單核細胞與類風濕關節(jié)炎①

陶夢情 胡英豪 王丹丹 左 堅（皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院中醫(yī)科，蕪湖 241000）

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是最為常見的自身免疫性疾病，全球總發(fā)病率高達1%，患者群體規(guī)模龐大［1-2］。RA以關節(jié)滑膜炎為主要病理特征。正常條件下，滑膜腔是一個潤滑的無菌空間，細胞分布稀少，主要由滑膜組織內遷的巨噬細胞構成。RA條件下，滑膜組織增生肥大，且伴隨大量炎癥細胞浸潤；聚集的免疫細胞通過促進滑膜成纖維細胞增殖與破骨細胞激活直接參與滑膜炎發(fā)展進程［3-4］。異常高表達的自身抗原被自身反應性抗原遞呈細胞（antigen presenting cell，APC）識別（主要指固有免疫成員，包括單核-巨噬細胞，樹突狀細胞等），啟動適應性免疫應答，激活CD4+T細胞增殖與分化，加速IL-17和IFN-γ等細胞因子分泌［5］；Th1和Th17細胞依賴旁分泌途徑一方面刺激固有免疫系統(tǒng)合成促炎細胞因子，另一方面誘導B細胞向漿細胞分化，上調自身抗體合成率。隨后，自身抗體-抗原免疫復合物作用于特定免疫細胞表面的Fcγ受體，進一步放大單核-巨噬細胞的促炎功能［6］。上述促炎免疫環(huán)境中，血管內皮細胞、軟骨細胞、破骨細胞功能明顯改變，為血管新生、軟骨損傷、破骨增強等病理反應發(fā)生創(chuàng)造了條件。

根據經典理論模型，CD4+T細胞具有廣泛的病理活性，主導RA整體疾病進程，在相關研究中備受關注，而以單核-巨噬細胞為代表的固有免疫系統(tǒng)被長期忽視。關節(jié)定植巨噬細胞的促炎及組織破壞功能得以較好地闡明，而單核細胞有關研究略顯不足。但單核細胞在RA發(fā)生、發(fā)展中同樣發(fā)揮關鍵作用（圖1）：具備良好分化潛能，是樹突狀細胞、巨噬細胞、破骨細胞等RA病理效應細胞的重要前體來源；具備強大外分泌功能，其典型產物包括細胞因子、趨化因子、生長因子、基質金屬蛋白酶等，從而有效調控炎癥與骨代謝［7-9］；可作為APC激活T細胞。因此，充分闡明RA條件下單核細胞的激活因素及調控方式，有利于加深RA病理機制理解，開發(fā)創(chuàng)新性RA靶向治療方案。

1 單核細胞概況

人體中單核細胞占外周白細胞的3%～8%，是體積最大的細胞。單核細胞主要來源于CD34陽性造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC），在胎兒肝臟和成年人骨髓中，受多種集落刺激因子刺激，以集落刺激因子-1受體（colony-stimulating factor-1 receptor，CSF1R）依賴性方式首先分化為粒細胞-單核細胞前體或單核-樹突狀細胞前體，這些前體細胞繼續(xù)增殖并分化為原始單核細胞進入血液，主要表達CD117、CD34、CD33、HLA-DR（MHCⅡ表面受體），CD13呈 弱 表 達［10］；分 化 為 幼 稚 階 段 時，CD33、CD13、HLA-DR表達逐漸增強，同時開始表達CD64、CD11c、CD11b；進入成熟階段后，CD14、CD15等標志物開始表達［11］。血液中的單核細胞在骨髓和組織間遷移，并在組織內轉變?yōu)槌墒炀奘杉毎?，循環(huán)周期為1～5 d（圖1）。

圖1 單核細胞對RA的推動作用示意圖Fig.1 Schematic diagram of promoting effect of monocytes on RA

單核細胞在功能表型和表觀遺傳學上均具有高度可塑性。靜息狀態(tài)下，單核細胞通過高內皮小靜脈從血液進入淋巴結，或通過傳入淋巴管從組織進入淋巴結。非淋巴組織中的單核細胞在正常生理條件下一般具有3個去向：①維持其自身特性并最終凋亡；②CCR7表達上調，遷移至淋巴結；③在組織巨噬細胞生態(tài)位有空位的環(huán)境下分化為巨噬細胞。炎癥環(huán)境中，單核細胞向組織和淋巴結中大量浸潤，在微生物病原體存在下優(yōu)先分化為分泌TNF-α和iNOS的促炎樹突狀細胞或組織駐留巨噬細胞［12］。

