聚苯乙烯和四溴聯(lián)苯醚對(duì)黑褐新糠蝦抗氧化防御系統(tǒng)的聯(lián)合效應(yīng)*

陳鈕振， 李正炎,2**

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院， 山東 青島 266100； 2. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266100)

自1950年代塑料產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展以來(lái)，其在環(huán)境中的含量持續(xù)增加。大型塑料垃圾被排放進(jìn)入水體后，經(jīng)由物理、化學(xué)和生物作用逐漸分解成不同尺寸的塑料碎片，學(xué)術(shù)界通常將粒徑在5 mm以下的塑料碎片稱為微塑料[1-3]。微塑料在水環(huán)境中廣泛分布，目前水環(huán)境中常見的微塑料類型主要包括聚乙烯(Polyethylene, PE)、聚丙烯(Polypropylene, PP)、聚氯乙烯(Polyvinyl chloride, PVC)、聚苯乙烯(Polystyrene, PS)等。從濱海沙灘到開闊大洋、從表層海水到海底、深海沉積物及海洋生物體內(nèi)均有不同類型的微塑料檢出。微塑料污染主要集中在沿海地區(qū)和亞熱帶環(huán)流區(qū)，但即使在遠(yuǎn)離污染源的極地地區(qū)也有微塑料的存在。由于其具有體積小、疏水性強(qiáng)、不易被生物降解的特點(diǎn)，可以在環(huán)境中長(zhǎng)期存在。微塑料進(jìn)入貽貝(Mytilusedulis)體內(nèi)后可誘導(dǎo)溶酶體膜的穩(wěn)態(tài)失衡并形成粒細(xì)胞瘤，且隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)炎癥反應(yīng)加劇[4]。這表明微塑料可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并在組織和細(xì)胞水平上對(duì)生物產(chǎn)生毒害作用。盡管大粒徑塑料的研究最為廣泛，但納米塑料在海洋環(huán)境中的數(shù)量可能更為龐大[5]。大粒徑塑料的進(jìn)一步碎片化是水環(huán)境中納米塑料的重要來(lái)源之一，納米塑料顆粒能降低蛋白核小球藻細(xì)胞葉綠素a含量，并增加細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species, ROS)水平[6]；納米塑料還具有生物積累和生物放大的潛力[7]，已有研究證明其可沿食物網(wǎng)從藻類向浮游動(dòng)物和魚類傳遞。納米塑料是微塑料相關(guān)研究中報(bào)道最少的一種塑料類型，目前對(duì)其環(huán)境濃度、生物積累潛力和毒性知之甚少。

多溴聯(lián)苯(Polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)是一類溴化阻燃劑，穩(wěn)定性強(qiáng)且價(jià)格低廉，因此被廣泛應(yīng)用于電子電器、建筑材料以及塑料的加工過(guò)程中。溴化程度較低的溴化二苯醚(主要是BDE-47、-99、-100)是生物樣品中檢測(cè)到的主要同系物，其中BDE-47占PBDEs總量的70%左右。BDE-47的高度親脂性(logKow=6.67)使其容易在生物體內(nèi)積累[8]，因此，其對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)已引起學(xué)術(shù)界和民眾的高度關(guān)注。Jiang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，暴露于BDE-47溶液中的貽貝(Mytilusedulis)血細(xì)胞死亡率和微核率均增加，溶酶體的吞噬能力顯著降低。此外，BDE-47暴露顯著增加了鮭魚頭腎巨噬細(xì)胞中超氧陰離子的產(chǎn)生量，并使鮭魚在鰻利斯頓氏菌(Listonellaanguillarum)攻擊下的存活率降低，這表明BDE-47暴露可改變鮭魚的先天免疫應(yīng)答和疾病易感性[10]。但在自然環(huán)境中，海洋往往受到多種化學(xué)污染物的共同作用，Oliveira等[11-12]研究發(fā)現(xiàn)，在PS與芘的聯(lián)合暴露組中，鰕虎魚(Pomatoschistusmicrops)體內(nèi)乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)和異檸檬酸脫氫酶(Isocitrate dehydrogenase, IDH)活性顯著降低。PS和PAHs復(fù)合暴露可在細(xì)胞和基因水平上干擾日本青鳉(Oryziaslatipes)內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常功能。已有研究表明[13]，與BDE-47單獨(dú)暴露相比，PS和BDE-47聯(lián)合暴露顯著提高了貽貝(Mytilusedulis)的呼吸速率和體內(nèi)丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量。因此，微塑料與其他環(huán)境污染物復(fù)合污染的潛在風(fēng)險(xiǎn)值得進(jìn)一步研究，以期更深入地了解微塑料對(duì)海洋生物的生態(tài)毒性。

