菌株Alcaligenes sp. P156中一個新型煙酸羥化酶的克隆與功能驗(yàn)證*

孫倩姝， 趙書雪， 徐 康， 白 潔， 于 浩， 胡春輝**

(1. 中國海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院， 海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266100；2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 山東 青島 266109)

煙酸又稱為尼克酸、維生素B3，是生物生長發(fā)育所必須的一種生長因子，是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)以及其他多種輔因子的必要組成成分。在日常生活中，煙酸被普遍使用，經(jīng)常作為添加劑被應(yīng)用于食品、化妝品、飼料等行業(yè)[1]。同時，煙酸是合成多種煙堿類農(nóng)藥、藥品的原材料，因此被廣泛的應(yīng)用于化工合成領(lǐng)域和醫(yī)療領(lǐng)域。煙酸是最常見的吡啶類化合物之一，存在于各種生物體內(nèi)，隨著生物的死亡、分解進(jìn)入環(huán)境中。生物體中煙酸降解的代謝途徑多種多樣，因此煙酸常被當(dāng)作模式化合物用于吡啶類化合物降解的研究。目前已報(bào)道多株能夠降解煙酸的微生物[2-7]。

研究表明，好氧微生物主要通過6-羥基煙酸途徑來降解煙酸，首先煙酸在煙酸羥化酶的催化下生成6-羥基煙酸[4,6,8]，隨后6-羥基煙酸在6-羥基煙酸單加氧酶的催化下生成2,5-二羥基吡啶，2,5-二羥基吡啶在酶的催化下生成N-甲酰馬來酰胺酸、馬來酰胺酸、馬來酸、富馬酸，并最終進(jìn)入三羧酸循環(huán)，實(shí)現(xiàn)煙酸的完全礦化[4,9]。6-羥基煙酸還可以通過轉(zhuǎn)化為2,6-二羥基煙酸來實(shí)現(xiàn)煙酸的降解[7,10]。在煙酸的厭氧降解途徑中，6-羥基煙酸會被轉(zhuǎn)化成為1,4,5,6-tetrahydro-6-oxonicotinate，并最終轉(zhuǎn)化為丙酮酸和丙酸鹽，實(shí)現(xiàn)完全礦化[5]。此外在菌株伯克霍爾德菌屬(Burkholderiasp.)DSM 6920中還發(fā)現(xiàn)煙酸能夠被轉(zhuǎn)化為2-羥基煙酸，但是生成的2-羥基煙酸并不能夠被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化[11]。從已經(jīng)報(bào)道的文獻(xiàn)可以看出，無論通過好氧呼吸還是厭氧發(fā)酵，煙酸降解的第一步反應(yīng)都是在吡啶環(huán)的ɑ位加羥基。通過吡啶環(huán)上電子密度分布可以推測，吡啶環(huán)ɑ位的羥基化反應(yīng)通常都是由脫氫酶催化而不是單加氧酶催化[12-13]。目前已報(bào)道的吡啶環(huán)ɑ位的羥基化反應(yīng)都是鉬結(jié)合的羥化酶催化的。例如，3-羥基吡啶被一個鉬結(jié)合的3-羥基吡啶2-羥化酶催化生成2,5-二羥基吡啶[14]；2-吡啶羧酸在一個鉬結(jié)合2-吡啶羧酸羥化酶的作用下生成6-羥基-2-吡啶羧酸[15]；還有異煙酸、3-琥珀酰吡啶、6-羥基假氧化尼古丁的轉(zhuǎn)化都是由鉬結(jié)合脫氫酶催化的[16-18]。同樣，催化煙酸生成6-羥基煙酸的煙酸羥化酶也是一個鉬結(jié)合脫氫酶。

