廢棄剩余冷凍胚胎的相關(guān)因素分析

葛秀云

（臨沂市婦幼保健院生殖中心，山東 臨沂 276000）

體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）技術(shù)的普遍應(yīng)用，為廣大不孕不育夫婦帶來希望。在該技術(shù)助孕過程中，每次移植1～2枚胚胎，如果獲得了大量胚胎，移植后仍有剩余胚胎或因有卵巢過度刺激的風(fēng)險(xiǎn)無法進(jìn)行鮮胚移植，需將胚胎進(jìn)行冷凍保存，如上次移植未妊娠或等待合適時(shí)機(jī)再進(jìn)行胚胎解凍移植，可提高胚胎的利用率、臨床妊娠率及輔助生殖技術(shù)的安全性，尤其多囊卵巢綜合征患者行凍胚移植可明顯降低中重度卵巢過度刺激綜合征的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。因此，隨著輔助生殖技術(shù)的不斷發(fā)展及單胚胎移植策略的廣泛應(yīng)用，全國(guó)各地的生殖中心剩余大量的冷凍胚胎。據(jù)報(bào)道，在夫婦雙方完成生育需求后，仍有28%的輔助生殖助孕周期有剩余的胚胎[1]。由于成熟、安全的胚胎冷凍技術(shù)，隨著時(shí)間的推移，冷凍胚胎的數(shù)量逐漸增加，由于我國(guó)尚未建立完善的剩余胚胎相關(guān)的法律、法規(guī)，大量剩余胚胎已成為醫(yī)療機(jī)構(gòu)面臨的重要問題，同時(shí)，也帶來相應(yīng)的倫理和法律問題?；诖耍狙芯恐荚谔接懹绊懼蟹驄D廢棄剩余胚胎的相關(guān)因素，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料回顧性分析2014年至2016年于本中心接受輔助生殖助孕技術(shù)助孕后仍有剩余冷凍胚胎的387對(duì)夫婦的臨床資料，根據(jù)是否廢棄剩余胚胎，分為廢棄組（n=96）和保存組（n=291）。兩組夫妻女方平均年齡（31.42±4.51）歲，男方平均年齡（33.14±5.52）歲。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：夫妻婚姻關(guān)系存續(xù)者；夫妻均對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書；所有夫婦均續(xù)交冷凍保存費(fèi)用或簽署廢棄剩余胚胎知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：失訪者；暫時(shí)無法明確選擇者。

1.2 方法

1.2.1 胚胎的獲得對(duì)女方采用長(zhǎng)方案、拮抗劑方案等進(jìn)行超促排卵，常規(guī)經(jīng)陰道超聲進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并結(jié)合性激素水平，當(dāng)2個(gè)主導(dǎo)卵泡直徑＞18 mm或同時(shí)有3個(gè)卵泡達(dá)17 mm（血雌二醇達(dá)到平均每個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡200～300 ng/L）進(jìn)行扳機(jī)，并于34～36 h取卵。男方同時(shí)取精，采精前禁欲2～7 d，女方取卵當(dāng)天采用手淫法取精。卵子取出后放置于37℃，6%CO2培養(yǎng)箱中，在取卵后3～4 h或注射人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）后39～40 h授精。選用Vitrolife培養(yǎng)系統(tǒng)，受精卵在體外培養(yǎng)24 h（D2）和48 h（D3），觀察胚胎細(xì)胞分裂情況。包括觀察時(shí)間、細(xì)胞數(shù)、大小是否均勻、碎片多少、空泡、多核等。并給予胚胎評(píng)級(jí)，可用胚胎包括1～3級(jí)，優(yōu)質(zhì)胚胎包括1～2級(jí)。冷凍D3胚胎2枚，其余行囊胚培養(yǎng)。第5天（D5）觀察，若有可用囊胚形成，則進(jìn)行移植或冷凍，否則繼續(xù)培養(yǎng)至第6天（D6）。