生物標(biāo)志物是反映環(huán)境污染狀況的毒理學(xué)指標(biāo)，可通過(guò)監(jiān)測(cè)其變化情況來(lái)評(píng)估污染物的毒性效應(yīng)[14]。但不同生物標(biāo)志物對(duì)污染物的響應(yīng)強(qiáng)度及變化各異，孤立使用單一生物標(biāo)志物無(wú)法全面準(zhǔn)確評(píng)估某一種環(huán)境污染物的毒性效應(yīng)。而綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)(Integrated Biomarker Response, IBR)則可以定量評(píng)估一系列生物標(biāo)志物對(duì)環(huán)境污染物的綜合響應(yīng)情況。李傳慧[15]通過(guò)檢測(cè)幾種抗氧化酶和免疫酶的含量來(lái)探究原油污染對(duì)半滑舌鰨幼魚(Cynoglossussemilaevis)的毒性效應(yīng)，IBR分析結(jié)果表明，溶菌酶(Lysozyme，LSZ)和Na+-K+-ATPase對(duì)石油污染更敏感，適合作為石油類污染的生物標(biāo)志物。李志華等[16]以鱒魚為受試生物，運(yùn)用IBR指數(shù)分析污水排放對(duì)河流上、下游環(huán)境的影響，結(jié)果表明水體中39種污染物對(duì)下游的污染均顯著強(qiáng)于上游。除上述應(yīng)用外，國(guó)內(nèi)外其他學(xué)者也運(yùn)用該方法對(duì)不同水體的污染程度進(jìn)行了一系列評(píng)估[17-19]。

黑褐新糠蝦(Neomysisawatschensis)是一種較小的甲殼類浮游動(dòng)物，常見于河口近岸水域。由于其具有易于培養(yǎng)和操作、生命周期短等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是生態(tài)毒理學(xué)研究很有前景的模式生物。納米塑料具有更大的比表面積和強(qiáng)疏水性，可吸附海洋環(huán)境中其他化學(xué)污染物，形成“外源污染物+納米塑料”的復(fù)合污染模式。已有研究報(bào)道了微塑料和BDE-47單獨(dú)暴露下的毒性效應(yīng)，但2種污染物聯(lián)合暴露下的復(fù)合效應(yīng)目前尚不明確。為了探究微塑料和BDE-47對(duì)黑褐新糠蝦的毒性效應(yīng)，本研究選擇PS和BDE-47作為脅迫因子，通過(guò)測(cè)定黑褐新糠蝦體內(nèi)過(guò)氧化氫酶(Catalase, CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase, GPX)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase, GST)、谷胱甘肽(Glutathione, GSH)和MDA的活性水平，并結(jié)合IBR指數(shù)定量評(píng)估PS和BDE-47單獨(dú)及聯(lián)合暴露下的毒性效應(yīng)，研究結(jié)果可為評(píng)估PS和BDE-47共存條件下的海洋環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用海水來(lái)自青島市近岸潔凈海區(qū)，經(jīng)過(guò)濾、消毒后使用；黑褐新糠蝦(Neomysisawatschensis)由中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物博物館提供。實(shí)驗(yàn)前室內(nèi)馴養(yǎng)一周：鹽度為21±0.6；溫度為(22.6±0.6) ℃；pH為8.1±0.1，每天以新孵化的鹵蟲(Artemiafranciscana)為餌料投喂兩次(上午8:00，下午17:00)。每48 h更換新鮮海水，并及時(shí)清理排泄物、殘餌和死亡個(gè)體。2.5%(W∶V)的聚苯乙烯微球購(gòu)自天津倍思樂(lè)色譜技術(shù)開發(fā)中心(90 nm，10 mL)；2,2′,4,4′-四溴聯(lián)苯醚(BDE-47，純度95%,購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司)，用二甲亞砜(DMSO，分析純，購(gòu)自科密歐化學(xué)試劑有限公司)作為助溶劑配置1.5 g·L-1的母液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 暴露濃度設(shè)計(jì) 根據(jù)研究報(bào)道[20]，目前微塑料豐度最高值(102 000 個(gè)/L)出現(xiàn)在瑞典沿海水域。根據(jù)Lenz等的估計(jì)，塑料微球直徑每減少10倍，其環(huán)境豐度將增加1 000倍[21]。基于文獻(xiàn)報(bào)道的海洋環(huán)境中微塑料豐度和水生生物毒性試驗(yàn)濃度設(shè)置[18,22]，本研究中微塑料暴露設(shè)置4個(gè)濃度：9.74、97.4、974和9 740 μg·L-1，另設(shè)一個(gè)空白對(duì)照組，每組三個(gè)重復(fù)。