目前，已有多個煙酸羥化酶被克隆并驗(yàn)證功能，其中大部分為多亞基鉬結(jié)合羥化酶。除了鉬結(jié)合結(jié)構(gòu)域之外，這些酶上面還有其他的結(jié)構(gòu)域，如[2Fe-2S]簇，F(xiàn)AD結(jié)合結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞色素c結(jié)構(gòu)域等[4,19-24]。研究表明，羥基化反應(yīng)中羥基中的氧原子是來自于H2O而不是氧氣，因此這些煙酸羥化酶屬于脫氫酶而不是單加氧酶[25]。隨著基因組測序技術(shù)的發(fā)展，多個煙酸羥化酶被克隆并進(jìn)行了功能驗(yàn)證。惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)KT2440中報(bào)道了一個雙亞基的煙酸羥化酶[21]；睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonastestosteroni)JA1中報(bào)道了一個三亞基的煙酸羥化酶[20]，極小單胞菌(Pusillimonassp.)T2中也報(bào)道了一個新型的三亞基煙酸羥化酶[19]。由于煙酸在自然界中存在的時間很長，因此不同的微生物進(jìn)化出了不同的煙酸降解途徑，這些途徑中的煙酸羥化酶結(jié)構(gòu)域序列存在很大差異，新型煙酸羥化酶的克隆不僅有助于了解吡啶類化合物的降解機(jī)理，而且能夠?qū)︺f結(jié)合羥化酶家族蛋白的進(jìn)化和催化機(jī)理有更為深入的了解。

菌株產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenessp.)P156是實(shí)驗(yàn)室篩選的一株能夠以煙酰胺作為唯一碳氮源進(jìn)行生長的菌株，菌株P(guān)156在煙酰胺水解酶的催化下將煙酰胺轉(zhuǎn)化為煙酸，煙酸隨后被轉(zhuǎn)化為6-羥基煙酸，6-羥基煙酸通過2,5-二羥基吡啶途徑最終轉(zhuǎn)化為富馬酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)[26]。之前的研究中鑒定到了一個煙酰胺降解基因簇，克隆并驗(yàn)證了煙酰胺水解酶、6-羥基煙酸單加氧酶和2,5-二羥基吡啶雙加氧酶等基因的功能[26]，但沒有鑒定到煙酸羥化酶。在本研究中，本文作者克隆了一個新型煙酸羥化酶(NaaB)，該酶含有三個亞基，分別由naaBL1、naaBS、naaBL2基因所編碼，其中包括兩個含有鉬輔因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域的大亞基和一個含有[2Fe-2S]簇結(jié)合結(jié)構(gòu)域的小亞基，并對NaaB的功能進(jìn)行了驗(yàn)證。本研究對吡啶ɑ位羥化酶不同亞基以及不同結(jié)構(gòu)域在鉬輔因子類型選擇方面有深入了解，為吡啶ɑ位羥化酶的改造提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

煙酸、6-羥基煙酸、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、5’-核黃素磷酸鈉鹽二水(FMN)、NAD+購買自生工生物工程(上海)股份有限公司；2,6-二氯靛酚鈉(DCIP)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購買自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；色譜級甲醇購買自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；Golden Mix(green)購買自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；基因組提取試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購買自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基(去離子水1 000 mL)：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，NaCl 10 g，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。無機(jī)鹽(MSM)培養(yǎng)基配方參考Yu等[27]的研究。煙酰胺、煙酸過濾除菌，在接種前加入培養(yǎng)基中，終濃度為1 000 mg/L。固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂粉。檸檬酸培養(yǎng)基是在MSM培養(yǎng)基中加入終濃度1 000 mg/L檸檬酸鈉和終濃度1 000 mg/L NH4Cl。

大腸桿菌在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min。產(chǎn)堿桿菌P156在MSM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，以煙酸或者煙酰胺作為底物，培養(yǎng)溫度為30 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min。

1.3 煙酸羥化酶基因的克隆

以菌株P(guān)156的基因組作為模板，利用引物naaBL1SL2-F和naaBL1SL2-R進(jìn)行naaBL1SL2基因的PCR擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)體系為：98 ℃ 2 min；30個循環(huán)(98 ℃ 20 s，62 ℃ 20 s，72 ℃ 3 min)；72 ℃ 5 min。將PCR產(chǎn)物利用膠回收試劑盒進(jìn)行回收。同時將載體pME6032利用EcoRI酶進(jìn)行線性化。將線性化的pME6032載體和純化后的PCR產(chǎn)物利用一步克隆試劑盒(諾唯贊ClonExpress II One Step Cloning Kit)進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pME6032-naaBL1SL2。利用引物naaBL1SL2-F和naaBL1S-R進(jìn)行naaBL1S基因片段的克隆，并利用同源重組一步克隆的方法連接到EcoRI線性化后的pME6032載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pME6032-naaBL1S。利用引物naaBSL2-F和naaBSL2-R進(jìn)行naaBSL2基因片段的克隆，利用同樣的方法連接到EcoRI和XhoI線性化后的pME6032中，構(gòu)建pME6032-naaBSL2重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Trans1-T1中進(jìn)行篩選，并進(jìn)行測序驗(yàn)證。構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒通過電擊轉(zhuǎn)化到無色桿菌SJY1中進(jìn)行功能驗(yàn)證。電擊轉(zhuǎn)化在Eppendorf Eporator電轉(zhuǎn)化儀中進(jìn)行，轉(zhuǎn)化條件為1 800 V，使用的電擊杯的寬度為2 mm。

