紫花苜蓿-銅綠假單胞菌聯(lián)合修復(fù)石油污染土壤

張金秋， 王帥杰， 王 露， 付雨潼

(燕山大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，河北 秦皇島 066004)

在中國能源生產(chǎn)結(jié)構(gòu)中，石油是僅次于煤炭的第二大能源種類[1]。隨著石油需求量的不斷增加，石油行業(yè)迅速發(fā)展。然而，石油在開采、儲(chǔ)存、運(yùn)輸、加工及使用過程中的溢出和泄漏造成了大面積的土壤污染[2-3]。石油進(jìn)入土壤后，不僅會(huì)改變土壤理化性質(zhì)，影響作物生長[4-5]，有毒組分還會(huì)在植物體內(nèi)積累并進(jìn)而危害人類健康[6-7]。石油造成的土壤污染已成為中國急需解決的問題。

目前，修復(fù)石油污染土壤的主要方法有物理法、化學(xué)法和生物法[8]。其中，原位生物修復(fù)因其經(jīng)濟(jì)、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注，可用于大規(guī)模的土壤污染治理[9]。土壤在受到石油污染后，石油組分中的難揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)會(huì)長期殘留在土壤中，對(duì)土壤中的營養(yǎng)結(jié)構(gòu)和微生態(tài)造成負(fù)面影響。在土壤中，具有石油降解能力的微生物相對(duì)較少，自然凈化非常緩慢，修復(fù)周期較長[10-11]。近年來，有研究表明[12-13]，在土壤中添加高效石油降解菌，可以有效解決土著石油降解微生物種群少、降解過程緩慢的問題，而將植物與微生物聯(lián)合用于修復(fù)石油污染環(huán)境，既可以提高彼此對(duì)不利環(huán)境的抵抗力，還能促進(jìn)石油的自然降解。因此，筆者在石油污染土壤中加入高效石油降解菌，并種植石油耐受性較強(qiáng)的植物——紫花苜蓿，探究植物-微生物聯(lián)合修復(fù)石油污染土壤的可行性，分析其綜合效應(yīng)機(jī)理。并對(duì)影響植物-微生物聯(lián)合修復(fù)效果的因素開展研究，優(yōu)化修復(fù)條件，為石油污染土壤的生物修復(fù)提供科學(xué)參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

土壤樣品采自秦皇島市某農(nóng)田，破碎及除雜質(zhì)后過2 mm篩備用，土壤樣品的理化性質(zhì)如表1所示。

表1 土壤樣品的理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of soil sample

0#柴油購于中國石油化工股份有限公司；紫花苜蓿種子購于秦皇島市某花卉市場；正己烷、石油醚、無水硫酸鈉、磷酸氫二鉀、尿素、營養(yǎng)瓊脂、醋酸、濃硫酸、硼酸、硫酸亞鐵、鉬酸銨、重鉻酸鉀，均為分析純，購于秦皇島化學(xué)試劑廠；酒石酸銻鉀，分析純，購于阿拉丁生化科技股份有限公司；鄰聯(lián)甲苯胺，分析純，購于廣州臻萃檢技術(shù)服務(wù)有限公司。

高效石油降解菌購于西安瑞捷生物有限公司，將菌劑在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化，得菌落形態(tài)如圖1 (a)所示。由圖1 (a)可以看出，培養(yǎng)基中的菌落表面光滑濕潤，且產(chǎn)生綠色色素。用掃描電鏡(EM-30AXN，歐波同有限公司產(chǎn)品)觀察菌株形態(tài)，結(jié)果如圖1 (b)所示。由圖1 (b)可以看到菌體呈桿狀，經(jīng)過16SrDNA生物分子學(xué)鑒定，該菌種屬于假單胞菌屬(Pseudomonassp.)，與銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosastrain)的同源性不低于99.86%。

圖1 高效石油降解菌的形態(tài)Fig.1 Morphology of efficient petroleum degrading bacteria(a) The colony morphology； (b) The morphology of strains

