沙庫巴曲纈沙坦對心肌梗死后心力衰竭大鼠的心臟保護機制探討

龐志華，趙偉，田留洋，任穎，李棟，姚朱華△

心力衰竭（心衰）是由于心泵功能降低，不能滿足機體組織代謝需要而引起血流動力學(xué)改變的臨床綜合征［1-2］。全世界每年超過100萬人被診斷為心衰，其5年生存率僅為50%［3-4］。心衰的發(fā)生機制與神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)活動異常關(guān)系密切［5-6］。心衰時，心肌受牽拉可以產(chǎn)生大量的利鈉肽［7-8］。腦啡肽酶可以分解利鈉肽，但抑制腦啡肽酶會增加血管緊張素Ⅱ水平，損害心血管［9］，故臨床上不會單獨應(yīng)用腦啡肽酶抑制劑。血管緊張素受體-腦啡肽酶雙重抑制劑（ARNI）治療心衰臨床療效明顯［10-12］。多個臨床研究均證實，ARNI可保護心衰患者的臟器功能，改善預(yù)后［13-15］，但其作用機制尚不明確。因此，本研究通過構(gòu)建大鼠心肌梗死后心衰模型，探究ARNI對Fas/FasL通路介導(dǎo)的細胞凋亡以及炎癥氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響，進一步明確ARNI的代表性藥物沙庫巴曲纈沙坦的心臟保護機制，為更好地治療心衰提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 無特定病原體（SPF）級成年雄性SD大鼠60只，8周齡，體質(zhì)量280～300 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2021-0011，飼養(yǎng)于南開大學(xué)生物實驗站；沙庫巴曲纈沙坦（商品名：諾欣妥，諾華公司）；兔抗B淋巴細胞瘤-2基因抗體（Bcl-2，貨號ab32124）、兔抗Bcl-2相關(guān)的X蛋白抗體（Bax，貨號ab32503）、兔抗半胱氨酸蛋白酶-3抗體（Caspase-3，貨號ab32351）、兔抗凋亡相關(guān)因子（Fas，貨號ab82419）、兔抗凋亡相關(guān)因子配體抗體（FasL，貨號ab231011），鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶抗體（GAPDH，貨號ab8245）購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標(biāo)記的IgG山羊抗兔抗體（貨號SA00001-2）、HRP標(biāo)記的IgG山羊抗小鼠抗體（貨號SA00001-1）購自中國proteintec公司；大鼠白細胞介素（IL）-2/4/6/10酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（glutathione Stransferase，GST）活性檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測試劑盒及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）檢測試劑盒均購自索萊寶生物科技有限公司；天狼猩紅染料購自美國Santa cruz公司；Masson染色試劑盒購自南京建成生物科技有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；EG1150H包埋機、RM2235切片機，DM2500光學(xué)顯微鏡（含偏光鏡）購自德國Leica公司；小動物手術(shù)器械購自上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠；小動物呼吸機購自上海奧爾特電子有限公司，小動物超聲診斷儀購自美國通用公司；MP150多道生理記錄儀購自美國BIOPAC公司；酶標(biāo)儀購自美國BIO-RAD公司。

1.2 研究方法

1.2.1 大鼠分組及喂養(yǎng)60只大鼠按隨機數(shù)字表法均分為對照（Control）組、模型組及ARNI組，每組20只。Control組：假手術(shù)對照組，術(shù)中進行心臟視野暴露，但不結(jié)扎冠脈。ARNI組：建立心衰模型，每日灌胃沙庫巴曲纈沙坦68 mg/kg（生理鹽水稀釋），連續(xù)干預(yù)3月。模型組：建立心衰模型，每日灌胃等體積生理鹽水。沙庫巴曲纈沙坦干預(yù)劑量參考von Lueder等［16］研究。

