苦參素通過調(diào)控神經(jīng)生長因子表達抑制背根神經(jīng)節(jié)生長和疼痛遞質(zhì)釋放研究

蔣 潔，任加強，王 錚，韓 亮

(1.西安交通大學第一附屬醫(yī)院肝膽外科,陜西 西安 710061；2.陜西省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,陜西 西安710068)

近年，神經(jīng)的生長、再生、退化與損傷修復，及其和腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系成為科學研究的熱點，也是亟待解決的問題之一?？鄥⑹且晃冻Ｓ脗鹘y(tǒng)中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為豆科植物苦參的干燥根莖。苦參味苦、性寒；歸肝、腎、大腸、小腸、膀胱、心經(jīng)；具有清熱、燥濕、解毒、補中明目、養(yǎng)肝膽氣以及利尿等功效?？鄥⑺厥且环N廣泛存在于苦參、苦豆子及廣豆根等中草藥中的具有四環(huán)喹嗪啶類結(jié)構(gòu)的生物堿類成分[1-2]?？鄥⑺鼐哂锌寡?、抗氧化、抗腫瘤及鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等多方面的藥理作用[3-4]。研究顯示，苦參素對長春新堿引起的模型小鼠神經(jīng)性疼痛的刺激具有保護作用[5]?？鄥⑺赝ㄟ^抑制背根神經(jīng)節(jié)中腫瘤壞死因子-α 的表達減輕神經(jīng)性疼痛，且此過程是呈劑量依賴性方式的[6]?？鄥⑺鼐哂袕V泛的生物學活性[7-9]，但其在神經(jīng)生長中的作用及其機制尚不明確。