1.2 石油污染土壤的配制

將0#柴油與石油醚按照體積比1∶1于90 ℃的恒溫水浴鍋中蒸餾，得到標(biāo)準(zhǔn)油。每個(gè)花盆中均加入1.5 kg的去除雜質(zhì)的土壤，稱取一定量的標(biāo)準(zhǔn)油加入到花盆中，與土壤混拌均勻，放置在通風(fēng)處通風(fēng)2 d備用。

1.3 石油污染土壤修復(fù)實(shí)驗(yàn)

盆內(nèi)土壤中石油質(zhì)量分?jǐn)?shù)均設(shè)為0.6%，設(shè)計(jì)4組實(shí)驗(yàn)：對(duì)照組(CK)，紫花苜蓿修復(fù)組(OP)，銅綠假單胞菌修復(fù)組(OM)，紫花苜蓿-銅綠假單胞菌聯(lián)合修復(fù)組(PM)。每組設(shè)置3個(gè)平行樣。CK組不作任何處理，向OM、PM組花盆中加入30 g高效降解菌菌粉(污染土壤中菌劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20 g/kg)，與土壤混拌均勻。篩選顆粒飽滿、無蟲蛀的紫花苜蓿種子，分別向OP、PM組的花盆中播種60粒種子(種植密度為20棵/dm2)，埋至土下2 cm左右。所有實(shí)驗(yàn)場地溫度均為20～25 ℃，定時(shí)定量澆水，保持土壤含水量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為50%，定期翻耕。定期測定植物的生長狀況、土壤中的微生物數(shù)量及土壤中石油含量。

1.4 紫花苜蓿-銅綠假單胞菌聯(lián)合修復(fù)影響因素考察實(shí)驗(yàn)

為優(yōu)化紫花苜蓿-銅綠假單胞菌聯(lián)合修復(fù)條件，考察了土壤中石油污染程度、植株種植密度、菌劑用量、營養(yǎng)物(N、P)對(duì)石油污染土壤修復(fù)效果的影響?？疾焱寥乐惺臀廴境潭葘?duì)修復(fù)效果的影響時(shí)，土壤中石油初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別設(shè)置為0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%，污染土壤中菌劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20 g/kg，植株種植密度為20棵/dm2；考察植株種植密度對(duì)修復(fù)效果的影響時(shí)，植株種植密度設(shè)置為：10、20、30棵/dm2，土壤中石油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%，菌劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20 g/kg；考察菌劑用量對(duì)修復(fù)效果的影響時(shí)，土壤中菌劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)置為7、20、40 g/kg，土壤中石油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%，植株種植密度為20棵/dm2；考察營養(yǎng)物(N、P)對(duì)修復(fù)效果的影響時(shí)，土壤中營養(yǎng)物P的添加量為3.3 g K2HPO4/kg，土壤中N的添加量分別為8、13.3、40 g尿素/kg，使N、P元素的摩爾比分別為6∶1、10∶1、30∶1，土壤中石油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%，植株種植密度為20棵/dm2，菌劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20 g/kg。

1.5 分析及計(jì)算方法

土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、水分、pH值等理化性質(zhì)的測定參照GB 9834—1988、GB 7173—1987、GB 9837—1988、GB 7172—1987、NY/T 1377—2007標(biāo)準(zhǔn)方法；使用紫外分光光度計(jì)(WFZ-24A，上海棱光技術(shù)有限公司產(chǎn)品)和超聲波清洗器(KQ-100，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品)通過超聲萃取-紫外分光光度法測定土壤中石油含量；采用平板菌落計(jì)數(shù)法測定土壤中的微生物數(shù)量；使用可見光分光光度計(jì)(722SP，上海棱光技術(shù)有限公司產(chǎn)品)通過鄰聯(lián)甲苯胺比色法測定漆酶的活性。

