脊椎動物神經(jīng)管背-腹圖式形成中形態(tài)素的調(diào)控作用綜述

劉聰，徐鵬飛

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，杭州 310058）

早在19 世紀末，Hans DRIESCH 發(fā)現(xiàn)從海膽胚胎中分離的2 個細胞可以發(fā)育成尺寸較小但結(jié)構(gòu)完整的海膽胚胎，由此認為在早期發(fā)育的胚胎中存在能夠指定每個細胞位置的坐標系統(tǒng)。1969 年，WOLPERT 構(gòu)建了“法國國旗”模型，首次提出了胚胎發(fā)育過程中存在位置信息的概念[1]，同時，該模型從分子水平上揭示了一種介導(dǎo)細胞位置調(diào)控和圖式形成的信號，這種信號（形態(tài)素）能夠通過給予位置信息來調(diào)控細胞命運，并進一步驅(qū)動大范圍的形態(tài)發(fā)生。目前的研究對形態(tài)素已經(jīng)有了一定的了解：形態(tài)素從局部組織分泌，通過擴散等方式形成濃度梯度，細胞響應(yīng)不同濃度的形態(tài)素并被誘導(dǎo)表達相應(yīng)的下游基因，從而進一步調(diào)控細胞命運的決定及其空間排布；同時，形態(tài)素下游的信號也可進一步通過調(diào)控細胞增殖、分化和遷移等過程來調(diào)控不同細胞群之間邊界的形成。

脊椎動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的前體——神經(jīng)管的形成是一個復(fù)雜而有序的發(fā)育過程，需要正確的細胞命運誘導(dǎo)和空間位置調(diào)控?？茖W(xué)家們已經(jīng)證實許多形態(tài)素參與調(diào)控神經(jīng)管的發(fā)育，包括參與神經(jīng)管前-后圖式形成的維甲酸（retinoic acid,RA）、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor, FGF）、生長分化因子（growth differentiation factor,GDF），以及參與神經(jīng)管背-腹圖式細胞分化和位置決定的Wingless-Int（Wnt）、骨形成蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）和音猬因子（Sonic hedgehog,Shh）[2]（圖1）。

圖1 脊椎動物神經(jīng)管背-腹圖式Fig.1 Dorsal-ventral pattern of vertebrate neural tube

Shh信號源自脊索并參與早期胚胎發(fā)育和身體圖式的形成。實驗證明，Shh信號負責調(diào)控神經(jīng)管腹側(cè)的細胞圖式，抑制Shh信號會導(dǎo)致雞、斑馬魚和小鼠胚胎中嚴重的神經(jīng)管背-腹圖式缺陷[3-4]。另外，體外實驗表明，當神經(jīng)前體細胞暴露于不同濃度的Shh蛋白中時，神經(jīng)管腹側(cè)細胞特異性基因的表達會顯著增加[5]。BMP信號在早期胚胎發(fā)育中也發(fā)揮重要作用，它與其自身拮抗基因相互作用，將胚胎的3個胚層細分為具有不同發(fā)育命運的區(qū)域。在神經(jīng)管發(fā)育過程中，不同濃度的BMP信號會沿著背腹軸誘導(dǎo)神經(jīng)管不同區(qū)域細胞命運的形成。抑制BMP 信號會導(dǎo)致雞和斑馬魚胚胎神經(jīng)管背側(cè)細胞圖式的嚴重缺陷[6]，BMP信號（如BMP4/7）或其受體的過表達則會導(dǎo)致大量的背側(cè)神經(jīng)祖細胞產(chǎn)生[7]。