背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal root ganglion，DRG)是周圍神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，主要由周圍神經(jīng)系統(tǒng)感覺神經(jīng)元構(gòu)成，接收機體的感覺信息，具有將疼痛、溫度和壓力等感覺刺激信號向中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳遞的功能[10]。DRG結(jié)構(gòu)簡單經(jīng)典，體外DRG神經(jīng)元模型被廣泛應用于神經(jīng)生長及體外髓鞘形成的現(xiàn)象、機制研究[11-12]。神經(jīng)生長因子(Nerve growth factor,NGF)是最早被定義的神經(jīng)營養(yǎng)因子。研究顯示,NGF能刺激中樞和外周神經(jīng)元的生長、發(fā)育、維持活力和誘導分化，維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能，加快神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復[13]。研究顯示，NGF 在組織中廣泛表達，在多種類型的神經(jīng)鞘和腫瘤細胞中呈高表達，可參與神經(jīng)細胞的生存、分化和軸突形成等重要的過程[14]。本課題研究苦參素對神經(jīng)生長和疼痛遞質(zhì)的表達影響和作用機制，從基礎實驗中探索苦參素對神經(jīng)性疼痛的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 本文用于提取背根神經(jīng)節(jié)的實驗動物為飼養(yǎng)于我校 SPF 級動物實驗中心的 1 日齡的 Sprague-Dawley 大乳鼠，購自于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。苦參素購自于西格瑪奧德里奇(Sigma-Aldrich)，應用DMEM培養(yǎng)基將其濃度稀釋為20 μmol/L；人重組NGF購自美國Ρeprotech公司，應用DMEM培養(yǎng)基將其稀釋至2 ng/ml。在背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)體系中分別加入苦參素(10 μmol/L)，定義為低濃度組；苦參素(20 μmol/L)，定義為苦參素組；苦參素(40 μmol/L)，定義為高濃度組；苦參素(20 μmol/L)聯(lián)合應用外源性人重組NGF(2 ng/ml)，定義為苦參素聯(lián)合NGF組；未干預組定義為空白對照組。神經(jīng)節(jié)在含20%胎牛血清的F12培養(yǎng)基中，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)基購自Gibco公司。NGF、P物質(zhì)(Substance P,SP)、降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitonin gene related peptide,CGRP)、內(nèi)參GAPDH抗體以及二抗由Abcam公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 背根神經(jīng)節(jié)的提取和培養(yǎng):將新生大鼠浸入 75%乙醇內(nèi)，麻醉消毒。麻醉成功后，將新生大鼠在平皿內(nèi)呈俯臥位展平，從尾部正中剪開皮膚至枕部，切口兩端向腹側(cè)剪開，分離皮膚與肌層。從盆部橫斷脊柱軀干，剪至頭部，小心去除內(nèi)臟，保留脊柱及兩側(cè)肌肉骨骼為一整體。換至盛有預冷培養(yǎng)基的平皿，顯微鏡下修剪去除肌肉，勿損傷脊柱及兩側(cè)區(qū)域。從脊柱尾端入剪，沿側(cè)壁剪開椎管并揭去，小心操作，避免損傷脊髓神經(jīng)。輕輕提起脊髓一端，即可見兩側(cè)脊神經(jīng)根，勾住脊神經(jīng)根輕輕牽拉可見圓形背根神經(jīng)節(jié)，顯微鑷夾住神經(jīng)節(jié)側(cè)端神經(jīng)，可夾起。置于另一平皿中。按此法取出所有背根神經(jīng)節(jié)。操作在冰浴過的PBS中進行，無菌原則及低溫操作是成功提取神經(jīng)節(jié)并保持其活性的要領。仔細修剪背根神經(jīng)節(jié)兩側(cè)的神經(jīng)節(jié)包膜及肌肉組織，輕輕撕去神經(jīng)節(jié)外包膜，避免損傷。在培養(yǎng)皿滴入 20～30 μl預混的BD生物基質(zhì)膠(Metrigel 膠和 DMEM/F12 培養(yǎng)基1∶1 預混)，膠內(nèi)植入修剪妥當?shù)纳窠?jīng)節(jié)。培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h使膠凝固。加入 DMEM/F12 培養(yǎng)基，入細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 背根神經(jīng)節(jié)生長徑的測量：應用神經(jīng)節(jié)的生長徑記錄神經(jīng)纖維的生長程度。具體方法為，通過倒置光學顯微鏡成像系統(tǒng)觀察，以神經(jīng)節(jié)胞體邊緣為起始點，以其周圍神經(jīng)纖維的最末端為終點，將各個終點連接成線后即為神經(jīng)纖維的生長范圍。取神經(jīng)生長范圍的均值(“米字”線的均值)為神經(jīng)節(jié)生長徑。

1.2.3 實時定量PCR檢測mRNA表達：提取細胞DNA參照操作說明。實時定量(RT) PCR反應條件：95 ℃預變性1 min后進入40個循環(huán)(95 ℃變性15 s；55 ℃退火15 s；72 ℃延伸45 s)。用GAPDH作為正常對照，采用2-△△Ct法分析各個因子在細胞中mRNA的相對表達量?；蛞镄蛄幸姳?。

表1 基因引物序列

1.3 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測分泌性蛋白的含量 分別將條件培養(yǎng)基和不同濃度干預的培養(yǎng)基吸取約100 μl加入相應孔中，每組樣品設3個復孔。放入濕盒中，37 ℃孵箱孵育120 min。用洗滌液將反應板洗滌5次，濾紙上印干。在每孔中加入50 μl第一抗體工作液，混勻后放入濕盒中，37 ℃孵箱孵育60 min。用洗滌液將反應板充分洗滌5次，濾紙上印干。在每孔中加入100 μl酶標抗體工作液，混勻后放入濕盒中，37 ℃孵箱孵育60 min。用洗滌液將反應板充分洗滌5次，濾紙上印干。每孔加入100 μl底物工作液，混勻后37 ℃避光孵育10 min。每孔加入50 μl中止液混勻后在492 nm處測吸光值。根據(jù)標準品濃度得到標準曲線和回歸方程，計算并獲得待測樣品目標分泌性蛋白的含量。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，用t檢驗,多組數(shù)據(jù)之間的比較使用單因素方差分析檢驗;P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 背根神經(jīng)節(jié)的鑒定 從新生大乳鼠的脊神經(jīng)提取背根神經(jīng)節(jié)。首先對神經(jīng)節(jié)進行培養(yǎng)鑒定，鑒定方法為神經(jīng)組織特異性蛋白S100免疫熒光染色(圖1)。

