lncRNA-GAS5/miRNA21 ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在高氧性急性肺損傷發(fā)病過程中的作用研究①

石 磊 付 豹 何 英 廖貞亮 陳 濤 陳 淼（遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，遵義 563000）

高氧性急性肺損傷（hyperoxia-induced acute lung injury，HALI）是氧療最典型的并發(fā)癥，可進一步發(fā)展為成人急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）及新生兒支氣管肺發(fā)育不良，是導(dǎo)致患者死亡及新生兒支氣管發(fā)育不良的主要原因之一［1-2］。肺泡上皮細胞參與肺組織免疫調(diào)節(jié)、肺水轉(zhuǎn)運、肺泡表面活性物質(zhì)合成分泌、增殖、分化和修復(fù)等過程。研究表明，高氧可導(dǎo)致肺泡上皮細胞凋亡，促進HALI發(fā)生發(fā)展［3］。微小RNAs（miRNAs）是一組由18～25個核苷酸組成的高度保守的非編碼單鏈RNAs，長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一組不具有編碼蛋白質(zhì)能力的功能性長鏈RNA，兩者參與多種疾?。ò毙苑螕p傷）發(fā)病過程［4-5］。研究表明，miR-21在HALI進展中表達下調(diào)，且miR-21可抑制大鼠肺泡上皮細胞早期凋亡，采用慢病毒過表達miR-21能夠顯著改善大鼠HALI［6-7］。近年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA能夠作為競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA，一個RNA可調(diào)節(jié)多個靶基因，同一個靶基因可被不同RNA調(diào)節(jié)，調(diào)控同一靶點RNA間構(gòu)成競爭關(guān)系）吸附miRNAs，上調(diào)miRNA靶基因表達，發(fā)揮生物學(xué)功能。研究表明，lncRNA-GAS5能夠通過負調(diào)節(jié)細胞內(nèi)miR-21水平從而調(diào)控miR-21對靶基因的抑制［8-10］。因此推測HALI發(fā)病過程中miR-21水平可能受lncRNA-GAS5調(diào)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物SPF級雄性SD大鼠購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，體質(zhì)量約200 g，許可證號：SCXK（京）2019-0009。

1.1.2 主要試劑 慢病毒載體由北京博恒科創(chuàng)生物科技有限公司制備；IL-1β、IL-6、TNF-αELISA試劑盒購于R&D system公司；AnnexinⅤ-PI凋亡染色試劑盒購于美國BD公司；抗大鼠GAPDH、IκBα、NF-κB p65、Lamin B1抗體均購于Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 動物干預(yù)方式SD大鼠隨機分為空白組（n=6）、模型組（n=12）、lncRNA組（n=12）和lncRNA聯(lián)合miRNA組（n=12），所有大鼠采用異氟烷麻醉，空白組不做任何處理，模型組靜脈注射200μl慢病毒空載體（6×106TU/ml，飽和轉(zhuǎn)染劑量），lncRNA組靜脈注射200μl lncRNA-GAS5過表達慢病毒載體（6×106TU/ml），lncRNA聯(lián) 合miRNA組 靜 脈 注 射200μl lncRNA-GAS5過表達慢病毒載體（6×106TU/ml）和200μl miR-21過表達慢病毒載體（6×106TU/ml），轉(zhuǎn)染72 h（飽和轉(zhuǎn)染時間）后，模型組、lncRNA組和lncRNA聯(lián)合miRNA組大鼠給予高氧處理，建立HALI模型：自制高氧箱（45 cm×30 cm×35 cm的有機玻璃容器，頂端開孔接氧氣接頭，側(cè)面有等大出氣孔，可接氧氣檢測儀），將SD大鼠置于高氧箱中飼養(yǎng)，25～27℃，50%～70%濕度，箱內(nèi)氧濃度持續(xù)≥90%，箱內(nèi)放置鈉石灰吸收大鼠呼出的CO2，保持箱內(nèi)CO2濃度＜0.5%，23.5 h/d持續(xù)給氧，上午定時開艙0.5 h添加食物、水以及更換墊料［11］。