BDE-47溶解度較低，在自然海水中的環(huán)境濃度一般在1 μg·L-1左右[23]。目前已有相關(guān)研究表明1～15 μg·L-1的BDE-47暴露對(duì)海洋生物有顯著毒性[24-25]?；诤Ｋ蠦DE-47的環(huán)境濃度和已有報(bào)道中海洋生物毒性試驗(yàn)的濃度設(shè)置，本研究將BDE-47的暴露濃度設(shè)為1.5、15和150 μg·L-1。另設(shè)一個(gè)空白對(duì)照組，一個(gè)溶劑對(duì)照組(0.002% DMSO)，每組三個(gè)重復(fù)。

聯(lián)合暴露組：9.74 μg·L-1PS+1.5 μg·L-1BDE-47，9.74 μg·L-1PS+150 μg·L-1BDE-47，9 740 μg·L-1PS+1.5 μg·L-1BDE-47，9 740 μg·L-1PS+150 μg·L-1BDE-47；另設(shè)一個(gè)空白對(duì)照組，一個(gè)溶劑對(duì)照組(0.002% DMSO)，每組三個(gè)平行。分別記為L(zhǎng)P+LB組，LP+HB組，HP+LB組，HP+HB組，CK組和SOLVENT組。

1.2.2 染毒實(shí)驗(yàn)與樣品制備 選擇馴化后體長(zhǎng)相近(5±0.5) mm、健康活潑的黑褐新糠蝦，隨機(jī)將其分配到20 L玻璃缸中(加入15 L海水)，每缸放入80只糠蝦，連續(xù)曝氣培養(yǎng)，每48 h更換全部溶液，其他實(shí)驗(yàn)條件與馴養(yǎng)期相同。每天定時(shí)投喂并清理玻璃缸，于第21天收集受試生物用于各項(xiàng)生物標(biāo)志物測(cè)定。用去離子水沖洗掉樣本體表粘附的溶液，并用濾紙拭干多余水分，取10只糠蝦置于Eppendorf管中，在冰水浴條件下，以PBS緩沖液作為勻漿介質(zhì)，采用電動(dòng)生物組織研磨器(G10，生工生物工程股份有限公司，上海)將樣品制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的組織勻漿液。經(jīng)4 ℃、8 000 r·min-1低溫離心10 min，取上清液用于各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定 蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法；SOD、CAT、MDA、GST、GSH和GPX的活性均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測(cè)定，具體操作按照說(shuō)明書進(jìn)行，并借助酶標(biāo)儀(SP-Max 2300A，上海閃譜生物科技有限公司，上海)及紫外分光光度計(jì)(UV754N，青島路博建業(yè)環(huán)?？萍加邢薰?，青島)測(cè)定吸光度。

IBR數(shù)值的具體計(jì)算過(guò)程主要包括以下步驟[26]：

(1)

各生物標(biāo)志物在每個(gè)實(shí)驗(yàn)水平下的得分情況按下式計(jì)算：

Si=Z+|Min|。

(2)

式中：|Min|是各生物標(biāo)志物在所有實(shí)驗(yàn)水平下的Zi最小值的絕對(duì)值；Z由上一步均一化數(shù)值推導(dǎo)而來(lái)，若生物標(biāo)志物受到激活，則令Z=+Yi；若生物標(biāo)志物受抑制，則令Z=-Yi。

其次繪制星狀圖并計(jì)算面積：星狀圖中每條輻射線的長(zhǎng)度分別表示某一實(shí)驗(yàn)水平下一種生物標(biāo)志物的得分Si。按照以下公式計(jì)算面積：

Ai=0.5×Si×sinβ×(Si×cosβ+Si+1×sinβ)。

(3)

式中：Si和Si+1分別表示星狀圖中順時(shí)針?lè)较蜻B續(xù)兩個(gè)得分；n表示所測(cè)定的生物標(biāo)志物的數(shù)目；Ai表示第i條和第i+1條輻射線所圍成的三角形的面積。

(4)

式中α為相鄰兩條輻射線之間的夾角。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值(標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，并借助SPSS 25.0對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，采用最小顯著差數(shù)法(LSD法)檢驗(yàn)組內(nèi)及組間的顯著性差異(P<0.05差異顯著，P<0.01差異極顯著)。采用Origin 2018進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 PS單獨(dú)暴露對(duì)黑褐新糠蝦體內(nèi)生物標(biāo)志物的影響