土壤中石油污染物的去除率采用式(1)進(jìn)行計(jì)算，動(dòng)力學(xué)擬合方法見式(2)～式(4)。

η=[(w0-w)/w]×100%

(1)

零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程：

w0-w=k0t

(2)

一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程：

ln(w/w0)=-k1t

(3)

二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程：

(1/w)-(1/w0)=k2t

(4)

式中：η為石油的去除率，%；w0、w分別為土壤中石油初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)、土壤中石油殘留質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/kg；k0(mg/(kg·d))、k1(d-1)、k2(kg/(mg·d))分別為零級(jí)、一級(jí)、二級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同修復(fù)系統(tǒng)中石油的降解

不同修復(fù)系統(tǒng)中，土壤中石油的降解曲線如圖2(a)所示。由圖2(a)可以看出，CK組中，雖然未做任何修復(fù)處理，56 d后土壤中石油質(zhì)量分?jǐn)?shù)仍然減少了12.5%，這可能是由于石油的揮發(fā)和土壤中土著微生物的降解作用。相對(duì)于CK組，OM組的石油去除率提高近1倍，達(dá)23.6%，高效石油降解菌對(duì)石油污染物的降解能力遠(yuǎn)高于土著微生物。OP組的石油去除率為46.5%，約是OM組的1倍，比CK組提高了近3倍。經(jīng)觀察，OP組和PM組紫花苜蓿的莖長，葉片是三葉草形狀，面積大，蒸騰能力較強(qiáng)，吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力也較強(qiáng)。此外，有研究表明，紫花苜蓿根部會(huì)產(chǎn)生漆酶[14]，可以通過自由基催化反應(yīng)來氧化各種芳香族和非芳香族化合物，對(duì)石油有較好的降解作用。經(jīng)筆者研究測定，紫花苜蓿根系中的漆酶活性高達(dá)40 U/g，根際土中漆酶活性為22 U/g，非根際土壤也檢測到了低漆酶活性，因此紫花苜蓿降解石油污染物的能力較強(qiáng)。4組實(shí)驗(yàn)中，PM組的修復(fù)效果最好，第56 d時(shí)，其土壤中石油去除率高達(dá)71.9%，遠(yuǎn)高于OP組和OM組，甚至高于兩者之和。

根據(jù)圖2(a)中數(shù)據(jù)分別進(jìn)行了零級(jí)、一級(jí)、二級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合，結(jié)果表明，不同修復(fù)系統(tǒng)中石油的降解更符合準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)，見圖2(b)，即土壤中石油的降解速率與石油初始含量的一次方成正比關(guān)系，反應(yīng)速率常數(shù)從大到小順序依次為：PM組(0.0250 d-1)、OP組(0.0130 d-1)、OM組(0.0054 d-1)。

η—Oil removal rate； w0—Initial content of petroleum in soil; w—Residual content of petroleum in soil；CK—Control group; OP—Alfalfa remediation group; OM—Pseudomonas aeruginosa remediation group;PM—Alfalfa-Pseudomonas aeruginosa combined remediation group圖2 不同修復(fù)系統(tǒng)中石油的降解曲線及動(dòng)力學(xué)擬合Fig.2 Degradation curves and degradation kinetic fittings of petroleum in different remediation systems(a) Degradation curves; (b) Degradation kinetics

2.2 植物-微生物修復(fù)綜合效應(yīng)機(jī)理探究

如前所述，相對(duì)于單一微生物和植物紫花苜蓿和銅綠假單胞菌修復(fù)，紫花苜蓿-銅綠假單胞菌聯(lián)合修復(fù)系統(tǒng)中石油的去除率及降解速率均有明顯提高，甚至高于兩者的線性之和。為了探究產(chǎn)生綜合效應(yīng)的原因，測定了不同修復(fù)處理過程中，土壤中微生物的數(shù)量變化情況和紫花苜蓿的生長狀況，結(jié)果如圖3和圖4所示。