近年來，類器官培養(yǎng)技術(shù)的興起進一步推動了對脊椎動物神經(jīng)管形成中BMP和Shh這2種信號的研究。類器官作為一種在體外由全能/多能干細胞培養(yǎng)的三維細胞組織，具有相應(yīng)體內(nèi)器官的主要特征和一定的功能，其為探索形態(tài)素濃度梯度在胚胎發(fā)育中的作用提供了理想的體外模型。2019 年，LORENZ 實驗室通過模擬Shh 信號濃度梯度，成功誘導(dǎo)產(chǎn)生了多種前腦細胞類型，這些細胞具有與體內(nèi)前腦圖式類似的空間分布，在一定程度上形成了前腦的背-腹和前-后圖式[8]，為探究前腦發(fā)育提供了優(yōu)秀的體外模型。

在本綜述中，我們主要從BMP和Shh配體的產(chǎn)生及濃度梯度的形成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞應(yīng)答、圖式建成的調(diào)控機制這3 部分出發(fā)，討論BMP 和Shh 信號作為形態(tài)素在脊椎動物神經(jīng)管發(fā)育中的作用。盡管這3 部分在神經(jīng)管發(fā)育過程中緊密相連，不能單獨考慮，但我們希望這種劃分能夠為脊椎動物神經(jīng)管發(fā)育中BMP 和Shh 信號的系統(tǒng)研究提供方便的框架。同時，我們也總結(jié)了近年來利用形態(tài)素構(gòu)建神經(jīng)管類器官的一些研究工作。

1 神經(jīng)管發(fā)育中BMP 信號和Shh 信號反向平行濃度梯度的形成

神經(jīng)管來源于早期胚胎的神經(jīng)板或神經(jīng)上皮。在胚胎發(fā)育的原腸胚階段，BMP配體濃度梯度呈現(xiàn)為腹側(cè)較高而背側(cè)較低。這種從腹側(cè)至背側(cè)的BMP 濃度梯度的建立依賴于胚胎中表達于背側(cè)的BMP 抑制蛋白的作用，主要為背組織者（dorsal organizer）分泌的Noggin[9]、Chordin[10]和Follistatin[11]等。背側(cè)BMP 信號的抑制使得神經(jīng)外胚層從原始外胚層中特化產(chǎn)生[12]，然后在原腸運動過程中細胞向背中線匯聚，導(dǎo)致外胚層增厚并產(chǎn)生神經(jīng)管的前體——神經(jīng)板，隨后神經(jīng)板通過稱為神經(jīng)發(fā)生（neurulation）的形態(tài)重塑過程形成神經(jīng)管。

脊椎動物中兩棲類、鳥類和哺乳類等的神經(jīng)管形成方式可分為2 種類型：一種是初級神經(jīng)發(fā)生（primary neurulation），產(chǎn)生體軸前部的神經(jīng)管，在未來發(fā)育為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腦；另一種是次級神經(jīng)發(fā)生（secondary neurulation），作為體軸后部神經(jīng)管的形成方式，在未來發(fā)育為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脊髓[13]。

初級神經(jīng)發(fā)生包括神經(jīng)板的折疊以及在中線處的融合（圖2A～C，H）。神經(jīng)板在原腸運動的匯聚作用下彎曲折疊形成神經(jīng)褶（neural fold）[13]，這種形態(tài)的發(fā)生依賴于神經(jīng)板上的特殊結(jié)構(gòu)——鉸鏈點：一種是中線鉸鏈點（median hinge point,MHP），位于神經(jīng)板的腹側(cè)中線，是存在于底板的一組特定細胞，可使神經(jīng)板從中線處彎曲而產(chǎn)生具有V 形橫截面的神經(jīng)溝（neural groove）；另一種是成對的背外側(cè)鉸鏈點（dorsolateral hinge point, DLHP），位于神經(jīng)板兩側(cè)，依賴于DLHPs的折疊，神經(jīng)板形成縱向溝，且神經(jīng)板兩側(cè)末端在背中線處彼此相對。隨后，神經(jīng)褶的邊緣在中線處匯合并融合，形成封閉的中空神經(jīng)管[13]。