1.2.2 呼吸指標檢測 高氧處理48 h后取大鼠動脈血檢測，分析氧合指數(shù)（oxygenation index，OI）和呼吸指數(shù)（respiration index，RI）。OI=PaO2/FiO2，其中PaO2為動脈氧分壓，F(xiàn)iO2為吸入氧濃度，本研究FiO2均記為90%。RI=P（A-a）O2/PaO2，其中P（A-a）O2為肺泡-動脈血氧分壓差，PaO2為動脈血氧分壓。

1.2.3 肺組織病理及濕/干重比（W/D）分析 高氧處理48 h后麻醉處死各組大鼠，取大鼠右肺組織，10%甲醛固定24 h，脫水，石蠟包埋，制備石蠟切片，進行HE染色。每只大鼠隨機選取20個高倍視野（×400），采用Gustavo Matute-Bello等評分系統(tǒng)進行獨立評分。按照肺泡及肺泡間質(zhì)中性粒細胞個數(shù)、透明膜個數(shù)、蛋白碎片填充個數(shù)及肺泡間隔厚度進行評分，并取評分平均值。取大鼠左肺，快速去除周圍結(jié)締組織，濾紙擦干組織表面水分稱重，記為肺濕重（W），將肺組織80℃烘烤，每日稱重至恒重，記為肺干重（D），計算肺W/D。

1.2.4 血漿細胞因子水平檢測 高氧處理48 h后麻醉各組大鼠，取各組大鼠外周血，離心分離血漿，ELISA檢測各組大鼠血漿IL-1β、IL-6、TNF-α水平，參照IL-1β、IL-6、TNF-αELISA試劑盒說明書操作。

1.2.5 肺組織細胞凋亡分析 取20 mg左肺組織，0.25%胰酶+0.1%Ⅰ型膠原酶1∶1混合后注入肺組織，快速剪碎，放入搖床，150 r/min、37℃消化18 min，等體積終止液終止消化，并加入5 ml DNaseⅠ防止細胞成團，200目不銹鋼濾網(wǎng)過濾，收集濾液，離心，棄上清，紅細胞裂解液重懸沉淀，室溫靜置1 min，等體積2×EDTA終止，離心，棄上清，收集沉淀，即得到肺組織細胞（主要由肺泡上皮細胞和巨噬細胞組成）。AnnexinⅤ-PI凋亡染色試劑盒對分離的細胞進行染色，流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.2.6 RT-PCR高氧處理48 h后麻醉處死各組大鼠，取大鼠右肺組織，采用Trizol法提取海馬中RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，RT-PCR檢測海馬組織細胞因子lncRNA-GAS5、miR-21、IL-1β、IL-6、TNF-α RNA表達。lncRNA-GAS5正向引物：5＇-ATTTCAAGGGCTCCTCT-3＇，反向引物：5＇-TTGGCAAATCTTCTGTTC-3＇；miR-21正向引物：5＇-TGTACCACCTTGTCGG-3＇，反向引物：5＇-TGCTGTTGCCATGAGAT-3＇；IL-1β正向引物：5＇-GATGTCGAGAGTCCCAATGA-3＇，反向引物：5＇-GCTGGCATTCTGAGGCAAAA-3＇；IL-6正 向 引 物：5＇-GATTAGCCGAGGTATAGCCA-3＇，反向引物：5＇-ACTTGGAGCTTCGGACAAGA-3＇；TNF-α正向引物：5＇-GGCTAATTCAGTTAGGCGGC-3＇，反向引物：5＇-CGGAGGACTTTGTAATGCAC-3＇；GAPDH正向引物：5＇-CGTATCGGACGCCTGGTT-3＇，反向引物：5＇-CGTGGGTAGAGTCATACTGGAAC-3＇。