1.4 煙酸羥化酶功能驗(yàn)證

大腸桿菌和無色桿菌的重組菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)時加入25 μg/mL四環(huán)素和1 mmol/L IPTG，培養(yǎng)溫度均為30 ℃。引物序列見表1。待菌株生長至穩(wěn)定前期的時候，8 000g離心10 min收集細(xì)胞。利用PBS緩沖液(pH=7.0)重懸洗滌菌體細(xì)胞2次，最后一次將菌體細(xì)胞重懸，使OD600 nm為6.0。在休止細(xì)胞中加入煙酸(終濃度為1 000 mg/L)，將休止細(xì)胞置于30 ℃，120 r/min震蕩反應(yīng)，定期取樣1 mL，利用安捷倫Cary60分光光度計(jì)進(jìn)行全波長掃描，檢測底物轉(zhuǎn)化情況，并將部分樣品利用HPLC進(jìn)行進(jìn)一步檢測。

表1 本研究使用的引物序列

1.5 RT-qPCR

為了確定naaB基因簇中基因與煙酸降解的關(guān)系，菌株P(guān)156在以煙酸或者檸檬酸鈉/NH4Cl為唯一碳氮源的MSM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在菌株生長至對數(shù)末期的時候收集菌體，利用培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取總RNA，并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。以cDNA作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，以16S rRNA基因的表達(dá)作為對照。反應(yīng)體系按照諾唯贊公司的ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix說明書進(jìn)行配置，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)在Applied Biosystems QuantStudio 5 (ThermalFisher)熒光定量PCR儀上進(jìn)行。分別利用引物naaBL1-q-F/R、naaBL2-q-F/R和16S-q-F/R擴(kuò)增naaBL1、naaBL2和16S rRNA基因，具體引物序列見表1。naaBL1和naaBL2基因的表達(dá)量根據(jù)16S rRNA基因的表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，采用的方法為2-ΔΔCT方法。

1.6 菌株P(guān)156降解煙酸的代謝中間化合物檢測

利用Agilent 1100 HPLC檢測底物，檢測器為PDA，色譜柱為C18反相柱(Elite SinoChrom ODS-AP C18, 4.6 mm × 250 mm, 5 μm)，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量為5 μL。流動相A為0.1% (w/v)甲酸，流動相B為甲醇溶液，A∶B = 85∶15 (v/v)，流速為1.0 mL/min。向休止細(xì)胞反應(yīng)的樣品中加入3倍體積的甲醇，4 ℃靜置10 min，10 000 r/min離心2 min，取上清液用0.22 μm濾膜過濾后上機(jī)檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 naaB基因的表達(dá)

在之前的研究中本文作者在菌株P(guān)156的基因組中發(fā)現(xiàn)了一個naa基因簇(見圖1(b))，naa基因簇上面有從煙酸降解到富馬酸的大部分基因[26]。在naaE基因的前面有3個基因，分別命名為naaBL1、naaBS和naaBL2。其中naaBL1和naaBL2編碼的蛋白均含有鉬輔因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域，根據(jù)煙酰胺的代謝途徑(見圖1(a))和已報(bào)道的文獻(xiàn)[19-21,25]，推測這3個基因很有可能負(fù)責(zé)催化由煙酸到6-羥基煙酸的反應(yīng)。

為了進(jìn)一步研究naaB基因與煙酸降解的關(guān)系，本文作者對菌株P(guān)156在煙酸存在和不存在兩種情況下的naaB基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測。熒光定量PCR結(jié)果表明，在煙酸存在的情況下naaBL1和naaBL2的表達(dá)量都顯著高于沒有煙酸存在情況下的表達(dá)量，分別提高了～2.1倍和～7.1倍(見圖2)。這表明了naaB基因可能參與了煙酸的降解，并且煙酸就是其最適底物。

((a)菌株P(guān)156降解煙酰胺的途徑；(b)菌株P(guān)156降解煙酰胺的相關(guān)基因。箭頭指示轉(zhuǎn)錄的位置、方向和大小。標(biāo)尺代表基因長度為1 kb。(a) Nicotinamide degradation pathway in strain P156; (b) Genes involved in nicotinamide degradation in strain P156. The arrows indicates the location, direction and size of the transcription of the ORFs. Bar, 1 kb.)