所有PS暴露濃度下的CAT活性均低于空白對(duì)照組，并隨著暴露濃度的增加而逐漸降低。當(dāng)暴露濃度較高時(shí)(97.4～9 740 μg·L-1)，實(shí)驗(yàn)組的CAT活性與對(duì)照組間差異顯著，并在974 μg·L-1濃度組中達(dá)到最低活性水平，濃度繼續(xù)增加至9 740 μg·L-1時(shí)，CAT活性未繼續(xù)降低(見圖1(a))。SOD活性僅在高暴露濃度組中(974～9 740 μg·L-1)顯著低于對(duì)照組(見圖1(b))。與對(duì)照組相比，低濃度PS組中(9.74 μg·L-1)MDA含量未顯著改變，隨著暴露濃度的增加， MDA含量逐漸升高且與對(duì)照組間有顯著差異(見圖1(c))。與對(duì)照組相比，GST活性在較高濃度組中(97.4～9 740 μg·L-1)顯著降低，但各PS實(shí)驗(yàn)組間并無(wú)顯著差異，GST活性整體呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)(見圖1(d))。當(dāng)暴露濃度為97.4 μg·L-1時(shí)，GSH含量顯著升高，但其他實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間并無(wú)顯著差異，GSH含量隨暴露濃度的增加總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)(見圖1(e))。當(dāng)暴露濃度為974～9 740 μg·L-1時(shí)，GPX活性顯著低于對(duì)照組，且各實(shí)驗(yàn)組間GPX活性存在顯著差異，隨著暴露濃度的增加GPX活性整體呈降低的趨勢(shì)(見圖1(f))。

2.2 BDE-47單獨(dú)暴露對(duì)黑褐新糠蝦體內(nèi)生物標(biāo)志物的影響

暴露21 d后，空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組間無(wú)顯著差異，說(shuō)明溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著影響。與空白和溶劑對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組中CAT活性均顯著降低，當(dāng)暴露濃度為150 μg·L-1時(shí)，CAT活性達(dá)到最低活性水平，CAT活性整體呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)(見圖2(a))。當(dāng)暴露濃度為1.5～15 μg·L-1時(shí)，SOD活性顯著高于空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組，而當(dāng)濃度進(jìn)一步增加到150 μg·L-1時(shí)，SOD活性恢復(fù)至對(duì)照組水平，SOD活性整體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)(見圖2(b))。與對(duì)照組相比，隨著暴露濃度的增加，各實(shí)驗(yàn)組的MDA含量逐漸升高，當(dāng)濃度為15～150 μg·L-1時(shí)，MDA含量顯著高于對(duì)照組，且各實(shí)驗(yàn)組間的MDA含量差異顯著(見圖2(c))。當(dāng)暴露濃度較高時(shí)(15～150 μg·L-1),GST活性顯著低于對(duì)照組，但無(wú)顯著的組間差異(見圖2(d))。與對(duì)照組相比，低濃度組(1.5 μg·L-1)中的GSH含量未發(fā)生顯著變化，當(dāng)濃度進(jìn)一步升高時(shí)，GSH含量顯著降低，GSH含量隨著暴露濃度的升高整體呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)(見圖2(e))。當(dāng)暴露濃度處于低水平時(shí)(1.5 μg·L-1)，GPX活性與對(duì)照組無(wú)顯著差異，隨著暴露濃度繼續(xù)升高，GPX活性與對(duì)照組間存在顯著差異,并在15 μg·L-1的濃度組中達(dá)到最大活性水平，GPX活性整體呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)(見圖2(f))。

圖1 PS單獨(dú)暴露對(duì)黑褐新糠蝦抗氧化機(jī)能的影響(不同字母表示各實(shí)驗(yàn)組間有顯著差異，P<0.05)

圖2 BDE-47單獨(dú)暴露對(duì)黑褐新糠蝦抗氧化機(jī)能的影響

2.3 PS和BDE-47聯(lián)合暴露對(duì)黑褐新糠蝦體內(nèi)生物標(biāo)志物的影響

與對(duì)照組相比，在BDE-47實(shí)驗(yàn)組中投加低濃度PS后，CAT活性顯著升高，隨著PS投加量的增加，CAT活性出現(xiàn)顯著下降。與BDE-47單獨(dú)暴露時(shí)相比，各聯(lián)合暴露組的CAT活性均顯著升高(見圖3(a))。在低濃度PS和高濃度BDE-47、高濃度PS和低濃度BDE-47、高濃度PS和高濃度BDE-47聯(lián)合暴露組中，觀察到SOD活性與對(duì)照組間均存在顯著差異。與BDE-47單獨(dú)暴露組相比，當(dāng)BDE-47濃度較低時(shí)，加入低濃度PS可使SOD活性顯著升高，繼續(xù)升高PS濃度則會(huì)使SOD活性降低但未見顯著差異；當(dāng)BDE-47濃度較高時(shí)，加入低濃度PS同樣會(huì)使SOD顯著升高并達(dá)到最大活性水平(見圖3(b))。在各聯(lián)合暴露組中，當(dāng)BDE-47暴露濃度較低時(shí),高濃度PS的存在使MDA含量顯著高于BDE-47單獨(dú)暴露組；當(dāng)BDE-47暴露濃度較高時(shí)，隨著PS濃度的升高M(jìn)DA含量逐漸升高，且在高濃度PS和高濃度BDE-47共存時(shí)出現(xiàn)最大含量(見圖3(c))。