1.2.7 Western blot高氧處理48 h后麻醉處死各組大鼠，取大鼠右肺組織，RIPA裂解液對組織進行裂解，Western blot檢測裂解液中IκBα磷酸化及細胞核內(nèi)NF-κB p65核積累量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad 8.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料（xˉ±s）先進行正態(tài)檢驗，若服從正態(tài)分布，兩組間比較采用獨立t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；若不服從正態(tài)分布，則選擇非參數(shù)秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HALI大鼠肺組織lncRNA-GAS5和miR-21表達RT-PCR結(jié)果顯示，模型組大鼠肺組織lnc-RNA-GAS5表達顯著高于空白組，而miR-21表達顯著低于空白組（P＜0.01）；lncRNA組大鼠肺組織lncRNA-GAS5表達顯著高于模型組和空白組，而miR-21表達顯著低于模型組和空白組（P＜0.01）；lncRNA聯(lián)合miRNA組大鼠肺組織lncRNA-GAS5和miR-21表達均顯著高于模型組和空白組（P＜0.01，表1）。

表1 HALI大鼠肺組織lncRNA-GAS5和miR-21表 達（±s）Tab.1 lncRNA-GAS5 and miR-21 expressions in lung tissue of HALI rats（±s）

表1 HALI大鼠肺組織lncRNA-GAS5和miR-21表 達（±s）Tab.1 lncRNA-GAS5 and miR-21 expressions in lung tissue of HALI rats（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.01；compared with model group，2）P＜0.01.

Groups Control Model lncRNA lncRNA+miRNA lncRNA-GAS5 1.02±0.08 2.55±0.331）12.37±2.911）2）11.72±2.871）2）miR-21 1.08±0.05 0.77±0.081）0.54±0.061）2）10.11±2.251）2）

2.2 各組大鼠呼吸指標及肺W/D相比于空白組，模型組大鼠OI顯著降低，RI和W/D顯著升高（P＜0.01）；相比于模型組，lncRNA組大鼠OI顯著降低，RI和W/D顯著升高（P＜0.01）；相比于lncRNA組，lncRNA聯(lián)合miRNA組大鼠OI顯著升高，RI和W/D顯著降低（P＜0.05），接近模型組水平（表2）。

表2 各組大鼠呼吸指標及肺W/D（±s）Tab.2 Respiratory indexes and lung W/D of rats in each group（±s）

表2 各組大鼠呼吸指標及肺W/D（±s）Tab.2 Respiratory indexes and lung W/D of rats in each group（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.01；compared with model group，2）P＜0.01；compared with lncRNA group，3）P＜0.01.

Groups Control Model lncRNA lncRNA+miRNA OI/mmHg 381.91±36.77 268.83±31.681）192.46±29.591）2）255.06±31.931）3）RI 0.16±0.05 0.38±0.101）0.59±0.111）2）0.41±0.091）3）W/D 3.62±0.31 4.49±0.421）5.26±0.491）2）4.57±0.431）3）

2.3 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平 與空白組相比，模型組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，lncRNA組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高（P＜0.01）；與lncRNA組 相 比，lncRNA聯(lián) 合miRNA組 大 鼠 血 清IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著降低（P＜0.01，表3），接近模型組水平。

表3 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平（±s，ng/L）Tab.3 Serum levels of IL-1β，IL-6 and TNF-αof rats in each group（±s，ng/L）

表3 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平（±s，ng/L）Tab.3 Serum levels of IL-1β，IL-6 and TNF-αof rats in each group（±s，ng/L）

Note：Compared with control group，1）P＜0.01；compared with model group，2）P＜0.01；compared with lncRNA group，3）P＜0.01.