(數(shù)據(jù)根據(jù)16S rRNA基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。每個值是三個平行重復(fù)結(jié)果的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。The data were normalized to the 16S rRNA gene. Each value is the mean±SD of the results of three parallel replicates.)

大部分的鉬結(jié)合蛋白只有一個鉬輔因子結(jié)合大亞基，但是naaB基因簇上面有兩個鉬輔因子結(jié)合大亞基，因此為了確定究竟哪個亞基起到了催化作用，分別將三個片段，即含有兩個大亞基的naaBL1SL2片段、含有一個鉬輔因子結(jié)合大亞基的naaBL1S和naaBSL2片段克隆到了廣宿主質(zhì)粒pME6032中(見圖3(a))。并將含有naaB基因片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到了一株不能轉(zhuǎn)化煙酸的無色桿菌SJY1中進(jìn)行功能驗(yàn)證。通過休止細(xì)胞反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，僅含有一個鉬輔因子結(jié)合大亞基的基因片段不能轉(zhuǎn)化煙酸。只有同時含有兩個鉬輔因子結(jié)合大亞基的重組質(zhì)粒才具備轉(zhuǎn)化煙酸的能力。通過圖3(b)可以看出，休止細(xì)胞反應(yīng)2 h后就可以將煙酸完全轉(zhuǎn)化成為另一種化合物，該化合物的全波長掃描圖譜與6-羥基煙酸完全一致，并且該化合物不能被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化。

通過HPLC分析可以發(fā)現(xiàn)，休止細(xì)胞反應(yīng)2 h后，代表煙酸的吸收峰消失了，在3.95 min處出現(xiàn)了一個新的吸收峰，吸收峰的保留時間和全波長掃描圖譜與6-羥基煙酸標(biāo)準(zhǔn)圖譜完全一致(見圖4(a)、(b))。將該化合物進(jìn)行了LC-MS檢測，可以發(fā)現(xiàn)反應(yīng)后的產(chǎn)物中出現(xiàn)了一個分子量為138.019 9的化合物(見圖4(c))，根據(jù)荷質(zhì)比可以推測該化合物的分子式為C6H5NO3。通過RT-qPCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并結(jié)合全波長掃描、HPLC和LC-MS的結(jié)果可以確定，NaaB轉(zhuǎn)化煙酸后生成了6-羥基煙酸，NaaB即為煙酸羥化酶，負(fù)責(zé)P156中煙酸生成6-羥基煙酸的催化反應(yīng)。

((a)分別克隆naaBL1SL2、naaBSL2和naaBL1S基因片段，并克隆到pME6032載體上。(b)將pME6032-naaBL1SL2重組質(zhì)粒導(dǎo)入無色桿菌SJY1中進(jìn)行休止細(xì)胞反應(yīng)，分別取0和2 h的樣品進(jìn)行全波長掃描。(a) Genes naaBL1SL2, naaBSL2 and naaBL1S were amplified and inserted into pME6032 vector. (b) The recombinant plasmid pME6032-naaBL1SL2 was transformed into Achromobacter sp. SJY1 for resting cells reaction. The samples of 0 and 2 h were detected by UV spectrophotometry.)

