血合并繼發(fā)性血栓形成和狹窄。研究[2]顯示，除高血壓、高脂血癥、吸煙、糖尿病、高同型半胱氨酸血癥等傳統(tǒng)高危因素外，急、慢性感染及其相關的炎癥反應也是影響動脈粥樣硬化及其斑塊穩(wěn)定性的重要因素。常見的病原微生物包括H.pylori、CPN、EBV、HSV-1、HSV-2和CMV。近年來，口腔和胃腸道病原微生物區(qū)系也成了研究熱點[8]。北曼哈頓研究(Northern Manhattan study, NOMAS)和福岡動脈粥樣硬化試驗(Fukuoka Harasanshin atherosclerosis trial, FHAT)等大型臨床試驗證實，在其他高危因素基本相同的情況下，H.pylori感染與缺血性腦卒中的發(fā)生密切相關；也有研究者在發(fā)生腦卒中患者的頸動脈和顱內(nèi)動脈壁上檢測到CPN，提示其與頸動脈粥樣硬化和缺血性腦卒中可能相關[9]。

關于感染影響CAP穩(wěn)定性的潛在機制如下。①直接影響。病原微生物以間歇性、隱匿性或頓挫性的方式直接感染血管內(nèi)皮細胞，或先感染血液中的單核細胞再進入血管壁后轉化為巨噬細胞，促進各種炎癥反應的發(fā)生，降低斑塊穩(wěn)定性。表現(xiàn)為短暫性菌血癥后易損斑塊破裂，從而發(fā)生臨床事件。Smeeth等[10]對19 063例首次發(fā)作腦卒中患者的調(diào)查研究結果顯示，在診斷為呼吸道感染或尿路感染后的第1天內(nèi)，患者新發(fā)腦卒中的風險最高，而在病程的隨后幾周風險逐步降低。②間接影響。感染誘導的訓練性免疫(trained immunity)反應亦是CAP形成的重要機制之一，單核或巨噬細胞在受到病原體或其產(chǎn)物的短暫刺激后，可促使機體形成一種全身性、持久性的過度激活狀態(tài)，增加CAP進展風險[11]。

人體內(nèi)可同時存在多種病原微生物的感染，或在感染后發(fā)生免疫炎癥反應，因此急需一項指標，從整體角度評估感染對CAP的影響及其預后。PB概念的提出，為探討感染和炎癥反應對CAP穩(wěn)定性的影響作用提供了新的視角。既往研究[12-13]發(fā)現(xiàn)，冠狀動脈斑塊的組織學PB值越高，斑塊穩(wěn)定性越差，發(fā)生ACS的風險越高，而血清學和組織學PB值與CAP穩(wěn)定性的相關性尚存爭議。此外，不同地域人群常見的病原微生物感染的種類和比例存在較大差異。例如，中國人群的病原微生物感染以H.pylori為主，現(xiàn)癥感染率高達64%，顯著高于歐美國家[14]。經(jīng)筆者臨床實踐和分析發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)眾多CAP患者的臨床特點與國外報道的結果存在一定差異，主要表現(xiàn)：部分患者無傳統(tǒng)動脈粥樣硬化的高危因素，但癥狀性、閉塞性、多支多處合并性病變的比例卻更高[15]，因此亟待探究中國人群PB值與CAP穩(wěn)定性之間的相關性。本研究結果顯示，不穩(wěn)定斑塊組血清學HSV1、H.pylori和CPN的IgG陽性率，以及組織學H.pylori和CPN 的IgG陽性率顯著增高，且血清學PB值與CAP穩(wěn)定性獨立相關。本研究初步證實了中國人群病原微生物感染與CAP穩(wěn)定性之間的相關性，并發(fā)現(xiàn)H.pyloriIgG陽性也與CAP穩(wěn)定性顯著相關，揭示了中國人群CAP病變特點不同于國外的可能原因。未來臨床遇到無傳統(tǒng)高危因素的CAP患者，可行血清學病原微生物抗體檢測并計算PB值，若PB值較高，則需警惕斑塊存在不穩(wěn)定風險并予以預防性治療。

近年來，hs-CRP和YKL-40是研究感染及炎癥反應與CAP穩(wěn)定性關系的熱點因子。hs-CRP為經(jīng)肝臟合成的一種非特異性炎癥標志物，感染、炎癥、組織損傷或自身免疫反應均可引起其水平升高。Gu等[16]的中介分析證實，血清學hs-CRP水平可能是缺血性卒中和CAP穩(wěn)定性的獨立預測指標，但其準確性和特異性有待進一步探討。YKL-40又名幾丁質(zhì)酶3樣1蛋白(chitinase-3-like-1 protein)，是一個相對分子質(zhì)量為40 000 Da的肝磷脂和殼質(zhì)鏈接的凝集素，屬于哺乳動物甲殼質(zhì)酶樣蛋白家族，但無甲殼質(zhì)酶活性。YKL-40作為一種新發(fā)現(xiàn)的炎癥標志物，已被初步證實在巨噬細胞活化、組織重構和血管再生中發(fā)揮一定作用。筆者前期研究[17-18]發(fā)現(xiàn)，H.pylori感染致CAP的模型小鼠的YKL-40水平顯著增高，提示其具有評估CAP穩(wěn)定性的潛在價值。Wang等[19]檢測了1 132例CAP患者血管超聲檢查結果及血清學YKL-40水平，發(fā)現(xiàn)YKL-40水平的高低與超聲確定的CAP不穩(wěn)定性顯著相關。本研究通過多因素分析證實，血清學及組織學YKL-40 水平為影響CAP穩(wěn)定性的獨立危險因素，高表達患者存在更高的斑塊不穩(wěn)定風險。

本研究尚存一些局限。首先，基于單中心回顧性橫斷面研究設計，本研究樣本量有限，其結論有待多中心、更大樣本量的研究確證。其次，受限于檢測條件，本研究僅選擇常見病原微生物，沒有檢測更多種類的病原微生物感染情況，故數(shù)據(jù)的全面性有待完善。最后，本研究僅檢測了相關病原微生物的血清學和組織學抗體水平，沒有檢測核酸表達情況，因此僅獲得了既往感染的間接證據(jù)，尚未獲得當前感染的直接證據(jù)。

綜上，本研究從血清學和斑塊組織學角度初步闡明了PB值及炎癥因子與國人CAP穩(wěn)定性之間的相關性，血清學PB值、血清學及組織學YKL-40水平是影響CAP穩(wěn)定性的獨立危險因素。因此，PB和YKL-40有望成為預測、評估CAP穩(wěn)定性的潛在靶標。