各聯(lián)合暴露組中GST活性與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，且均低于BDE-47單獨(dú)暴露組，當(dāng)BDE-47濃度較低時(shí)，GST活性隨著PS投加濃度的升高而顯著增加；當(dāng)BDE-47濃度較高時(shí)，增加PS的投加濃度并未顯著改變GST活性(見圖3(d))。當(dāng)?shù)蜐舛萈S分別與低、高濃度的BDE-47聯(lián)合暴露時(shí)，GSH含量與對(duì)照組間無(wú)顯著差異；當(dāng)高濃度PS分別與低、高濃度的BDE-47聯(lián)合暴露時(shí)，GSH含量與對(duì)照組間有顯著差異，且隨著BDE-47濃度升高顯著降低。與BDE-47單獨(dú)暴露相比，當(dāng)BDE-47濃度較低時(shí)，投加高濃度PS可使GSH含量顯著升高，而當(dāng)BDE-47濃度較高時(shí)，低濃度PS的存在可使聯(lián)合暴露組的GSH含量顯著升高(見圖3(e))。與對(duì)照組相比，僅高濃度PS和高濃度BDE-47聯(lián)合暴露組的GPX活性顯著降低，且各聯(lián)合暴露組的GPX活性均顯著低于BDE-47單獨(dú)暴露組(見圖3(f))。

(CK：空白對(duì)照；Solvent：溶劑對(duì)照；LB：低濃度BDE-47組；HB：高濃度BDE-47組；LP+LB：低濃度PS+低濃度BDE-47組；LP+HB：低濃度PS+高濃度BDE-47組；HP+LB：高濃度PS+低濃度BDE-47組，HP+HB：高濃度PS+高濃度BDE-47組。CK: Control; SOLVENT: Solvent control; LB: Low BDE-47 concentration groups; HB: High BDE-47 concentration groups; LP+LB: Low PS+Low BDE-47 concentration groups; LP+HB: Low PS+High BDE-47 concentration groups; HP+LB: High PS+ Low BDE-47 concentration groups; HP+HB：High PS+High BDE-47 concentration groups.)

2.4 綜合生物標(biāo)志物分析

星狀圖中每個(gè)不規(guī)則多邊形的面積分別代表該實(shí)驗(yàn)組的IBR數(shù)值，六種生物標(biāo)志物在不同的實(shí)驗(yàn)組中具有不同的響應(yīng)模式，與其他實(shí)驗(yàn)組相比，最高濃度組的星狀圖覆蓋面積最大，即IBR數(shù)值也最大。由圖4(a)可知，在較低暴露濃度下(9.74 μg·L-1)，GPX、CAT、MDA及SOD幾種生物標(biāo)志物有較高的響應(yīng)水平，最高響應(yīng)水平為9 740 μg·L-1濃度組的MDA含量(4.31)。總體而言，SOD、CAT、MDA和GPX在所有濃度下均有較高的響應(yīng)水平，說(shuō)明這幾種生物標(biāo)志物對(duì)于PS污染的反應(yīng)比較靈敏。不同BDE-47暴露濃度下的IBR響應(yīng)水平如圖4(b)所示，隨著暴露濃度的升高，星狀圖的覆蓋面積逐漸增加，說(shuō)明BDE-47對(duì)黑褐新糠蝦的脅迫作用隨濃度增加而加劇，其中最大響應(yīng)水平出現(xiàn)在150 μg·L-1濃度組的CAT活性中(3.81)。整體而言，CAT、MDA、GST和GSH有較高的響應(yīng)水平，表明以上幾種生物標(biāo)志物對(duì)于BDE-47污染的反應(yīng)比較靈敏。PS和BDE-47聯(lián)合暴露下的IBR響應(yīng)水平如圖4(c)所示，不同聯(lián)合暴露條件下的響應(yīng)情況不一致，當(dāng)高PS濃度和高BDE-47濃度聯(lián)合暴露時(shí)，星狀圖覆蓋面積最大，IBR數(shù)值也最大(28.1)，表明當(dāng)高濃度PS和高濃度BDE-47共存時(shí)黑褐新糠蝦受到的脅迫效應(yīng)最強(qiáng)。SOD、MDA、CAT、GST和GSH在所有暴露濃度下均有較高的響應(yīng)水平，說(shuō)明以上生物標(biāo)志物在PS和BDE-47共存時(shí)具有較高的靈敏度。