以人類為例，單核細胞可根據脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）輔助受體CD14和清道夫受體CD16（FcγRⅢ）分布狀態(tài)分為3個亞類：CD14++CD16-經典型（classical monocytes，CMs）、CD14+CD16+中間型（intermediate monocytes，IMs）、CD14-CD16++非經典型（non-classical monocytes，NCMs）。CMs占健康人外周血單核細胞的90%，可迅速被招募至炎癥部位，發(fā)揮吞噬作用，但無典型炎癥特征，高表達CCR2［13-14］；NCMs通常被稱為巡邏單核細胞，在激活后可表現抗原呈遞及“炎癥”特征，低表達CCR2，高表達CX3CR1；IMs是兼具吞噬和炎癥功能的過渡性單核細胞，表達CCR2和CX3CR1，同時高表達HLADR、CD163及CCR5等［15］。根據趨化因子受體構成差異，其他動物來源單核細胞也可類似地分為經典與非經典兩種亞型。但由于表面標志物種屬特異性，其流式表型判定標準有別于人類。小鼠中，經典型和非經典型單核細胞分別表征為Ly6Chi和Ly6Clow［16］；大鼠中，兩者分別對應CD172a+CD43-和CD172a+CD43+細胞亞群（表1）［17］。值得注意的是，不同于人類，多數研究表明鼠類CMs而非NCMs具有典型促炎功能［16-17］。但該結論仍存在爭議，因為上述動物來源NCMs同樣具備向M1型巨噬細胞分化的潛能。進一步表明單核細胞具有高度可塑性，其病理生理功能復雜。

表1 單核細胞在人類及鼠類動物的分群Tab.1 Subsets of monocytes in humans and murines

2 單核細胞推動RA進展

與健康人群相比，RA患者外周血CMs比例降低，而CD16+單核細胞亞群增加（含NCMs及IMs），且該類細胞占比與疾病活動度呈正相關［18-20］。同時，單核細胞的其他相關表面標志物構成也發(fā)生較大改變。相比于健康人群，RA早期患者體內單核細胞，尤其是NCMs表面CD11c表達增加［21］。相似地，CD11b表達也得以上調，且這一現象與RA關聯性受體CCR2和CX3CR1表達改變同步發(fā)生。考慮到上述趨化因子受體與單核細胞向炎癥性巨噬細胞和破骨細胞定向分化密切相關，CD11b在RA患者中的異常高表達可視為RA特異性單核細胞的重要鑒定依據及疾病發(fā)展階段的輔助診斷指標［22］。與此對應，有效的抗風濕治療對單核細胞亞群分布具有恢復性調控作用。如經甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）治療后，隨著C-反應蛋白水平及其他炎癥指標下調，RA患者外周血IMs減少，而CMs增多［19］。

如上所述，病理條件下CD16+單核細胞具有獨特的受體表達譜，對RA發(fā)展具有推動作用。究其原因，從宏觀層面而言，由于STAT1通路下調，RA來源單核細胞大量分泌TNF-α［23］。TNF-α具有強大的促炎免疫活性，其過度合成是RA患者體內細胞因子網絡紊亂的主要特征，與疾病進展直接相關；靶向阻斷TNF-α已被證明是RA治療的有效手段。RA患者單核細胞來源TNF-α表達不僅通過其自身下游受體途徑直接誘發(fā)病理性炎癥反應，同時可基于旁分泌途徑促進其自身甚至其他免疫細胞分泌IL-1、IL-17等多種RA關鍵細胞因子，誘導T細胞異常分化［24］。