1.2.2 動物模型構(gòu)建 大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液（按48 mg/kg劑量）進行麻醉。胸部備皮，將針形電極刺入大鼠四肢及胸壁皮下，連接超聲心電圖機，記錄心電圖。于左側(cè)第4肋間開胸，鈍性分離胸部肌肉，暴露肋骨，鈍性分離肋骨間肌肉組織，眼科鑷撕開心包膜，于左冠狀動脈前降支起點2 mm處用6-0縫線結(jié)扎。心臟表面給予利多卡因注射液0.1 mL以預(yù)防室性心律失常的發(fā)生，重置心臟于胸腔，分層縫合胸壁。術(shù)后心電圖表現(xiàn)為ST段抬高或出現(xiàn)病理性Q波判定為發(fā)生心肌梗死。術(shù)后3個月復(fù)查心臟超聲，檢測大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）并計算心臟指數(shù)（CI）；以LVEF≤0.6或CI≤180 mL/（min·kg）作為心衰成功造模的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 彩色多普勒超聲檢查心功能 從每組中隨機抽簽法抽取5只大鼠，麻醉后予以仰臥位固定，胸部備皮，用線陣探頭（頻率9 MHz）對大鼠進行心功能檢查。探頭置于其左胸，在取得滿意的胸骨旁左心室長軸二維圖像后，在乳頭肌水平將M型取樣線垂直于室間隔和左心室后壁獲得M型超聲心動圖，測定左心室質(zhì)量（LV Mass）、左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end diastolic dimension，LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end systolic dimension，LVESD）、左心室舒張末期容積（left ventricular end-diastolic volume，LVEDV）。計算LVEF及左心室短軸縮短分?jǐn)?shù)（left ventricular fraction shortening，LVFS）。計算連續(xù)3個心動周期的平均值為最終數(shù)值，超聲檢查的操作及分析均由專人完成。

1.2.4 大鼠心臟病理變化 從每組中隨機抽簽法抽取5只大鼠，2%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉后，開胸分離心臟標(biāo)本，用4%多聚甲醛固定24 h。將組織放入包埋盒中，流水沖洗30 min。組織依次放入70%、80%、90%、95%及無水乙醇中脫水處理，再置于二甲苯中透明1 min，后浸蠟1～2 min包埋，切成5μm厚的切片。分別用HE染色、Masson染色、天狼猩紅染色進行組織學(xué)分析。

1.2.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)和血漿炎性因子指標(biāo)的檢測 從每組中隨機抽取5只大鼠，通過腹主動脈穿刺采集大鼠血液2 mL于肝素抗凝離心管中，3 000 r/min離心10 min，收集血漿。根據(jù)試劑盒說明書，采用酶標(biāo)儀分別檢測SOD和GST催化底物反應(yīng)，檢測SOD和GST的活性。根據(jù)試劑盒說明書，采用ELISA法檢測血漿TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6和IL-10水平。

1.2.6 Western blot檢測Bax、Bcl-2、Caspase-3、Fas和FasL蛋白的表達 從每組中隨機抽簽法抽取5只大鼠，處死后取適量心肌組織，鋼珠磁力研磨，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA組織裂解液，BCA法進行蛋白定量。提取的蛋白進行SDSPAGE電泳進行分離，置于轉(zhuǎn)膜液中，轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，5%脫脂奶粉進行封閉2 h。將Bax、Bcl-2、Caspase-3、Fas、FasL和GAPDH抗體按1∶1 000比例稀釋后，放入PVDF膜并置于4℃冰箱過夜孵育。次日，洗膜后加入山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗（1∶3 000）孵育2 h，洗膜3次，每次5～10 min。加入發(fā)光液，于GE公司的AI6300超靈敏多功能成像儀進行蛋白成像檢測。使用Image J軟件對圖片進行灰度值計算。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法，組內(nèi)治療前后比較采用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心衰模型的構(gòu)建成功判定Control組與手術(shù)組（模型組與ARNI組）的術(shù)前心電圖未見明顯區(qū)別（圖1A、B）。術(shù)后Control組的心電圖較術(shù)前未見明顯變化（圖1C），手術(shù)組的心電圖的ST段可見明顯抬高（圖1D），提示造模成功。術(shù)后3個月內(nèi)Control組死亡1只，模型組死亡10只，ARNI組死亡4只。術(shù)后3個月復(fù)查心臟超聲，相較于Control組（圖1E），模型組（圖1F）的心臟前壁運動幅度明顯變差。ARNI組（圖1G）的心臟前壁運動功能較模型組明顯好轉(zhuǎn)。