1.2.2 冷凍胚胎①適應(yīng)證：在體外受精（in vitro fertilization，IVF）過程中除去新鮮的胚胎植入外，仍有質(zhì)量良好的胚胎剩余。由于某種病理原因無法接受新鮮胚胎植入的女性，如卵巢過度刺激綜合征、子宮內(nèi)膜狀況不良、不明原因的陰道出血；由于某種非醫(yī)學(xué)原因不能接受新鮮胚胎植入的女性，如發(fā)生家庭或個(gè)人意外事件，因某種原因不能穩(wěn)定情緒者。②操作流程：采用玻璃化冷凍，將平衡液（equilibration solution，ES）、冷凍液（vitrification solution，VS）從冰箱中取出，室溫恢復(fù)30 min。填寫胚胎冷凍記錄表，確認(rèn)胚胎存放位置。將冷凍管從包裝袋中取出，貼上寫有夫婦雙方的姓名、載桿序號(hào)的標(biāo)簽。在冷凍支架上標(biāo)記雙方姓名、冷凍位置。準(zhǔn)備1桶2/3高度的液氮置于桌面待用。拔出載桿置于吸管架上待用，將其外套管放于手邊臺(tái)子上。在無菌3002皿蓋上做ES液滴，核對(duì)身份后將要冷凍的胚胎轉(zhuǎn)入ES液中，停留6～9 min。提前1 min在無菌3002皿蓋上做VS液滴，將胚胎從ES液轉(zhuǎn)入VS液中。60 s內(nèi)將胚胎轉(zhuǎn)到載桿的平板上（盡量少的吸取VS液），投入液氮，在液氮中將外套管套緊，載桿裝入之前投入液氮的做好標(biāo)記的冷凍支架的塑料套管內(nèi)，雙人核對(duì)無誤后放入液氮貯藏罐相應(yīng)位置保存。

1.2.3 廢棄胚胎夫婦雙方向門診大夫申請(qǐng)廢棄剩余冷凍胚胎。由護(hù)士長(zhǎng)詢問夫婦雙方意愿，若夫婦雙方堅(jiān)持廢棄，則預(yù)約廢棄時(shí)間（至少2周后）。給予患者前臺(tái)電話并告知，若在預(yù)約日期前放棄廢棄自身胚胎，則電話取消預(yù)約。預(yù)約當(dāng)天，在確認(rèn)夫妻雙方意愿后，核對(duì)夫婦雙方身份證信息是否與本人一致，由護(hù)士長(zhǎng)帶領(lǐng)患者進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室并與實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員交接。首先，實(shí)驗(yàn)室人員詢問并確認(rèn)患者意愿。在得到堅(jiān)決要廢棄的回復(fù)后，由1名實(shí)驗(yàn)室人員取出胚胎，與夫婦雙方和另1名實(shí)驗(yàn)室人員核對(duì)提桶及載桿上面的患者信息及剩余冷凍胚胎數(shù)。然后從液氮中將載桿拿出，拔掉帽子，將胚胎暴露于空氣中。實(shí)驗(yàn)室人員在廢棄記錄上簽字。

1.2.4 隨訪移植后14 d抽血檢查hCG水平，未升高者提示著床失敗，升高者提示妊娠，繼續(xù)黃體支持，兩周后行B超檢查，見孕囊為臨床妊娠。確認(rèn)妊娠后繼續(xù)給予黃體支持至胚胎移植（embryo transfer，ET）后50 d逐漸減量，直至孕12周。孕12周內(nèi)出現(xiàn)難免流產(chǎn)、胚胎停育者為自然流產(chǎn)。護(hù)士長(zhǎng)于移植1年后隨訪繼續(xù)妊娠者，包括詢問生產(chǎn)情況及繼續(xù)冷凍胚胎的意愿。如患者要求廢棄剩余胚胎，則要求患者夫婦同時(shí)攜帶有效身份證件來中心按照流程廢棄胚胎，如要求繼續(xù)冷凍保存胚胎，則需來中心續(xù)交冷凍保存費(fèi)用。

1.3 觀察指標(biāo)采用多元素Logistic回歸模型分析廢棄胚胎的影響因素。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以“±s”表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，廢棄胚胎的相關(guān)因素采用多因素Logistic回歸分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 廢棄胚胎的單因素分析 單因素分析結(jié)果顯示，廢棄胚胎可能受夫婦雙方高中以下學(xué)歷、助孕后孩次、冷凍時(shí)間、移植總次數(shù)的影響（P＜0.05），見表1。