次級神經(jīng)發(fā)生形成未來中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脊柱尾部到骶骨中部的部分（圖2A，D，E，H）。次級神經(jīng)發(fā)生與初級神經(jīng)發(fā)生差異較大，前者不是通過神經(jīng)板折疊的方式形成，而是神經(jīng)板細胞在原腸運動的匯聚作用下向中間聚集，并排列成與初級神經(jīng)管相連的實心柱狀結(jié)構(gòu)——髓索，而與初級神經(jīng)管相連的中央管腔的形成依賴于髓索中多個小腔的進一步擴大和隨后的融合[13]。

然而，在斑馬魚等硬骨魚（teleost fish）中，其神經(jīng)管的形成不同于上述2 種神經(jīng)發(fā)生方式，而是采用一種類似于次級神經(jīng)發(fā)生的方式（圖2A，F(xiàn)～H）。首先，神經(jīng)板細胞在原腸運動的匯聚作用下向背中線聚集并內(nèi)化，形成實心的神經(jīng)龍骨（neural keel）。然后，神經(jīng)龍骨進一步發(fā)育為堅固的神經(jīng)條（neural rod）；而神經(jīng)管中央空腔的形成依賴于神經(jīng)條中線兩側(cè)的神經(jīng)管細胞頂端特化以及隨后沿著中線的對稱分裂。最后，神經(jīng)管前部發(fā)育為腦，后部發(fā)育為脊髓，從而形成完整的中樞神經(jīng)系統(tǒng)[14]。

圖2 神經(jīng)管的形成過程Fig.2 Formation process of neural tube

這3種神經(jīng)發(fā)生方式最初都是由原腸胚時期的匯聚延伸運動驅(qū)動的。在這種強烈的細胞遷移過程中，最初胚胎中從腹側(cè)到背側(cè)（從高到低）的BMP濃度梯度轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)管中從背側(cè)到腹側(cè)（從高到低）的濃度梯度[13-14]（圖3）。而在神經(jīng)管形成過程中，Shh從腹側(cè)脊索中分泌出來并擴散，建立了神經(jīng)管中從腹側(cè)至背側(cè)的濃度梯度。BMP和Shh這2種形態(tài)素在神經(jīng)管中形成了反向平行的濃度梯度，并進一步對神經(jīng)管的背-腹圖式進行誘導(dǎo)。在神經(jīng)管形成之后，頂板和底板作為神經(jīng)管中新的信號源，分泌形態(tài)素并維持其濃度梯度，沿著背-腹軸將神經(jīng)祖細胞誘導(dǎo)劃分為11個區(qū)域（圖1），包括6個背側(cè)祖細胞域（dP1～dP6）和5 個腹側(cè)祖細胞域（p0～p3和pMN），且分別進一步分化為相應(yīng)的背側(cè)中間神經(jīng)元群（dI1～dI6）和腹側(cè)中間神經(jīng)元群（v0～v3 和MN）[15]。

圖3 斑馬魚早期發(fā)育中BMP濃度梯度轉(zhuǎn)換過程Fig.3 BMP concentration gradient shifting process during the zebrafish early development

2 BMP 信號與神經(jīng)管背側(cè)細胞命運

BMP 是轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）家族的成員之一，在胚胎發(fā)育（如細胞增殖、分化和遷移等過程）中起著重要作用[16]。有關(guān)證據(jù)表明，BMP信號參與了從神經(jīng)外胚層產(chǎn)生階段開始的整個神經(jīng)管的形成過程，以及對神經(jīng)祖細胞和下級神經(jīng)元的分化和空間排布的調(diào)控[17]。以下部分將重點總結(jié)BMP 信號在脊椎動物神經(jīng)管圖式形成中的作用及調(diào)控機制。