有研究進一步從亞器官角度初步闡明了上述細胞的病理功能，RA患者單核細胞周轉率提高，在血液循環(huán)時間減少，具有顯著關節(jié)聚集傾向［25］。這種現象與RA關節(jié)免疫環(huán)境及單核細胞受體表達譜特征有關：缺氧微環(huán)境中滑膜細胞高表達基質細胞衍生因子SDF-1，大量招募CXCR4+單核細胞，并在局部分化為巨噬細胞［26］。導致RA患者滑膜中以CD16+亞群為主的單核細胞數幾乎是外周血的4倍［21］。上述聚集現象與內皮細胞黏附分子表達增加也密切相關。定植于滑膜的單核細胞繼而有效改變局部免疫環(huán)境。首先，單核-巨噬細胞為B細胞長期存活提供環(huán)境，促進其產生RA診斷標志物抗環(huán)瓜氨酸抗體（anti-citrullinated protein antibodies，ACPA）［27］。ACCP陽性患者炎癥/抗炎單核細胞升高，分泌更多炎癥因子；而加劇的免疫紊亂又促進CD14+單核細胞分化為破骨細胞［28-29］。這一反饋機制表明單核細胞是RA關節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)破壞及骨損傷的重要推手。另一方面，IMs在滑膜中占主導地位，表達較多的HLA-DR和CD80/CD86，為CD4+T細胞激活提供第一和第二信號［24，30-31］；并分泌更多的TNF-α、IL-6和IL-1β促進IL-17分化［32-33］。T細胞激活引發(fā)的炎癥因子外溢又直接反饋性作用于單核細胞，并促進CD16與IgG免疫復合物生成，推動其向破骨細胞分化［34］。

3 RA單核細胞分化異常調控

3.1 經典免疫信號因素Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是固有免疫細胞特征性模式識別受體，也是單核細胞主要的功能性免疫分子，通過識別宿主的細胞碎片和微生物成分激活防御性促炎免疫應答。單核細胞的TLRs相關信號異常直接驅動RA患者關節(jié)病理反應發(fā)展。作為這一結論的直接證據，RA患者外周血中CD14+單核細胞高表達多種類型的TLRs，包括TLR2、TLR5、TLR7和TLR9等；而TLR5/7 mRNA表達與RA關節(jié)炎評分DAS28直接相關［35-36］。功能方面，TLR1/2/5/9激活可促進CMs等各型單核細胞分泌IL-6和TNF-α［37］；TLR5/7上調可導致CD14+細胞分化為破骨細胞［38-39］。該類受體的信號介導功能是上述病理反應的重要基礎。大部分TLRs結合配體后通過MyD88依賴性方式激活下游促炎通路，主要包括核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路，進而誘導單核細胞來源TNF-α和IL-6等促炎細胞因子分泌，促進RA進展［40］。

3.2 表觀遺傳因素 表觀遺傳因素是不容忽視的RA誘發(fā)因素。以甲基化為例，RODRíGUEZ-UBREVA等［41］發(fā)現活動期RA患者病情與循環(huán)單核細胞DNA總體甲基化水平密切相關；而炎癥性關節(jié)炎來源單核細胞DNA甲基化譜變化較正常人群更為顯著［42］。MOK等［43］進一步發(fā)現單核細胞內CYP2E1啟動子低甲基化是RA活動度的獨立預測因素；而CCL2啟動子區(qū)H3K4、H3K27、H3K36和H3K79的三甲基化亦可推動RA進展［44］。非編碼RNA是DNA修飾外的另一重要表觀遺傳調控因素。RA患者中可見單核細 胞 內lncRNA NTT/PBOV1軸 異 常 上 調［45］。lnc-RNA NTT是單核細胞炎癥的調節(jié)因子；而PBOV1在THP-1細胞中過表達可導致單核細胞G1期阻滯，分化為巨噬細胞［46］。兩者協同促進了RA單核細胞向促炎細胞類型分化成熟。相比于以上領域的有限認知，miRNAs在RA中的病理意義研究較為深刻，下面進行重點探討。

RA患者外周血和滑膜中CD14+單核細胞高表達miR-155，且與疾病活動度相關［47］。現有證據表明，miR-155可通過調節(jié)單核細胞極化、凋亡與分泌等功能在RA中發(fā)揮重要作用［47-50］。涉及的核心機制在于miR-155可選擇性結合細胞因子信號傳導抑制因子1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）的3＇UTR區(qū)域，通過抑制其轉錄水平間接促進促炎細胞因子分泌［48-49］。miR-33和miR-125a-5p也被證明與RA進展有關。RA單核細胞中miR-33可能通過抑制線粒體耗氧率和誘導胞內ROS積累刺激NLRP3炎癥小體信號［51］。miR-125a-5p異常高表達主要發(fā)現于幼年RA患者［52］。雖然其直接病理意義尚未闡明，但已明確這一現象與TLRs/NF-κB興奮有關，而IL-4刺激則抑制其表達［53-54］。因此，miR-125a-5p總體有利于單核-巨噬細胞促炎表型形成。miR-129-3p和miR-518a-5p對單核細胞遷移等病理生理功能也表現出促進作用［55-56］。