圖3 OM組和PM組微生物數(shù)量(N)的對(duì)比Fig.3 Comparison of microbial number (N)between OM group and PM group

由圖3可以看出，OM組和PM組微生物的生長均出現(xiàn)了一定的停滯期，但PM組略短，在8 d后微生物的數(shù)量開始呈現(xiàn)增長趨勢。整個(gè)修復(fù)過程中，PM組土壤中的微生物數(shù)量均多于OM組，特別是中后期，差異加大，這與植物的生長狀況密切相關(guān)，紫花苜蓿強(qiáng)大的根系為土壤中的微生物提供了更大的生存面積，其根系分泌物和更多的降解產(chǎn)物為微生物的生長繁殖提供更多的養(yǎng)分，促進(jìn)土壤中微生物的繁殖和生長。圖4結(jié)果表明，PM組不同時(shí)期紫花苜蓿的株高和葉寬均大于OP組，即植物的生長情況明顯優(yōu)于OP組，這可能是由于微生物的代謝作用使土壤中的石油降解加快，降解產(chǎn)物為植物提供了更多的營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)植物旺盛生長。在聯(lián)合修復(fù)體系中，植物和微生物表現(xiàn)出明顯的互生關(guān)系，彼此促進(jìn)生長，因此，表現(xiàn)出更好的修復(fù)效果。

圖4 OP組和PM組紫花苜蓿生長狀況對(duì)比Fig.4 Comparison of Alfalfa growth status betweenOP group and PM group

2.3 紫花苜蓿-銅綠假單胞菌聯(lián)合修復(fù)(PM組)的影響因素

2.3.1 石油污染程度對(duì)石油污染土壤修復(fù)效果的影響

在不同石油初始含量下土壤中石油的降解曲線如圖5所示。從圖5可以看出，石油初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%和0.6%的石油污染土壤修復(fù)的效果較好，56 d后石油的去除率高達(dá)72%。當(dāng)石油初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)增至0.9%時(shí)，56 d后石油的去除率約為62%。而石油初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%和1.5%時(shí)，56 d后土壤中石油的去除率不足50%。這可能是因?yàn)檩^低含量的石油可以作為紫花苜蓿和石油降解菌生長和繁殖的營養(yǎng)物質(zhì)；而過量的石油會(huì)產(chǎn)生一定的毒性，抑制植物及微生物的生長發(fā)育，且石油含量過高，還會(huì)造成土壤孔隙度下降，土壤中的氧含量減少，植物根系和微生物的呼吸作用減弱，最終導(dǎo)致修復(fù)效果下降。

η—Oil removal rate圖5 石油初始含量對(duì)石油污染土壤修復(fù)的影響Fig.5 Effect of initial petroleum content onremediation of petroleum contaminated soilThe planting density of Alfalfa was 20 seeds/dm2 and the dosage ofPseudomonas aeruginosa agent was 20 g/(kg Soil).

2.3.2 植株種植密度對(duì)石油污染土壤修復(fù)效果的影響

紫花苜蓿種植密度對(duì)石油污染土壤修復(fù)效果的影響如圖6所示。由圖6可見：當(dāng)植株密度由10棵/dm2增至20棵/dm2，第56 d時(shí)石油的去除率由51.3%提高到72%；但當(dāng)植株密度提高至30棵/dm2時(shí)，土壤中石油的去除率反而略有下降。這是因?yàn)楫?dāng)植株種植過于密集時(shí)，群體之間相互遮擋，通風(fēng)透光變差，根系生長空間相對(duì)狹小，相互交纏，營養(yǎng)物質(zhì)消耗快，使得植物生長周期變短，微生物呼吸變?nèi)?，活性下降，?dǎo)致石油降解效果變差。因此，紫花苜蓿種植密度為20棵/dm2較為合適。

η—Oil removal rate圖6 紫花苜蓿種植密度對(duì)石油污染土壤修復(fù)的影響Fig.6 Effect of planting density of Alfalfa on remediationof petroleum contaminated soilThe initial petroleum mass fraction was 0.6% and the dosage ofPseudomonas aeruginosa agent was 20 g/(kg Soil).