A：光鏡下觀察提取的背根神經(jīng)節(jié)形態(tài)；B：綠色熒光標記S100蛋白；

通過倒置光學顯微鏡成像系統(tǒng)可見中間近似圓形的部分為神經(jīng)節(jié)，外周呈輻射狀向外發(fā)散延伸的絲狀結(jié)構(gòu)包括神經(jīng)軸索及施萬細胞或其他神經(jīng)膠質(zhì)細胞。綠色熒光信號為神經(jīng)組織特異性蛋白S100，軸索呈明亮的綠色絲狀物，自神經(jīng)節(jié)發(fā)出后呈放射狀向外生長，神經(jīng)絲向遠端延伸性生長。藍色熒光信號為DAPI標記的細胞核。可見大量神經(jīng)膠質(zhì)細胞的細胞核沿著神經(jīng)節(jié)周圍放射狀排列。同時，神經(jīng)節(jié)內(nèi)部也有大量的細胞核重疊。將綠色熒光信號和細胞標記染色圖像重合后，發(fā)現(xiàn)綠色熒光標記的神經(jīng)組織主要在神經(jīng)節(jié)的節(jié)內(nèi)著色，這符合神經(jīng)節(jié)的解剖和組織學特征。

2.2 苦參素抑制背根神經(jīng)節(jié)的生長 見圖2(表2)。應用苦參素干預體外培養(yǎng)的背根神經(jīng)節(jié)，分別在干預0、24、48 h時間點檢測苦參素(20 μmol/L)對神經(jīng)節(jié)生長能力的影響。結(jié)果顯示，同一干預時間段，苦參素組和空白對照組比較，能明顯抑制神經(jīng)節(jié)生長徑(P<0.05)。

A：空白對照組；B：苦參素組

表2 不同時間點苦參素對神經(jīng)節(jié)生長能力影響的比較(μm)

2.3 苦參素抑制培養(yǎng)體系中背根神經(jīng)節(jié)NGF和疼痛遞質(zhì)的表達和分泌 見表3、4。在背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)體系中加入不同濃度的苦參素培養(yǎng)48 h后，應用Real-time PCR檢測神經(jīng)節(jié)中NGF和疼痛遞質(zhì)SP、CGRP mRNA的表達；應用ELISA檢測培養(yǎng)體系上清中NGF和疼痛遞質(zhì)SP、CGRP的分泌量。結(jié)果顯示，隨著苦參素濃度升高，背根神經(jīng)節(jié)中NGF和疼痛遞質(zhì)SP、CGRP mRNA的表達量逐步降低(P<0.05)。同時ELISA結(jié)果顯示，隨著苦參素濃度升高，培養(yǎng)上清中NGF和疼痛遞質(zhì)SP、CGRP的分泌量逐步減少(P<0.05)?？梢娍鄥⑺乜梢种婆囵B(yǎng)體系中背根神經(jīng)節(jié)NGF、SP和CGRP的表達和分泌。