另一方面，miR-146a等對RA可能存在保護作用。miR-146a是TLRs信號通路主要的負調控因子；IMs和NCMs等單核細胞可能代償性上調miR-146a表達，抑 制TRAF6和IRAK1表 達，進而 抑制TLRs/NF-κB活化，通過負反饋機制限制炎癥過度發(fā)展［57］。因此，膠原誘導關節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）小鼠中Ly6Chi單核細胞過表達miR-146a可緩解骨損傷［58］。但miR-146a-5p在銀屑病關節(jié)炎患者外周血CD14+單核細胞中的表達可誘導破骨細胞活化、骨吸收［59］。表明其病理生理功能仍需進一步研究。臨床樣本分析發(fā)現，ACPA陽性RA患者單核細胞出現miR-let7a特異性表達降低［60-61］。miRlet7a可有效抑制IL-1、IL-6表達，導致RA患者炎癥反應持續(xù)發(fā)展［61］。

3.3 能量代謝因素 能量代謝對免疫細胞分化、成熟甚至功能發(fā)揮關鍵作用。RA活動期患者CD14+單核細胞耗氧量及線粒體代謝水平偏高。SHIRAI等［62］發(fā)現，慢性炎癥中致病性單核細胞和巨噬細胞葡萄糖過度利用，并共享代謝線路。針對性機制研究發(fā)現，RA來源單核-巨噬細胞中糖原合成激 酶-3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）失活，線粒體電子傳遞鏈活性增強，氧化磷酸化強化，ATP及ROS生成增加［63］。糖代謝狀態(tài)改變誘發(fā)或伴隨顯著免疫學功能變化。一方面，LPS等促炎因素刺激將磷酸化單核細胞內mTOR，繼而誘發(fā)同步的葡萄糖攝取/酵解上調及以CD11b+為特征的炎癥表型獲得［64］。RA背景下，mTOR激活可能與氨基酸轉運蛋白SLC7A5控制的亮氨酸內流有關。RA患者單核細胞中，SLC7A5表達顯著升高，糖酵解代謝隨之上調；阻斷SLC7A5將導致mTOR信號抑制，IL-1β產率降低［65］。另一方面，葡萄糖過度利用將導致ROS蓄積，從而促進胞質中丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2，PKM2）二聚化及入核轉移。后者作為蛋白激酶直接激活核轉錄因子STAT3，促進IL-6和IL-1β等轉錄表達；同時通過干預HIF-1α信號誘導IL-1β生成［66］。除糖代謝外，脂代謝模式也發(fā)生了同步改變。受缺氧環(huán)境中滑膜細胞誘導，RA患者關節(jié)處單核細胞中肉堿代謝物增加，促進CCL20釋放，單核細胞向破骨細胞分化的潛能及對Th17細胞的募集能力增強［67］。此外，關節(jié)炎模型小鼠單核細胞膽固醇外排基因Abca1、Apoe表達下調，對干細胞分化和髓外髓細胞生成發(fā)育與增殖具有深遠影響［68］。

4 靶向單核細胞的RA治療

4.1 細胞因子阻斷 促炎細胞因子是RA發(fā)生發(fā)展的核心驅動因素。其中大量關鍵細胞因子如IL-1、IL-6、TNF-α的主要來源包括炎癥單核細胞，而另一些細胞因子則可干預單核細胞分化和功能，從而影響后者免疫功能。因此，多種經典RA治療藥物具有單核細胞分泌干預活性。如MTX可有效抑制RA患者單核細胞中細胞因子產生及膜受體表達，首診患者外周血單核細胞總數、CMs、IMs偏高，對MTX的治療敏感性相對較低［69］。如青風藤堿已被證明可降低RA患者外周IMs比例，減少炎癥細胞因子如粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）、TNF-α、IL-1β、CXCL1、巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）等合成，進而緩解單核-巨噬細胞主導的局部炎癥與組織破壞［70］。

上述現象對靶向制劑開發(fā)極具啟發(fā)。已明確在TNF-α等刺激下，CD11b+單核細胞更易分化為破骨細胞，且促炎免疫能力增強。與這一結論對應，TNF抑制劑（tumor necrosis factor inhibitors，TNFi）可使循環(huán)中CMs亞群顯著減少，并通過下調其表面CXCR4、CCR2表達抑制其免疫活性［71］；單核細胞干預可進一步實現Treg分化增強及破骨細胞功能抑制［72］。此外，TNFi還可誘導幼稚單核細胞向NCMs分化成熟，避免高致病性IMs過度增加；下調NCMs中CD11b表達，增加其穿越內皮的難度，導致炎癥部位單核細胞浸潤減少［73］；此外，作用于跨模型TNF-α可進一步強化對單核細胞炎癥免疫功能的影響，并誘導其凋亡［74］。