2.1 BMP 信號的產(chǎn)生

在神經(jīng)管中，BMP配體由位于神經(jīng)管背中線的頂板分泌產(chǎn)生，并通過擴散形成濃度梯度。頂板作為BMP配體的信號源，形成于神經(jīng)板的折疊閉合過程。隨著神經(jīng)板的折疊，神經(jīng)板邊界（神經(jīng)外胚層和非神經(jīng)外胚層之間的較寬區(qū)域）移動到神經(jīng)管的背側(cè)[18]（圖4），同時，頂板祖細胞也向神經(jīng)板邊界遷移，到達未來神經(jīng)管最背側(cè)中線位置。神經(jīng)板邊界具有較高水平的BMP 活性[19]，在這種細胞運動中，頂板祖細胞暴露于活性水平更高的BMP信號中，從而分化為成熟的頂板細胞[18,20]。較高濃度的BMP信號誘導(dǎo)頂板細胞表達Hairy 1蛋白，該蛋白可以通過抑制Foxd3（神經(jīng)嵴細胞標記物）的表達來鞏固頂板的細胞命運，促進其退出細胞周期和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[18,20]。

圖4 神經(jīng)管頂板的形成過程Fig.4 Formation process of roof plate in neural tube

2.2 BMP 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞應(yīng)答

2.2.1 BMP 配體

在BMP 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，BMP 配體通過二硫鍵之間的共價鍵連接，以二聚體的形式發(fā)揮作用[21]（圖5）。細胞培養(yǎng)實驗表明，BMP 的異二聚體比同二聚體具有更高的活性[22]。同時，分子遺傳學(xué)研究表明，斑馬魚胚胎中同時存在BMP同二聚體和異二聚體，但只有Bmp2b/Bmp7a 異二聚體可以磷酸化TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵信使Smad1/5[22]。并且Bmp2b/Bmp7a 異二聚體可以通過與Alk3/6 和Alk2形成復(fù)合物來參與神經(jīng)管背-腹圖式的形成。

2.2.2 BMP 受體復(fù)合物

BMP 信號由胞外向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴于細胞膜上的Ⅰ型和Ⅱ型受體復(fù)合物[23]，這2 種類型的受體都包含作為配體結(jié)合位點的細胞外結(jié)構(gòu)域和具有絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine kinase,STK）活性的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在與BMP配體結(jié)合后，Ⅱ型受體會磷酸化Ⅰ型受體[23]，而磷酸化的Ⅰ型受體可以激活細胞內(nèi)的下游介體[16]（圖5）。

圖5 BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)Fig.5 BMP signaling transduction

目前，已經(jīng)鑒定出6種不同的BMP信號通路受體，包括Ⅰ型受體BmprⅠ（BmprⅠa 或BmprⅠb）和ActRⅠA，Ⅱ型受體BmprⅡ和ActRⅡ（ActRⅡA 或ActRⅡB）[24]。研究表明，在神經(jīng)管發(fā)育中主要的功能性BMP受體復(fù)合物是BmprⅡ/BmprⅠ，在BmprⅠ突變體小鼠中存在dP1祖細胞域的缺失及dP2祖細胞域的明顯減少[25]，而過表達BmprⅠ則會導(dǎo)致雞或小鼠背側(cè)和中部神經(jīng)元命運的增加及腹側(cè)神經(jīng)元命運的減少[26-27]。

2.2.3 Smads 蛋白

Smads蛋白作為BMP信號通路中的胞內(nèi)組分，參與BMP 信號的胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。目前，已經(jīng)鑒定出的Smads蛋白共有3種，包括激活受體的Smads（receptor activated Smads,R-Smads）、抑制性Smads（inhibitory Smads,I-Smads）和輔助型Smads（common mediator Smads,Co-Smads）[23]。