(CK：空白對(duì)照；Solvent：溶劑對(duì)照；LB：低濃度BDE-47組；HB：高濃度BDE-47組；LP+LB：低濃度PS+低濃度BDE-47組；LP+HB：低濃度PS+高濃度BDE-47組；HP+LB：高濃度PS+低濃度BDE-47組，HP+HB：高濃度PS+高濃度BDE-47組。(a) PS單獨(dú)暴露下黑褐新糠蝦體內(nèi)綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)星狀圖；(b) BDE-47單獨(dú)暴露下黑褐新糠蝦體內(nèi)綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)星狀圖；(c) PS和BDE-47聯(lián)合暴露下黑褐新糠蝦體內(nèi)綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)星狀圖。CK: Control; Solvent: Solvent control; LB: Low BDE-47 concentration groups; HB: High BDE-47 concentration groups; LP+LB: Low PS + Low BDE-47 concentration groups; LP+HB: Low PS + High BDE-47 concentration groups; HP+LB: High PS+ Low BDE-47 concentration groups; HP+HB：High PS+ High BDE-47 concentration groups. (a) Integrated Biomarker Response in Neomysis awatschensis exposed to PS; (b) Integrated Biomarker Response in Neomysis awatschensis exposed to BDE-47; (c) Integrated Biomarker Response in Neomysis awatschensis under combined exposure of PS and BDE-47)

各實(shí)驗(yàn)組IBR響應(yīng)水平隨暴露濃度的變化情況如圖5所示。當(dāng)PS單獨(dú)暴露時(shí)(見圖5(a))，IBR響應(yīng)水平隨著暴露濃度的增加整體上呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢(shì)，當(dāng)暴露濃度為97.4 μg·L-1時(shí)有最低的響應(yīng)水平(9.21)，隨著暴露濃度的進(jìn)一步增加，IBR值逐漸增加并在9 740 μg·L-1濃度組中達(dá)到最大水平(14.98)。當(dāng)BDE-47單獨(dú)暴露時(shí)(見圖5(b))，與對(duì)空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組相比，隨著暴露濃度的增加IBR數(shù)值逐漸增大，并在150 μg·L-1濃度組中達(dá)到最大響應(yīng)水平(15.69)。當(dāng)PS和BDE-47聯(lián)合暴露時(shí)(見圖5(c))，所有聯(lián)合暴露實(shí)驗(yàn)組的IBR響應(yīng)水平均高于空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組，在低濃度PS存在時(shí)，增加BDE-47的暴露濃度并未觀察到IBR響應(yīng)水平的升高，而在高濃度PS存在時(shí)，增加BDE-47的暴露濃度可使IBR響應(yīng)水平隨之升高，在高濃度PS和高濃度BDE-47共存時(shí)有最大響應(yīng)水平(28.1)。

((a) PS單獨(dú)暴露下黑褐新糠蝦體內(nèi)綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)；(b) BDE-47單獨(dú)暴露下黑褐新糠蝦體內(nèi)綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)；(c) PS和BDE-47聯(lián)合暴露下黑褐新糠蝦體內(nèi)綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)。(a) IBR variation with concentrations in Neomysis awatschensis exposed to PS; (b) IBR variation with concentrations in Neomysis awatschensis exposed to BDE-47; (c) IBR variation with concentrations in Neomysis awatschensis under the combined exposure of PS and BDE-47)

3 討論

本研究選用的黑褐新糠蝦是一種小型雜食性甲殼動(dòng)物，由于其在環(huán)境中分布范圍廣、室內(nèi)馴養(yǎng)便利，已被用作生態(tài)毒理學(xué)的模式生物。研究表明[27-29]，ROS水平升高和氧化應(yīng)激是機(jī)體在納米顆粒脅迫下產(chǎn)生損傷的早期事件。本文以黑褐新糠蝦為受試生物進(jìn)行PS的脅迫實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明PS暴露可能增加黑褐新糠蝦體內(nèi)的ROS水平，從而激活細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)來(lái)對(duì)抗氧化應(yīng)激，這與先前的研究報(bào)道結(jié)論相符[30-31]。在高暴露濃度下(974～9 740 μg·L-1)，SOD和GPX的活性被顯著抑制，這與Yu等[20]的研究結(jié)果相似。這可能是因?yàn)樵诟邼舛萈S暴露下超氧陰離子的產(chǎn)生速率超過(guò)抗氧化防御系統(tǒng)的清除速率，致使生物機(jī)體受到不可逆轉(zhuǎn)的損傷。而MDA含量在低濃度下低于對(duì)照組，這是因?yàn)殡S著抗氧化防御系統(tǒng)被激活，機(jī)體產(chǎn)生的抗氧化物質(zhì)清除了可對(duì)組織細(xì)胞造成損傷的自由基，隨著PS暴露濃度繼續(xù)增加，MDA含量逐漸升高，表明PS以濃度依賴的方式誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化。Zheng等[32]的研究表明PS暴露可使大鼠肝細(xì)胞的MDA含量被顯著誘導(dǎo)，這與本研究的結(jié)果相符。Abidli等[33]通過(guò)14 d暴露試驗(yàn)探究了PE對(duì)貽貝的潛在毒性，結(jié)果表明抗氧化系統(tǒng)內(nèi)的CAT與GST活性均降低。本研究中，隨著PS濃度的增加CAT和GST活性也都受到抑制，這一現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是因?yàn)楦邼舛萈S需要抗氧化防御系統(tǒng)產(chǎn)生大量的抗氧化酶來(lái)將其清除，另外在高濃度PS的長(zhǎng)期毒害作用下，機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的解毒功能受到損傷，故CAT和GST活性迅速降低。