Groups Control Model lncRNA lncRNA+miRNA IL-1β 6.47±1.12 14.06±3.181）21.73±4.251）2）15.26±3.881）3）IL-6 22.24±7.24 47.74±10.871）69.86±14.161）2）49.02±11.621）3）TNF-α 40.70±14.33 80.60±21.851）117.73±26.381）2）82.12±25.751）3）

2.4 各組大鼠肺組織病理 與空白組相比，模型組大鼠肺間質(zhì)中性粒細胞顯著增多、肺泡間隔明顯增厚、病理評分顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，lncRNA組大鼠肺間質(zhì)中性粒細胞顯著增多、肺泡間隔明顯增厚及病理評分升高更為顯著（P＜0.01）；與lncRNA組相比，lncRNA聯(lián)合miRNA組大鼠肺間質(zhì)中性粒細胞、肺泡間隔明顯增厚及病理評分顯著改善（P＜0.01，圖1）。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化Fig.1 Pathological changes of lung tissues in each group

2.5 各組大鼠肺組織凋亡細胞數(shù) 流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠肺組織凋亡細胞數(shù)顯著增多（P＜0.01）；與模型組相比，lncRNA組大鼠凋亡細胞數(shù)顯著增多（P＜0.01）；與lncRNA組相比，lncRNA聯(lián)合miRNA組大鼠肺組織凋亡細胞數(shù)顯著減少（P＜0.01，圖2）。

圖2 各組大鼠肺組織細胞凋亡情況Fig.2 Apoptosis in lung tissue of rats in each group

2.6 各組大鼠肺組織IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達 與空白組相比，模型組大鼠肺組織IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，lncRNA組大鼠肺組織IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達顯著升高（P＜0.01）；與lncRNA組相比，lncRNA聯(lián)合miRNA組大鼠肺組織IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達顯著降低（P＜0.01，表4），接近模型組水平。

表4 各組大鼠肺組織IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平（±s）Tab.4 IL-1β，IL-6 and TNF-αmRNA levels of rats in each group（±s）

表4 各組大鼠肺組織IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平（±s）Tab.4 IL-1β，IL-6 and TNF-αmRNA levels of rats in each group（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.01；compared with model group，2）P＜0.01；compared with lncRNA group，3）P＜0.01.

Groups Control Model lncRNA lncRNA+miRNA IL-1β 0.97±0.06 3.87±1.161）5.69±1.631）2）3.96±1.281）3）IL-6 1.02±0.04 6.78±1.921）11.79±2.531）2）7.01±2.311）3）TNF-α 1.04±0.08 10.03±2.671）18.61±4.061）2）10.73±3.121）3）

2.7 各組大鼠肺組織NF-κB通路激活水平Western blot結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組大鼠肺組織IκBα磷酸化及細胞核內(nèi)NF-κB p65水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，lncRNA組大鼠肺組織IκBα磷酸化及細胞核內(nèi)NF-κB p65水平顯著升高（P＜0.01）；與lncRNA組相比，lncRNA聯(lián)合miRNA組大鼠肺組織IκBα磷酸化及細胞核內(nèi)NF-κB p65水平顯著降低（P＜0.01，圖3）。

圖3 各組大鼠肺組織NF-κB通路激活水平Fig.3 Activation level of NF-κB pathway in lung tissues of rats in each group

3 討論

miR-21是一種抗細胞凋亡基因，在細胞凋亡發(fā)生發(fā)展中起重要作用，在HALI動物模型及肺泡上皮細胞損傷模型中表達顯著降低。進一步實驗證明，miR-21能夠通過抑制肺泡上皮細胞中PTEN蛋白表達抑制肺泡上皮細胞凋亡，改善HALI［6-7］。miR-21參與HALI發(fā)生發(fā)展，但其特定的ceRNA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)涉及的分子機制尚不明確。

近年lncRNA-GAS5已成為ceRNA調(diào)控基因的研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)，人和鼠骨骼肌分化過程中，lncRNA可競爭性結(jié)合miRNA，調(diào)控miRNA及其靶基因表達，同時也受miRNA調(diào)控［12］。lncRNA-GAS5是一種在哺乳動物細胞生長和凋亡過程中起關(guān)鍵調(diào)控作用的lncRNA。研究顯示，乳腺腫瘤患者miR-21與lncRNA-GAS5表 達 呈 負 相 關(guān)，lncRNAGAS5是miR-21的負調(diào)節(jié)因子，可調(diào)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展過程中軟骨細胞存活［8-9］。本研究發(fā)現(xiàn)，HALI大鼠肺組織中l(wèi)ncRNA-GAS5表達顯著升高；miR-21水平顯著下降，與既往研究結(jié)果一致。提示lnc-RNAGAS5/miRNA21 ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能參與HALI發(fā)病過程。