2.2 各組大鼠心臟超聲相關(guān)指標(biāo)比較（1）組內(nèi)治療前后比較。與術(shù)前比較，Control組術(shù)后3個月的LVEF、LVFS、LV mass、LVEDV、LVEDD和LVESD差異無統(tǒng)計學(xué)意義；模型組和ARNI組術(shù)后的LVEF和LVFS下降，LV mass和LVEDV、LVEDD、LVESD均增加（P＜0.05），見表1。（2）組間比較。術(shù)前各組各指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且術(shù)后各組LV mass差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義。術(shù)后，與Control組比較，模型組LVEF和LVFS下降，LVEDV、LVEDD和LVESD增加（P＜0.05）；與模型組比較，ARNI組LVEF和LVFS回升，LVEDV和LVESD下降（P＜0.05），但LVEDD差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

2.3 各組大鼠心肌細胞變化比較 術(shù)后3個月，Control組心肌細胞完整、心肌纖維排列致密而整齊，形態(tài)呈圓柱狀，長度均一，細胞外間質(zhì)未見水腫及血管擴張，膠原分布均勻，相鄰的膠原纖維網(wǎng)完好，膠原纖維較少；模型組心肌細胞排列紊亂，心肌細胞核溶解，心肌纖維凝固性壞死，橫紋消失，可見片狀壞死，存活的心肌組織被分隔成島狀，散在分布，梗死區(qū)可見大量中性粒細胞浸潤，心肌細胞大面積壞死被纖維結(jié)締組織取代，大面積膠原纖維增生，且大量膠原纖維斷裂，走形混亂，纖維化明顯；ARNI組的炎癥細胞相比于模型組明顯減少，且心肌細胞排列更為整齊，壞死范圍明顯縮小，膠原纖維增生明顯減少，且纖維化程度較輕，見圖2。

Fig.1 Comparison of ECG and echocardiogram changes before and after coronary ligation between the groups圖1各組冠脈結(jié)扎前后心電圖及心臟超聲變化

Tab.1 Comparison of cardiac ultrasound related indexes between the three groups表1各組大鼠心臟超聲相關(guān)指標(biāo)比較 （n=5，±s）

Tab.1 Comparison of cardiac ultrasound related indexes between the three groups表1各組大鼠心臟超聲相關(guān)指標(biāo)比較 （n=5，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與模型組比較，P＜0.05；表2、3同。

組別Control組模型組ARNI組F LVEF術(shù)前0.79±0.04 0.77±0.03 0.77±0.02 0.698術(shù)后0.77±0.01 0.43±0.05a 0.58±0.02ab 172.041＊＊t 1.263 14.230＊＊14.900＊＊LVFS（%）術(shù)前49.16±3.95 47.06±2.56 47.32±2.32 0.716術(shù)后47.19±0.72 20.59±2.89a 33.91±2.40ab 181.427＊＊t 1.101 15.319＊＊8.981＊＊LV mass（mg）術(shù)前640.84±132.95 607.80±76.64 614.92±72.82 0.157術(shù)后797.28±117.85 1 001.42±257.98 812.41±165.47 1.800 t 1.969 3.270＊2.443＊組別Control組模型組ARNI組F LVEDV（μL）術(shù)前236.88±48.37 214.15±25.88 223.87±38.36 0.435術(shù)后266.41±48.40 348.00±41.52a 309.02±21.88b 5.495＊t 0.965 6.117＊＊4.311＊＊LVEDD（mm）術(shù)前6.50±0.69 6.23±0.32 6.30±0.62 0.300術(shù)后7.09±0.56 8.03±0.66a 7.75±0.24 4.357＊t 1.505 5.508＊＊4.868＊＊LVESD（mm）術(shù)前3.36±0.42 3.20±0.25 3.44±0.25 0.755術(shù)后3.91±0.41 6.20±0.26a 4.81±0.72ab 26.952＊＊t 2.107 18.511＊＊4.034＊＊