其他單核細胞相關細胞因子的選擇性阻斷表現出類似治療潛力。靶向IL-6阻斷可誘導單核細胞凋亡，從而間接促進Treg分化，提高其分布比例。GM-CSF可刺激單核細胞表達HLA-DR和CD86，合成TNF-α和IL-1β，從而具備啟動適應性免疫的能力；GM-CSF信號阻斷原理上可逆轉上述過程，同時可刺激單核細胞分泌趨化因子CXCL-11，間接抑制T細胞增殖［75］。M-CSF也可通過影響單核細胞分化干預RA進程；基于兩例活動期RA患者的臨床試驗表明，M-CSF拮抗抗體可降低外周血IMs和NCMs分布比例，改善臨床癥狀［76］。

4.2 表面抗原拮抗 單核細胞表面標志物CD11b在髓系細胞分化的過程中發(fā)揮重要作用。RA患者體內CD11b表達顯著高于健康對照組；糖皮質激素有效治療后其表達趨于下降［77］。這一現象初步提示CD11b可能是RA的治療靶點。抗CD11b單克隆抗體可減少CIA小鼠體內單核細胞分布，抑制關節(jié)炎癥部位對單核細胞的招募，及相關破骨細胞分化。雷帕霉素通過作用于其受體mTOR能夠調控前體單核細胞內STAT5-IRF8信號通路，從而下調表面CD115表達。鑒于CD115可驅動單核細胞分化為巨噬細胞或破骨細胞，上述變化最終將有效緩解RA滑膜炎癥和關節(jié)破壞［78］。

4.3 信號通路調控Janus激酶（Janus kinase，JAK）作為重要的酪氨酸激酶，銜接了諸多細胞因子受體與下游信號轉導通路；同時JAK-STAT途徑又參與了細胞因子合成過程，被確定為RA炎癥性病變的關鍵信號傳導途徑之一。Peficitinib與Baricitinib可通過抑制滑膜成纖維樣滑膜細胞JAK-STAT通路，抑制多種促炎細胞因子分泌，阻斷單核細胞向炎癥部位趨化及后續(xù)炎癥分化過程［79-80］。FcγR通過胞內免疫受體酪氨酸活化基序激活酪氨酸激酶，啟動后續(xù)磷酸偶聯級聯反應，激活單核-巨噬細胞免疫功能；布魯頓酪氨酸激酶（Bruton's tyrosine kinase，BTK）通過結合FcγR介導免疫復合物免疫調控活性。此外，BTK還參與單核細胞來源破骨細胞分化過程，其選擇性抑制劑HM71224可有效抑制BTK介導的單核細胞激活，并抑制破骨細胞主導的骨結構破壞，有效治療實驗性小鼠關節(jié)炎［81］。已批準和正在開發(fā)的作用于單核細胞的RA治療藥物見表2。

表2 已批準和正在開發(fā)的作用于單核細胞的RA治療藥物Tab.2 Drugs approved and under development applies to monocytes for RA treatment

5 展望

現有常規(guī)RA治療藥物雖能緩解癥狀，但無法遏制疾病進程，且毒副作用明顯。近年興起的生物療法作用機制和靶點明確，短期臨床效果顯著，但存在安全風險。因此闡明RA發(fā)生發(fā)展過程不同階段免疫細胞的動態(tài)變化具有重要意義。識別主導RA單核細胞病理變化的分子機制，有利于開發(fā)RA精準治療新方案。早期診斷和適當治療可迅速控制RA進展，顯著改善肢體功能和關節(jié)結構。本課題組近期研究發(fā)現，煙酰胺磷酸核糖轉移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferase，NAMPT）介導的單核細胞炎癥極化對早期RA發(fā)展具有關鍵推動作用。考慮到NAMPT作為炎癥表型單核-巨噬細胞共有的特征性糖代謝重編程核心操控因素，及其靶向抑制對RA的顯著治療潛力，這一發(fā)現表明代謝水平調控亦可能是實現單核細胞靶向治療的策略［82-83］。