目前報(bào)道的煙酸羥化酶均不能用大腸桿菌作為宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)和功能驗(yàn)證。本研究進(jìn)一步將pME6032-naaBL1SL2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Trans1-T1中，進(jìn)行休止細(xì)胞反應(yīng)轉(zhuǎn)化煙酸。結(jié)果表明，含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌Trans1-T1-naaBL1SL2能夠?qū)熕徂D(zhuǎn)化為6-羥基煙酸(見圖5)，這說明了NaaB在大腸桿菌中也具備功能，這與其他報(bào)道的在大腸桿菌中驗(yàn)證的功能都不一樣。為了確認(rèn)其他煙酸羥化酶基因不能夠在大腸桿菌中進(jìn)行煙酸的轉(zhuǎn)化，將惡臭假單胞菌KT2440中的煙酸羥化酶也克隆了出來，結(jié)果證明KT2440中的煙酸羥化酶在無色桿菌SJY1中能夠轉(zhuǎn)化煙酸，但是在大腸桿菌Trans1-T1中不能夠轉(zhuǎn)化煙酸。此外還在其他的假單胞菌中驗(yàn)證了NaaB的功能，結(jié)果表明NaaB在假單胞菌中也具備轉(zhuǎn)化煙酸的功能。這一點(diǎn)再次證明了產(chǎn)堿桿菌P156中的煙酸羥化酶在催化機(jī)理上面存在獨(dú)特的地方。

((a、b)利用含有pME6032-naaBL1SL2重組質(zhì)粒的無色桿菌SJY1-naaBL1SL2休止細(xì)胞轉(zhuǎn)化煙酸，分別取0 h(a)和2 h(b)的樣品進(jìn)行HPLC檢測。(c)將休止細(xì)胞反應(yīng)2 h的樣品進(jìn)行LC-MS檢測。(a, b) HPLC analysis of the reaction samples at 0 h and 2 h for the transformation of nicotinic acid by resting cells of strain SJY1-naaBL1SL2. (c) LC-MS analysis of the reaction samples at 2 h for the transformation of nicotinic acid by resting cells of strain SJY1-naaBL1SL2.)

(分別利用含有pME6032-naaBL1SL2重組質(zhì)粒的無色桿菌SJY1和大腸桿菌Trans1-T1的休止細(xì)胞轉(zhuǎn)化煙酸。Nicotinic acid was transformed by resting cells of Achromobacter sp. SJY1 and Escherichia coli Trans1-T1 containing pME6032-naaBL1SL2, respectively.)

3 討論

產(chǎn)堿桿菌P156是從遼河口油田污染的土壤中分離的一株能夠以煙酰胺作為唯一碳氮源和能源進(jìn)行生長的菌株。前期本文作者對煙酰胺的代謝途徑和降解的分子機(jī)理進(jìn)行了研究，克隆了編碼煙酰胺脫氨酶和從6-羥基煙酸到富馬酸的基因，并對這些基因的功能進(jìn)行了驗(yàn)證，但是負(fù)責(zé)煙酸到6-羥基煙酸的催化反應(yīng)的基因并不清楚。在本次研究中，對naa基因簇上面編碼煙酸羥化酶(NaaB)的基因進(jìn)行了克隆和功能驗(yàn)證。NaaB由3個基因編碼，分別是naaBL1、naaBS和naaBL2。其中naaBL1和naaBL2分別編碼了2個含有鉬輔因子結(jié)合結(jié)構(gòu)的大亞基，而naaBS基因編碼了一個含有[2Fe-2S]簇的小亞基。將目前已經(jīng)報(bào)道的煙酸羥化酶基因與NaaB的編碼基因進(jìn)行了比較[4-5,19-20](見圖6)，發(fā)現(xiàn)NaaB的編碼基因的排列順序與目前報(bào)道的煙酸羥化酶基因存在較大差異。從圖6中可以看出，大部分的煙酸羥化酶基因都只含有1個鉬輔因子結(jié)合的大亞基，只有NaaB和Nah同時含有2個鉬輔因子結(jié)合的大亞基。NaaB與Nah的基因排列順序也存在差異，這表明了NaaB與其他的煙酸羥化酶在很早就脫離并獨(dú)自進(jìn)化。

(NaaBL1SL2來自產(chǎn)堿桿菌P156，NicAB來自惡臭假單胞菌KT2440，NaDHSLM來自睪丸酮叢毛單胞菌JA1，NahAB1B2來自極小單胞菌T2，NdhFSLM來自巴氏真桿菌(Eubacterium barkeri)。蛋白質(zhì)下面的字母表示相應(yīng)蛋白質(zhì)的亞單位名稱。NaaBL1SL2 from Alcaligenes sp. P156, NicAB from Pseudomonas putida KT2440, NaDHSLM from Comamonas testosteroni JA1, NahAB1B2 from Pusillimonas sp. T2, NdhFSLM from Eubacterium barkeri. The letters depicted below the proteins indicate the subunit names of the corresponding proteins.)