R-Smads 蛋白作為胞內(nèi)介體，負責進行細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，具有2 個結(jié)構(gòu)域：N 端的MH1 結(jié)構(gòu)域和C 端的MH2 結(jié)構(gòu)域。作為R-Smads 在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中行使功能的核心，這2 個結(jié)構(gòu)域都非常保守。其中，MH1 結(jié)構(gòu)域具有DNA 和蛋白質(zhì)結(jié)合功能，MH2 結(jié)構(gòu)域具有受體識別功能并能夠被Ⅰ型受體磷酸化，從而協(xié)助Smads 復(fù)合物入核[16]。當RSmads 蛋白的C 端被磷酸化后，MH1-MH2 自抑制結(jié)構(gòu)被破壞，暴露出核定位序列，隨后與Co-Smad4結(jié)合并作為復(fù)合物遷移到核中，從而調(diào)控下游基因的表達[16]（圖5）。

特定于BMP信號通路的R-Smads包括Smad1、Smad5 和Smad8[28]。有實驗發(fā)現(xiàn)，不同的R-Smads在神經(jīng)管圖式形成中具有不同的功能。在雞胚胎中敲低Smad1 或Smad5 可以減少dI1～dI6 中間神經(jīng)元的命運，其中最為明顯的是dI1、dI3和dI5中間神經(jīng)元[2]，而使用短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA,shRNA）敲降雞胚胎中的Smad8 僅能減少dI1 中間神經(jīng)元的命運[28]。在小鼠的功能喪失實驗中，背部神經(jīng)元命運需要Smad5，而Smad1 在dI1 軸突生長中起重要作用[28]。

I-Smads 在BMP 信號通路中起負調(diào)控作用[29]（圖5），已被鑒定出的I-Smads包括Smad6和Smad7。Smad6 被發(fā)現(xiàn)是幾乎在所有脊椎動物中保守的I-Smads，能夠競爭性地與磷酸化R-Smads結(jié)合，從而阻止其與Co-Smad4形成復(fù)合物。而Smad7能夠通過與R-Smads競爭來激活BmprⅠ，從而抑制BMP信號向胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。同時，Smad6 和Smad7 都可以與Smuf1 綴合以促進BMP 受體的降解[29]。實驗發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)管的不同神經(jīng)元中表達的不同的I-Smad 似乎具有不同的功能：在雞神經(jīng)管發(fā)育過程中，Smad7在脊髓中部新分化的神經(jīng)元中高表達，而Smad6在脊髓背部和中部的成熟神經(jīng)元中高表達；在背側(cè)激活Smad7能夠抑制dI1和dI3中間神經(jīng)元的分化，而Smad6的異位表達能夠?qū)е耫I1軸突生長的缺陷[30]。

對于Co-Smads 在神經(jīng)管發(fā)育方面的研究非常有限，僅有實驗表明，通過小干擾RNA（small interfering RNA, siRNA）敲降雛雞中的Smad4 會導(dǎo)致dI1和dI3中間神經(jīng)元的缺失[6]。

2.3 BMP 調(diào)控背-腹圖式形成的機制

2.3.1 BMP 濃度梯度模型

關(guān)于BMP 信號調(diào)控神經(jīng)祖細胞產(chǎn)生具有空間性的命運決定和排布的機制，最被認可的觀點是BMP作為一種形態(tài)素，其濃度梯度會影響背側(cè)神經(jīng)祖細胞命運的決定并調(diào)控3 種感覺神經(jīng)元（dI1、dI2和dI3）的分化[4]。