2.3.3 菌劑添加量對(duì)石油污染土壤修復(fù)效果的影響

菌劑添加量對(duì)石油污染土壤修復(fù)效果的影響如圖7所示。從圖7可以看出:當(dāng)土壤中銅綠假單胞菌菌劑添加量由7 g/kg增加至20 g/kg時(shí)，石油的去除率明顯提高；但當(dāng)由20 g/kg增加至40 g/kg時(shí)，修復(fù)效果相差無幾。由此可見，菌劑添加量并不是越多越好，添加量過多，營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，微生物生長相對(duì)緩慢、活性降低，不能發(fā)揮最大的修復(fù)作用。因此，土壤中菌劑添加量為20 g/kg較為經(jīng)濟(jì)。

η—Oil removal rate圖7 菌劑添加量對(duì)石油污染土壤修復(fù)的影響Fig.7 Effect of dosage of bacterial agent on theremediation of petroleum contaminated soilThe initial petroleum mass fraction was 0.6% andthe planting density of Alfalfa was 20 seeds/dm2.

2.3.4 營養(yǎng)物對(duì)石油污染土壤修復(fù)效果的影響

營養(yǎng)物對(duì)石油污染土壤修復(fù)效果的影響如圖8所示。由圖8可見，適量的營養(yǎng)物對(duì)石油污染土壤的修復(fù)有明顯促進(jìn)作用。相比于未加營養(yǎng)物組，當(dāng)N/P摩爾比為6∶1和10∶1時(shí)，土壤中石油的去除率均有明顯增加，特別是當(dāng)N/P摩爾比為10∶1時(shí)，56 d后石油的去除率高達(dá)85.5%，比不加營養(yǎng)物組(圖5)增加了13.5百分點(diǎn)。但當(dāng)N/P摩爾比為30∶1時(shí)，土壤中石油的去除率有所下降，部分植物出現(xiàn)了燒苗現(xiàn)象。這說明，適量的營養(yǎng)物有助于植物和微生物的生長發(fā)育，但添加過量，可能使植物無法正常生長，也可能造成微生物細(xì)胞脫水，降低活性，影響修復(fù)效果。

η—Oil removal rate圖8 營養(yǎng)物對(duì)石油污染土壤修復(fù)的影響Fig.8 Effect of nutrients on the remediation ofpetroleum contaminated soilThe initial petroleum mass fraction was 0.6%, the plantingdensity of Alfalfa was 20 seeds/dm2 and the dosage ofPseudomonas aeruginosa agent was 20 g/(kg Soil).

3 結(jié) 論

(1)紫花苜蓿-銅綠假單胞菌聯(lián)合修復(fù)可更高效地去除土壤中的石油，石油的去除率及降解速率均遠(yuǎn)勝單一修復(fù)方式，56 d內(nèi)石油去除率高達(dá)72%，反應(yīng)速率常數(shù)達(dá)0.0250 d-1。在聯(lián)合修復(fù)體系中，銅綠假單胞菌與紫花苜蓿表現(xiàn)出了明顯的互生現(xiàn)象。

(2)當(dāng)土壤中石油的初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%，紫花苜蓿植株密度為20棵/dm2，土壤中銅綠假單胞菌菌劑投加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20 g/kg時(shí)，植物-微生物聯(lián)合修復(fù)效果最好，且修復(fù)體系得以充分利用。

(3)在石油污染土壤修復(fù)過程中，添加適量的氮、磷營養(yǎng)物有顯著的促進(jìn)作用。當(dāng)?shù)?、磷元素摩爾比?0∶1時(shí)效果最好，土壤中石油的去除率比不加營養(yǎng)物組提高了13.5百分點(diǎn)。