表1 單因素分析廢棄胚胎的影響因素Table 1 Univariate analysis of influencing factors of abandoned embryos

2.2 廢棄胚胎的多因素Logistic回歸分析將單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的因素納入二元Logistic回歸模型中。多因素Logistic回歸分析顯示，女方高中及以上學(xué)歷、助孕后孩次≥3個(gè)、冷凍時(shí)間≥24個(gè)月是選擇繼續(xù)冷凍保存剩余胚胎的影響因素（P＜0.05）。

表2 廢棄剩余冷凍胚胎的多因素分析Table 2 Multivariate analysis of discarding surplus cryopreserved embryos

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)輔助生殖助孕夫婦在暫時(shí)完成生育需求后，仍有＞75%的夫婦選擇繼續(xù)冷凍胚胎。隨著時(shí)代的發(fā)展，計(jì)劃生育政策也在隨之發(fā)生變化，2016年開始我國(guó)開始全面放開二孩生育政策，儲(chǔ)存的剩余胚胎為助孕夫婦實(shí)踐二孩政策提供便利。本研究結(jié)果顯示，多因素Logistic回歸分析顯示，助孕后孩次≥3個(gè)是選擇繼續(xù)冷凍保存剩余胚胎的影響因素（P＜0.05）。在完成二胎及以上者仍有62%的夫婦選擇繼續(xù)冷凍胚胎，而繼續(xù)冷凍剩余胚胎者最長(zhǎng)胚胎冷凍時(shí)間為66個(gè)月，提示即使夫婦已經(jīng)完成法定生育規(guī)定，仍有一部分夫婦對(duì)目前的生育政策處于觀望狀態(tài)，而不是急于廢棄剩余的冷凍胚胎，導(dǎo)致生殖中心積壓大量的剩余胚胎。而我國(guó)已于2021年5月31日實(shí)施三孩政策，生殖中心將迎來為生育三孩移植胚胎的高潮期。雖然根據(jù)我國(guó)冷凍胚胎保存時(shí)限[2]，胚胎保存6年內(nèi)對(duì)妊娠結(jié)局無明顯影響，且無足夠證據(jù)表明＞6年會(huì)不利于胚胎的安全性，但據(jù)報(bào)道，隨著胚胎冷凍時(shí)間越久，胚胎再次使用率也隨之減少[3]。而由于胚胎的特殊性，目前國(guó)內(nèi)絕大多數(shù)生殖中心采用只能根據(jù)助孕夫婦的意愿對(duì)胚胎進(jìn)行處置。大量剩余胚胎將給生殖中心造成沉重負(fù)擔(dān)并占用大量社會(huì)醫(yī)療資源，因此，完善管理剩余胚胎的相關(guān)法律法規(guī)具有重要意義。