在選取的BDE-47暴露濃度范圍內(nèi)，所有實(shí)驗(yàn)組的CAT和GST活性均受到顯著抑制，這與先前的研究結(jié)果相似[34]。這一過(guò)程表明在低濃度外源污染物的長(zhǎng)期暴露下，機(jī)體內(nèi)自由基、過(guò)氧化物的含量大量增加，需要消耗抗氧化酶來(lái)將其清除，故造成CAT和GST活性顯著低于對(duì)照組，當(dāng)濃度升高至中等濃度時(shí)，CAT與GST活性未繼續(xù)增加，這可能是因?yàn)楹诤中驴肺r在通過(guò)自身的調(diào)節(jié)能力適應(yīng)該濃度范圍內(nèi)的BDE-47脅迫。當(dāng)暴露濃度升高至最大水平時(shí)，CAT活性繼續(xù)降低，而GST活性仍未出現(xiàn)顯著變化，由此可知BDE-47對(duì)CAT活性的影響較GST更強(qiáng)。已有研究表明[15]，解除石油污染脅迫后，半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)幼魚體內(nèi)的CAT活性在一定濃度范圍內(nèi)可恢復(fù)至空白水平，并得到了石油脅迫對(duì)CAT活性的影響閾值。由此推斷，SOD活性在高濃度暴露下可恢復(fù)至與對(duì)照組相近水平的潛在原因可能是本文所設(shè)暴露濃度尚未超過(guò)BDE-47對(duì)黑褐新糠蝦SOD活性的影響閾值，機(jī)體仍能通過(guò)調(diào)節(jié)作用適應(yīng)污染環(huán)境。而MDA含量則隨著濃度的增加呈現(xiàn)顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系，這與先前的研究報(bào)道相同[35]，表明脂質(zhì)過(guò)氧化作用在逐漸加強(qiáng)，最終可能導(dǎo)致生物膜系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)失衡[36]，在今后的研究中可結(jié)合組織病理學(xué)分析深入探究BDE-47的毒害作用。GSH是生物抗氧化防御系統(tǒng)中的重要成分，可作為GST和GPX的反應(yīng)底物通過(guò)催化反應(yīng)清除自由基和過(guò)氧化物，對(duì)于維護(hù)生物體免疫系統(tǒng)的正常功能具有重要作用[37-38]。較高濃度組(15～150 μg·L-1)的GSH含量顯著降低，而GPX的活性顯著增加，原因可能是機(jī)體受到環(huán)境中高濃度BDE-47的長(zhǎng)期脅迫后，抗氧化防御系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生大量的GPX來(lái)清除自由基。