通過慢病毒感染大鼠使大鼠體內(nèi)高表達lnc-RNA-GAS5或miR-21，給予48 h持續(xù)高氧處理，觀察大鼠呼吸指標及組織病理變化。OI反映肺部氧合功能，與肺損傷呈負相關(guān)；RI反映肺部氣體交換功能，與肺功能呈正相關(guān)［13］。W/D反映肺泡毛細血管膜通透性變化，通透性改變是急性肺損傷病理生理學(xué)的重要參數(shù)之一。研究發(fā)現(xiàn)，高氧處理的大鼠出現(xiàn)明顯急性肺損傷癥狀，表現(xiàn)為OI顯著降低，RI、肺W/D、病理評分、肺組織凋亡細胞數(shù)增多，而體內(nèi)過表達lncRNA-GAS5大鼠OI水平顯著低于模型組大鼠，RI、肺W/D、病理評分、肺組織凋亡細胞數(shù)顯著高于模型組大鼠，表明lncRNA-GAS5能夠加劇急性肺損傷。進一步發(fā)現(xiàn)，過表達miR-21能夠逆轉(zhuǎn)過表達lncRNA-GAS5介導(dǎo)的HALI，表明lncRNA-GAS5通過抑制miR-21表達促進HALI。

炎癥細胞，如中性粒細胞浸潤及炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α等）的分泌是HALI發(fā)病的重要原因［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，HALI模型組大鼠外周血IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白水平及肺組織IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達相比于健康大鼠顯著升高，而單獨過表達lncRNA-GAS5大鼠體內(nèi)IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA及蛋白水平相比于模型組進一步升高，而同時過表達lncRNA-GAS5和miR-21的大鼠體內(nèi)IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA及蛋白水平顯著低于單獨過表達lncRNA-GAS5大鼠，且其水平接近模型組大鼠，提示lncRNA-GAS5/miR-21調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能通過調(diào)控機體炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)肺損傷。NF-κB信號通路在炎癥反應(yīng)中扮演核心角色，控制轉(zhuǎn)錄DNA、細胞因子產(chǎn)生。靜息狀態(tài)下NF-κB與IκB結(jié)合，分布于細胞漿，機體受到刺激后，IκB發(fā)生磷酸化，磷酸化的IκB與NF-κB分離，NF-κB分子進入核內(nèi)調(diào)控生物學(xué)活動［15］。NF-κB信號通路在HALI發(fā)病過程扮演重要角色［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，HALI模型組大鼠肺組織IκBα磷酸化及細胞核內(nèi)NF-κB p65水平顯著高于健康大鼠，單獨過表達lncRNA-GAS5的大鼠肺組織IκBα磷酸化及細胞核內(nèi)NF-κB p65水平相比于模型組進一步升高，而同時過表達lncRNA-GAS5和miR-21的 大 鼠 肺 組 織IκBα磷 酸 化 及 細 胞 核 內(nèi)NF-κB p65水平顯著低于單獨過表達lncRNA-GAS5的大鼠，且其水平接近模型組。表明lncRNA-GAS5/miR-21 ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路激活調(diào)節(jié)HALI發(fā)生發(fā)展。

綜上，lncRNA-GAS5/miR-21參與HALI發(fā)病過程，lncRNA-GAS5通過負調(diào)節(jié)miR-21表達，間接激活NF-κB通路，促發(fā)HALI。本研究明確了lncRNAGAS5/miR-21 ceRNA在HALI中的調(diào)控機制，可通過開發(fā)以lncRNA-GAS5或miR-21為靶點的藥物為HALI防治提供新方法。