NaaB不僅在基因結(jié)構(gòu)上與已經(jīng)報(bào)道的煙酸羥化酶存在差異，而且在功能上面也存在差異。惡臭假單胞菌KT2440中的煙酸羥化酶不能夠在大腸桿菌中表達(dá)出活力[4]，但是NaaB可以在大腸桿菌Trans1-T1中表達(dá)并具備轉(zhuǎn)化煙酸的功能。目前報(bào)道的大部分的吡啶環(huán)ɑ位羥化酶都不能夠在大腸桿菌中表達(dá)，例如之前報(bào)道的無色桿菌SJY1中的尼古丁脫氫酶[28]。造成這一現(xiàn)象的主要原因是大腸桿菌和惡臭假單胞菌中的鉬輔因子的類型不同。在合成鉬輔因子的過程中，GMP或者CMP會結(jié)合到鉬蝶呤的磷酸基團(tuán)上，形成具有功能的鉬輔因子[29]。在大腸桿菌中只能夠合成鉬雙-MTP-鳥嘌呤二核苷酸(MGD)類型的鉬輔因子，不能夠合成硫化鉬蝶呤胞嘧啶二核苷酸(MCD)類型的鉬輔因子[29]。但是大部分的吡啶ɑ位羥化酶基因所需要的鉬輔因子都是MCD的而不是MGD[4,30]，因此不能夠用大腸桿菌來表達(dá)吡啶環(huán)ɑ位羥化酶。

為了解釋NaaB在大腸桿菌中具備轉(zhuǎn)化煙酸的功能，本文作者對已經(jīng)報(bào)道的煙酸羥化酶的催化結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了詳細(xì)分析。通過圖6可以看出，所有的煙酸羥化酶均具備鉬輔因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域和[2Fe-2S]簇結(jié)構(gòu)域，有研究表明[2Fe-2S]簇決定了底物的類型，盡管這一結(jié)論尚無進(jìn)一步的驗(yàn)證，但是這些結(jié)果均說明[2Fe-2S]簇對于維持鉬結(jié)合羥化酶的活力是必須的。

此外，絕大部分已報(bào)道功能的吡啶環(huán)ɑ位羥化酶除鉬輔因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域和[2Fe-2S]簇結(jié)構(gòu)域外還含有第3種結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域通常是FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者細(xì)胞色素c結(jié)構(gòu)域，這個結(jié)構(gòu)域可能負(fù)責(zé)了催化過程中的電子傳遞過程。在NaaB的三個亞基分別包含了鉬輔因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域，[2Fe-2S]簇結(jié)構(gòu)域和一個細(xì)胞色素c結(jié)構(gòu)域。更進(jìn)一步的分析可以發(fā)現(xiàn)，鉬輔因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)嶋H上包含了三個亞結(jié)構(gòu)域，分別是MPT1、MPT2和MPT3，目前報(bào)道的所有的鉬結(jié)合吡啶環(huán)ɑ位羥化酶均同時具備了這三個亞結(jié)構(gòu)域。這就解釋了為什么NaaB必須同時具備三個亞基才能夠具備轉(zhuǎn)化煙酸的功能，因?yàn)镹aaBL1亞基缺少了細(xì)胞色素c這個電子傳遞的結(jié)構(gòu)域，而NaaBL2缺少了MPT1亞結(jié)構(gòu)域，因此鉬輔因子結(jié)構(gòu)域是不完整的。在NaaB中存在了2個鉬輔因子結(jié)合的大亞基，這兩個大亞基可能分別能夠與MCD和MGD進(jìn)行結(jié)合，催化煙酸的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，這就解釋了為什么NaaB能夠同時在無色桿菌、產(chǎn)堿桿菌、大腸桿菌和假單胞菌中具備功能。

本研究結(jié)果加深了對吡啶ɑ位羥化酶不同亞基以及不同結(jié)構(gòu)域在鉬輔因子類型選擇方面的理解。但是，仍然有很多問題需要解決，例如究竟哪個亞基決定了底物的特異性，不同煙酸羥化酶的亞基之間的功能是否可以互補(bǔ)，NaaB中哪些小結(jié)構(gòu)域是關(guān)鍵的，哪些可以去除，這些都需要進(jìn)一步的深入研究?？傊?，本研究的結(jié)果為吡啶類化合物轉(zhuǎn)化的分子機(jī)理研究提供了參考。