由于其特殊的理化性質(zhì)，納米塑料作為載體吸附其他外源化學(xué)污染物的潛力值得關(guān)注，如有機(jī)氯農(nóng)藥[39]、多環(huán)芳烴[40]、多溴聯(lián)苯醚[41]、多氯聯(lián)苯[42]、雙酚A[43]和重金屬[44]，其中包括致癌物和內(nèi)分泌干擾物。微塑料的吸附作用可能會(huì)增加污染物在生物體內(nèi)的濃度，并通過(guò)食物網(wǎng)向更高營(yíng)養(yǎng)級(jí)生物轉(zhuǎn)移[45]。PS和BDE-47聯(lián)合暴露組的CAT活性均顯著高于BDE-47單獨(dú)暴露組，表明PS的加入緩解了BDE-47對(duì)黑褐新糠蝦體內(nèi)CAT的損傷。聯(lián)合暴露組的GST活性顯著低于BDE-47單獨(dú)暴露組，并且與對(duì)照組活性水平相近，GPX活性的變化規(guī)律同GST活性相似，僅在高濃度BDE-47和高濃度PS共存時(shí)表現(xiàn)出顯著的抑制效應(yīng)。低濃度PS與低、高濃度BDE-47聯(lián)合暴露下的GSH含量與對(duì)照組相近，以上結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明PS的存在可能在一定程度上緩解了BDE-47對(duì)糠蝦機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的脅迫作用，隨著PS暴露濃度的繼續(xù)增加，抗氧化物質(zhì)的活性會(huì)受到抑制，這種效應(yīng)是產(chǎn)生中毒反應(yīng)的前兆。由聯(lián)合暴露組的IBR隨濃度變化趨勢(shì)可知，當(dāng)PS濃度較低時(shí)，升高BDE-47的暴露濃度并未增加氧化脅迫，這也證實(shí)了PS的存在可在一定范圍內(nèi)緩解BDE-47的暴露毒性。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是微塑料的吸附作用降低了BDE-47的生物可利用度，故在一定范圍內(nèi)削減了BDE-47對(duì)機(jī)體的氧化應(yīng)激。有研究報(bào)道稱[46]， PVC和低濃度17α-乙烯基雌二醇(EE2)聯(lián)合暴露時(shí)，PVC可通過(guò)吸附作用降低EE2的自由態(tài)來(lái)減緩其對(duì)斑馬魚(Daniorerio)運(yùn)動(dòng)行為的抑制。Oliveira等[47]研究發(fā)現(xiàn)加入低濃度PS微球可將芘對(duì)鰕虎魚(Pomatoschistusmicrops)的半數(shù)致死時(shí)間(LT50)從29.0 h延緩至42.1 h。此前也有研究表明[48-49]，總比表面積越大，微塑料的吸附效率越大，這可能是低濃度PS暴露減輕脅迫而高濃度PS暴露無(wú)此效應(yīng)的潛在解釋。當(dāng)PS的投加濃度較高時(shí)，PS顆粒聚集結(jié)合從而減少了總比表面積，降低了PS對(duì)自由態(tài)BDE-47的吸附，脅迫作用加劇。也有研究表明[50]，四溴雙酚A(TBBPA)和PS對(duì)斑馬魚(Daniorerio)抗氧化防御系統(tǒng)的毒性作用主要表現(xiàn)為協(xié)同作用；Lu等[51]的研究也表明，PS與Cd聯(lián)合暴露可顯著抑制斑馬魚(Daniorerio)腸道組織中GSH的含量，二者表現(xiàn)出協(xié)同作用；何君儀[52]的研究結(jié)果表明，PS的加入會(huì)增強(qiáng)三磷酸苯酯(TPP)對(duì)斑馬魚(Daniorerio)抗氧化防御系統(tǒng)的氧化脅迫，這與本研究的結(jié)論相反。PS與熒蒽聯(lián)合暴露對(duì)貽貝(Mytilusedulis)細(xì)胞中ROS的含量先表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)，后表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)[53]。由此可知，微塑料與外源污染物聯(lián)合暴露對(duì)水生生物的毒性作用模式較為復(fù)雜，本文選取了一系列生物標(biāo)志物作為評(píng)價(jià)指標(biāo)來(lái)表征微塑料和BDE-47單獨(dú)及聯(lián)合暴露對(duì)黑褐新糠蝦的毒性效應(yīng)，今后可在本研究的基礎(chǔ)上結(jié)合組織病理學(xué)分析、基因組學(xué)和代謝組學(xué)等先進(jìn)分子生物學(xué)技術(shù)，深入探究其毒性作用機(jī)制。

4 結(jié)論

(1)隨著PS暴露濃度的增加，CAT、GST、SOD和GPX活性均表現(xiàn)出抑制效應(yīng)，MDA含量表現(xiàn)出誘導(dǎo)效應(yīng)，而GSH含量?jī)H在97.4 μg·L-1下被顯著誘導(dǎo)。隨著BDE-47暴露濃度的增加，CAT、GST和GSH均表現(xiàn)出抑制效應(yīng)，MDA和GPX在較高濃度下被顯著誘導(dǎo)，SOD在低濃度下被誘導(dǎo)，當(dāng)濃度增加至最大水平時(shí)恢復(fù)至空白水平。

(2) PS和BDE-47聯(lián)合暴露21 d后，各聯(lián)合組的CAT和SOD活性隨PS投加濃度升高表現(xiàn)出先誘導(dǎo)后抑制的效應(yīng)，且均顯著高于BDE-47單獨(dú)暴露組，MDA含量隨PS投加濃度升高表現(xiàn)出誘導(dǎo)效應(yīng)，GST和GPX活性與空白水平相近，低濃度PS暴露組中的GSH含量也有相似的變化規(guī)律。由于微塑料可以調(diào)節(jié)污染物的生物可利用度，加入PS可在一定范圍內(nèi)減緩BDE-47對(duì)黑褐新糠蝦抗氧化防御系統(tǒng)的氧化脅迫，此效應(yīng)在低濃度PS聯(lián)合暴露組中更加顯著。