在BMP 濃度梯度模型中，高水平的BMP 活性有利于背側(cè)神經(jīng)祖細胞命運的產(chǎn)生，而低水平的BMP活性則有利于靠近腹側(cè)的神經(jīng)祖細胞的命運決定。2002年，NISWANDER實驗室的體內(nèi)功能獲得性實驗結(jié)果支持了這一模型，他們在實驗中成功利用不同濃度的BMP 信號分別誘導(dǎo)了dI1、dI2 和dI3神經(jīng)元的產(chǎn)生[27]。大量實驗結(jié)果也表明，正確的BMP濃度梯度是維持神經(jīng)管背側(cè)和腹側(cè)神經(jīng)元之間的平衡所必需的。在雛雞或小鼠胚胎中過表達BmprⅠa和BmprⅠb會導(dǎo)致背側(cè)和中間區(qū)域神經(jīng)元數(shù)量的增加及腹側(cè)神經(jīng)元的缺失[26-27]，而BmprⅠa 和BmprⅠb 的缺失則會導(dǎo)致背側(cè)dI1 中間神經(jīng)元的完全喪失及dI3 和dI4 中間神經(jīng)元的增加[25]。Noggin作為BMP信號通路的抑制基因，能夠在胞外競爭性地結(jié)合BMP 配體。Noggin的過表達會導(dǎo)致dI1 中間神經(jīng)元的缺失和dI2～dI4 中間神經(jīng)元的增加[6]。Follistatin作為另一種BMP 信號通路的抑制基因，其過表達能夠?qū)е耫P1～dP3 祖細胞域命運的減少[31]。Bmp4/7 或激活的BmprⅠ轉(zhuǎn)基因過表達則會導(dǎo)致dI1中間神經(jīng)元的增加[7]。

2.3.2 BMP 配體誘導(dǎo)模型

不同物種中參與神經(jīng)管背-腹圖式形成的BMP配體是不同的，并且有實驗發(fā)現(xiàn)，在雞的神經(jīng)組織外植體中，BMP4 轉(zhuǎn)染的COS 細胞能夠誘導(dǎo)dI1 神經(jīng)元命運的產(chǎn)生，而用稀釋的BMP4 條件培養(yǎng)基處理卻不能有效地誘導(dǎo)dI3神經(jīng)元的命運[32-33]，表明低濃度的BMP4可能無法誘導(dǎo)dI3神經(jīng)元。因此，研究人員提出了BMP配體誘導(dǎo)模型來解釋神經(jīng)管背-腹圖式的形成。該模型認為不同的BMP 配體參與誘導(dǎo)不同神經(jīng)祖細胞域的產(chǎn)生和空間排布，如BMP4和BMP7 在雞神經(jīng)管發(fā)育中發(fā)揮作用，而在小鼠神經(jīng)管發(fā)育中則是BMP5、BMP6 和BMP7 發(fā)揮作用[32-33]。同樣，在雞胚胎中敲低BMP4僅導(dǎo)致dI1 神經(jīng)元的減少，而敲除BMP7則明顯減少了dI1、dI3和dI5 神經(jīng)元的數(shù)量[17,34]。該機制可以通過顯性負型Ⅰ型BMP受體實驗來解釋：通過電轉(zhuǎn)激酶結(jié)構(gòu)域截斷形式的BmprⅠ發(fā)現(xiàn)，不同的BMP 配體可以激活不同的Ⅰ型受體并調(diào)節(jié)細胞周期，從而參與神經(jīng)元分化的調(diào)控。小鼠中BMP6和雛雞中BMP7誘導(dǎo)頂板的形成均是通過BmprⅠa發(fā)揮作用。在小鼠和雛雞中，dP1 祖細胞都由BMP4 和BMP7 通過BmprⅠa或BmprⅠb 誘導(dǎo)，而dI1 神經(jīng)元則只能由BMP4 誘導(dǎo)。雛雞中dI2神經(jīng)元只能由BMP4誘導(dǎo)，而dI3神經(jīng)元可以由所有BMP配體誘導(dǎo)，但dI4～dI6在任何BMP配體作用下都未能被誘導(dǎo)，說明可能存在其他機制來誘導(dǎo)偏向于神經(jīng)管中部的神經(jīng)元命運[33]。