Fig.2 Comparison of HE staining，Masson staining and Sirius red staining of myocardial tissue between the three groups(×400)圖2各組心肌組織HE染色、Masson染色及天狼星紅染色對比情況（×400）

2.4 各組大鼠氧化應(yīng)激和炎性因子比較 與Control組比較，模型組IL-2、IL-6和TNF-α水平升高，而SOD、GST和IL-10水平降低（P＜0.05）。與模型組比較，ARNI組可大幅度下調(diào)IL-2、IL-6和TNFα水平，上調(diào)GST、IL-4和IL-10水平（P＜0.05），SOD差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

2.5 各組大鼠凋亡相關(guān)蛋白表達比較 與Control組比較，模型組Bax、Caspase-3、Fas和FasL蛋白表達水平增加，Bcl-2蛋白表達水平降低（P＜0.05）。與模型組比較，ARNI組Fas和FasL表達水平降低，Bcl-2的表達量增加（P＜0.05），但Bax和Caspase-3蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3、表3。

Tab.2 Comparison of oxidative stress and inflammatory factors between the three groups表2各組大鼠氧化應(yīng)激和炎性因子比較（n=5，±s）

Tab.2 Comparison of oxidative stress and inflammatory factors between the three groups表2各組大鼠氧化應(yīng)激和炎性因子比較（n=5，±s）

組別Control組模型組ARNI組F SOD（U/mL）38.72±10.26 26.74±1.98a 36.18±6.50 3.944＊GST（U/mL）0.06±0.02 0.02±0.01a 0.06±0.02b 6.522＊IL-2（ng/L）39.80±8.32 56.40±5.83a 25.29±2.48ab 33.226＊＊組別Control組模型組ARNI組F IL-6（ng/L）39.33±9.23 104.41±4.53a 46.03±5.06b 146.362＊＊TNF-α（ng/L）115.47±4.93 147.80±2.04a 117.18±2.72b 138.611＊＊IL-4（ng/L）19.74±1.82 18.63±1.51 33.48±2.29ab 94.680＊＊IL-10（ng/L）20.28±4.15 12.17±2.76a 26.46±2.98ab 22.819＊＊

Fig.3 The expression levels of Bax,Bcl-2,Caspase-3,Fas and FasL proteins in rat cardiac tissue detected by Western blot assay圖3大鼠心肌組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Fas和FasL蛋白表達的Western blot圖

Tab.3 Comparison of apoptosis associated proteins between the three groups表3各組大鼠心肌組織凋亡相關(guān)蛋白相對表達量比較（n=5，±s）

Tab.3 Comparison of apoptosis associated proteins between the three groups表3各組大鼠心肌組織凋亡相關(guān)蛋白相對表達量比較（n=5，±s）

組別Control組模型組ARNI組F Bax 1.00±0.10 1.48±0.13a 1.30±0.15a 10.336＊Bcl-2 1.00±0.11 0.77±0.11a 1.13±0.12b 7.618＊Caspase-3 1.00±0.14 1.85±0.21a 1.52±0.35a 9.083＊Fas 1.00±0.08 1.76±0.23a 1.19±0.17b 15.503＊FasL 1.00±0.04 1.47±0.08a 0.85±0.08ab 67.087＊＊