完善剩余冷凍胚胎的相關(guān)行內(nèi)規(guī)定和法律法規(guī)需要各個(gè)生殖中心數(shù)據(jù)的積累。國(guó)際上對(duì)于剩余胚胎的處理方法主要有繼續(xù)保存、廢棄、捐獻(xiàn)科研或其他夫婦等。我國(guó)嚴(yán)格禁止胚胎贈(zèng)送，而在德國(guó)、挪威、英國(guó)、澳大利亞、奧地利等國(guó)家，胚胎捐獻(xiàn)給其他夫婦是一種可供選擇的助孕措施[4]。而本生殖中心尚未開展胚胎相關(guān)科研，因此，無捐獻(xiàn)科研選擇。本研究結(jié)果顯示，多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，女方高中及以上學(xué)歷是選擇繼續(xù)冷凍保存剩余胚胎的影響因素（P＜0.05）。表明是否廢棄剩余胚胎與患者夫婦的年齡、婚姻狀況是否為再婚、在職情況、移植總次數(shù)、剩余胚胎數(shù)目、剩余優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)目等無明顯相關(guān)性，而女方高中以上學(xué)歷則更傾向于選擇繼續(xù)凍存胚胎，是由于更高層次的教育背景可以更好的理解冷凍胚胎，相信胚胎冷凍保存技術(shù)的成熟性和安全性。有研究則認(rèn)為影響患者夫婦對(duì)剩余胚胎處置的因素包括患者年齡、經(jīng)濟(jì)條件、婚姻狀況、孩子的健康狀況、宗教信仰、醫(yī)生的建議、治療周期后對(duì)胚胎屬性的重新認(rèn)識(shí)等[5]。而在CHANDY等[6]的一項(xiàng)對(duì)87對(duì)夫婦在完成生育計(jì)劃后對(duì)剩余胚胎的處理決定的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，胚胎處置方式與夫婦的年齡、教育背景、收入及現(xiàn)有一孩均無相關(guān)性，37.9%的夫婦無法決定胚胎的處置方法，46%的夫婦愿意捐獻(xiàn)給不孕夫婦，11.5%愿意捐獻(xiàn)科研，27.6%夫婦認(rèn)為捐獻(xiàn)兩者均可，只有3.4%的夫婦選擇直接廢棄。BRUNO等[7]則進(jìn)一步探討助孕夫婦關(guān)于胚胎的看法與剩余胚胎的處置方法之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)兩者有明顯的相關(guān)性，如在助孕夫婦觀念中胚胎代表孩子，他們更傾向于廢棄胚胎；如果胚胎代表項(xiàng)目，他們傾向于捐獻(xiàn)科研；如胚胎代表潛在的人，他們更傾向于捐獻(xiàn)給其他人，而這些觀念都受多方面尤其是社會(huì)文化的影響。國(guó)外研究表明，隨著患者宗教信仰嚴(yán)格程度的增加，選擇將剩余冷凍胚胎用于科學(xué)研究的比例呈下降趨勢(shì)[8]。

本研究結(jié)果顯示，多因素Logistic回歸分析顯示，冷凍時(shí)間≥24個(gè)月是選擇繼續(xù)冷凍保存剩余胚胎的影響因素（P＜0.05）。表明冷凍胚胎≥24個(gè)月者更傾向于繼續(xù)冷凍胚胎，即使部分已經(jīng)完成生育計(jì)劃，這提示生殖中心即使在助孕夫婦進(jìn)入周期前已經(jīng)簽訂相關(guān)知情同意書，明確告知胚胎不可無限期保存，如超過保存年限，可選擇銷毀或者捐獻(xiàn)科研，但由于我國(guó)法律尚未對(duì)胚胎的保存期限及早期胚胎的處置權(quán)有明確規(guī)定，且有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)約70%的患者在胚胎冷凍2～3年后會(huì)改變最初的處理方式[9-11]，因此，在處理剩余胚胎時(shí)仍應(yīng)再次積極與助孕夫婦溝通，告知胚胎冷凍意義及風(fēng)險(xiǎn)，在充分尊重夫婦雙方意愿的基礎(chǔ)上確認(rèn)胚胎處置方式，從而規(guī)避不必要的風(fēng)險(xiǎn)。而國(guó)際上已有許多國(guó)家立法或有專門的機(jī)構(gòu)進(jìn)行相關(guān)的管理，如英國(guó)的《人類受精和胚胎法》中就賦予生殖機(jī)構(gòu)對(duì)過期的胚胎和配子處置的權(quán)利，其中明確規(guī)定精子和卵子的最長(zhǎng)期限為10年，胚胎的最長(zhǎng)保存期限為5年。超過規(guī)定時(shí)間的，醫(yī)療機(jī)構(gòu)有權(quán)任其死亡[12]。

綜上所述，輔助生殖治療過程中剩余冷凍胚胎是否繼續(xù)保存與女方學(xué)歷、助孕后孩次、冷凍時(shí)間相關(guān)，生殖中心應(yīng)根據(jù)影響因素制定合理的胚胎冷凍和隨訪策略。此外，我國(guó)生殖醫(yī)學(xué)界臨床醫(yī)生應(yīng)在能夠獲得適量的優(yōu)質(zhì)胚胎的前提下，盡量避免過量剩余胚胎的產(chǎn)生，完善冷凍胚胎的隨訪機(jī)制，從而減少醫(yī)療資源的浪費(fèi)和過量剩余胚胎產(chǎn)生的相應(yīng)倫理問題。