表3 不同濃度苦參素對NGF、SP和CGRPmRNA表達影響的比較

表4 不同濃度苦參素對NGF、SP和CGRP分泌量影響的比較

2.4 苦參素通過抑制NGF延緩背根神經(jīng)節(jié)生長 計算培養(yǎng)24 h的神經(jīng)節(jié)生長徑。觀察各組中神經(jīng)節(jié)生長能力的變化(圖3)。結(jié)果顯示，苦參素聯(lián)合NGF組、苦參素組、空白對照組的神經(jīng)節(jié)生長徑分別為(16.24±0.28)μm、(10.30±0.52)μm、(17.48±0.42)μm，苦參素聯(lián)合NGF組與苦參素組比較，能明顯促進神經(jīng)節(jié)生長徑(P<0.05)?？梢奛GF能夠逆轉(zhuǎn)苦參素延緩背根神經(jīng)節(jié)的生長。

A：空白對照組；B：苦參素組；C：苦參素聯(lián)合NGF組

3 討 論

多項研究已經(jīng)證實，周圍神經(jīng)損傷后在神經(jīng)修復再生過程中，可誘發(fā)以痛覺過敏為特征的神經(jīng)性疼痛，在痛覺過敏期間，有害刺激可引起嚴重的疼痛。對于神經(jīng)性疼痛，西醫(yī)首選采用藥物治療，包括鈣離子通道調(diào)節(jié)劑(加巴噴丁、普瑞巴林等)、三環(huán)類抗抑郁藥(如阿米替林)、阿片類藥物(嗎啡、羥考酮等)和曲馬多等，嚴重時也可選用外科手術(shù)治療(神經(jīng)阻滯或毀損術(shù)、脊髓電刺激術(shù)、運動皮層電刺激、腦深部電刺激術(shù)等)，但是以上治療往往效果不理想且患者對治療耐受性差，易出現(xiàn)藥物不良反應及耐藥。

苦參在全國各地均有分布，植物的干燥根為其入藥部位，《滇南本草》及《神農(nóng)本草經(jīng)》均記載其具有清熱燥濕、涼血、解熱毒、疥癩、除癰腫等功效，對各種熱痛有一定緩解作用?？鄥⑺刈鳛橹胁菟幙鄥⒌奶崛∥锛爸饕煞?，近年來在心血管系統(tǒng)疾病、感染性疾病及抗腫瘤的臨床應用逐步得到認可并成為研究熱點[15-17]。研究顯示，苦參素有較明顯的鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用，動物研究顯示其能減少小鼠自發(fā)活動，拮抗苯丙胺所致的興奮，加強水合氯醛和氯丙嗪等藥物的抑制作用，對各種化學及熱刺激均有較明顯鎮(zhèn)痛效果。同時還有研究顯示苦參素鎮(zhèn)痛作用與背根神經(jīng)節(jié)炎癥因子的表達等有關(guān)[18-19]。在臨床實踐中也已經(jīng)證明其存在鎮(zhèn)痛作用[20]。但是，目前關(guān)于苦參素鎮(zhèn)痛作用的具體機制研究仍較少。

本實驗借助體外提取背根神經(jīng)節(jié)，通過苦參素干預神經(jīng)節(jié)的培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)苦參素能夠抑制背根神經(jīng)節(jié)的生長能力，且能夠抑制NGF的表達和分泌。同時，苦參素能夠抑制疼痛遞質(zhì)SP、CGRP的表達與分泌。當應用NGF與苦參素聯(lián)合干預后，神經(jīng)纖維的生長能力較單純應用苦參素干預組明顯改善?？梢娍鄥⑺啬芡ㄟ^抑制NGF減緩神經(jīng)生長。本研究提示了苦參素對神經(jīng)性疼痛鎮(zhèn)痛作用的可能機制，豐富了苦參素鎮(zhèn)痛作用的理論基礎。

神經(jīng)和疼痛的載體是人體或動物，本實驗為體外實驗，在體外模擬神經(jīng)的生長和疼痛存在一定的局限性。因此在后續(xù)的實驗中，課題將在體內(nèi)構(gòu)建動物神經(jīng)損傷模型，通過動物行為學檢測疼痛行為變化和血清中疼痛遞質(zhì)的釋放來進一步驗證體外實驗結(jié)果。