3 討論

心衰為各種心臟疾病的嚴(yán)重和終末階段，發(fā)病率高，預(yù)后差，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，交感神經(jīng)系統(tǒng)的過度激活造成心臟功能障礙，導(dǎo)致心肌細胞受損、心肌纖維化及左心室功能障礙［17-18］。PARADIGM-HF研究［19］顯示，沙庫巴曲纈沙坦可提高心衰患者運動耐量，降低猝死率、因心力衰竭再住院風(fēng)險率和全因死亡率。另外，沙庫巴曲纈沙坦還能使心臟負(fù)荷和心肌損傷相關(guān)的心臟生物標(biāo)志物-腦利鈉肽前體（NT-proBNP）和肌鈣蛋白水平降低［20］。ENTRESTO-SAS研究［15］顯示，沙庫巴曲纈沙坦可改善慢性心衰患者的預(yù)后，降低病死率。本研究結(jié)果顯示，心肌梗死后心衰大鼠的LVEF和LVFS下降，加用沙庫巴曲纈沙坦可以逆轉(zhuǎn)心臟泵血功能的下降，表明沙庫巴曲纈沙坦能夠減少心肌梗死對心臟泵血功能的損害。心臟泵功能的維持有賴于心肌結(jié)構(gòu)的完整性。有研究顯示，心室重構(gòu)是心衰發(fā)展的基本機制，其主要表現(xiàn)為心臟結(jié)構(gòu)異常與功能障礙［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后心衰大鼠LVEDD、LVESD、LVEDV明顯增大，提示左心室重構(gòu)明顯，而應(yīng)用沙庫巴曲纈沙坦可減輕心室重塑，證實沙庫巴曲纈沙坦可以減少心肌重構(gòu)，抑制心臟擴大。

心肌梗死后中性粒細胞和單核細胞大量聚集，而炎癥反應(yīng)以巨噬細胞浸潤為主?；罨腗1巨噬細胞以吞噬和降解方式清除壞死的細胞碎片，并分泌IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性細胞因子和基質(zhì)金屬蛋白酶等［20］。心肌受損后纖維結(jié)締組織和膠原纖維增生對受損心肌組織的修復(fù)和心功能的維持有幫助，但其長期增生效應(yīng)則導(dǎo)致心肌僵硬度逐步增加、心肌順應(yīng)性降低、心室收縮及舒張功能減退，并最終導(dǎo)致心室重構(gòu)，引起心衰［22-23］。SOD是機體天然抗氧化系統(tǒng)組成成分之一，GST具有抗損傷、抗癌變的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后心衰大鼠的SOD、GST和抗炎因子IL-10水平較Control組下降，促炎因子IL-2、IL-6及TNF-α增多，而術(shù)后應(yīng)用沙庫巴曲纈沙坦可明顯降低氧化應(yīng)激以及促炎因子的水平；病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后心衰大鼠的梗死區(qū)域的心肌細胞大量壞死，炎癥細胞浸潤，纖維結(jié)締組織增生，膠原纖維網(wǎng)斷裂，膠原纖維增生，應(yīng)用沙庫巴曲纈沙坦后可減少炎癥細胞浸潤和心肌細胞壞死范圍以及心肌纖維化程度，提示沙庫巴曲纈沙坦通過發(fā)揮抗炎抗氧化應(yīng)激作用，減輕心肌細胞損傷和纖維化。

心肌細胞缺血缺氧可以誘發(fā)心肌細胞凋亡壞死，過度的心肌細胞凋亡將嚴(yán)重影響心臟的功能。目前，細胞凋亡主要由兩條信號傳導(dǎo)途徑調(diào)控：外源性（Fas和其他TNFR超家族成員和配體）和內(nèi)源性（線粒體相關(guān)）途徑。外源性凋亡途徑是由死亡配體觸發(fā)的細胞表面死亡受體信號啟動，死亡配體與死亡受體結(jié)合并傳遞信號，啟動凋亡程序［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后心衰大鼠的心臟Bax、Caspase-3、Fas和FasL蛋白高表達，且抗凋亡蛋白Bcl-2水平下調(diào)，術(shù)后應(yīng)用沙庫巴曲纈沙坦可顯著降低凋亡相關(guān)蛋白累積，上調(diào)Bcl-2蛋白表達，表明沙庫巴曲纈沙坦可以通過介導(dǎo)Fas/FasL通路，調(diào)節(jié)心肌細胞凋亡相關(guān)蛋白表達，減輕心肌細胞凋亡，進而維持心肌細胞活性。

綜上所述，沙庫巴曲纈沙坦可以通過介導(dǎo)Fas/FasL通路，降低心肌細胞凋亡，減輕炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少受損心肌的炎癥細胞浸潤，進而降低心肌纖維化以及心室重構(gòu)，更好地維持左心室形態(tài)，保護左心室泵血功能。