2.3.3 時間形態(tài)素誘導(dǎo)模型

一些研究發(fā)現(xiàn)，對于神經(jīng)管這樣一個復(fù)雜的三維組織，不僅BMP 信號的空間分布參與背-腹圖式的形成，靶細胞在信號中的暴露時間也參與細胞命運的調(diào)節(jié)。在雛雞神經(jīng)板外植體誘導(dǎo)實驗中，長時間的Bmp4信號暴露會導(dǎo)致較多的背祖細胞命運的產(chǎn)生，而在體內(nèi)，在不同階段抑制BMP 信號會導(dǎo)致不同的缺陷表型，早期抑制BMP 信號會導(dǎo)致整個dI1～dI3 神經(jīng)元的缺失，而后期抑制則能夠依次產(chǎn)生dI3和dI2神經(jīng)元[35]。

3 Shh 信號與神經(jīng)管腹側(cè)細胞命運

Shh 是經(jīng)典刺猬（hedgehog）信號中最重要的糖蛋白之一，在脊椎動物肢體、神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸道及心臟等各種重要系統(tǒng)、器官的發(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用。此外，相關(guān)研究表明，Shh的激活也參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移以及血管的生成和存活[36]。在本綜述中，總結(jié)了Shh在脊椎動物神經(jīng)管發(fā)育中的作用及調(diào)控機制。

3.1 神經(jīng)管中Shh 蛋白的表達

在脊椎動物神經(jīng)管發(fā)育過程中，Shh 蛋白由位于神經(jīng)管腹側(cè)的脊索和底板分泌產(chǎn)生[37]。在原腸胚時期，Shh在中胚層處表達，隨著中線處中胚層形成實心棒狀的脊索，Shh 開始在脊索中表達[37]。在羊膜動物中，由脊索分泌的Shh 在神經(jīng)管中誘導(dǎo)了底板的形成，且其是Shh 產(chǎn)生和分泌的第2 個中心[37]。然而在其他脊椎動物中，底板的形成機制似乎與脊索衍生的Shh信號的相關(guān)性較小[38]。

3.2 Shh 濃度梯度的形成

與其他形態(tài)素相似，Shh 信號濃度梯度的形成涉及3 個主要問題：1）如何以活性形式產(chǎn)生和分泌Shh 配體；2）Shh 配體如何在組織中擴散；3）過量的Shh 如何降解并從組織中去除。其中，每個過程都有特定的分子途徑進行精確調(diào)控，并構(gòu)成了復(fù)雜的Shh濃度梯度形成和維持系統(tǒng)。

3.2.1 Shh 的產(chǎn)生和擴散受脂化作用的影響

活性Shh 配體的產(chǎn)生是一個復(fù)雜的過程。Shh蛋白最初在分泌細胞中被翻譯成45 kDa 的Shh 前體，隨后經(jīng)過蛋白酶的水解作用產(chǎn)生2個較短的肽，即19 kDa的N端區(qū)域（Shh-N）和26 kDa的C端區(qū)域（Shh-C）（圖6），抑制這種蛋白酶水解切割能夠使Shh信號失活[39]。在水解切割過程中，羧基末端會連接膽固醇，這是Shh-N的分泌、遷移和膜插入所必需的[39]，缺乏膽固醇修飾的Shh會更快地在組織中擴散和滲透[40]。水解切割之后，Shh-N與Shh-C分離，?；D(zhuǎn)移酶Skn會催化棕櫚酰基與Shh-N的N末端結(jié)合[39]，從而增強Shh信號的誘導(dǎo)能力[41]。非棕櫚?；问降腟hh活性較低[41]，同時，這種修飾對于脊椎動物神經(jīng)管的發(fā)育是必需的，因為Skn－/－小鼠胚胎表現(xiàn)出與Skn－/－小鼠相似的畸形——神經(jīng)管中存在嚴重的背-腹圖式混亂[41-42]。Shh的雙重脂化作用（圖6）確保了其在脊椎動物神經(jīng)管發(fā)育過程中的擴散性和對遠距離信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的活性[40-41]，為誘導(dǎo)神經(jīng)管腹側(cè)細胞圖式提供了支持。

3.2.2 Shh 的分泌依賴Disp1 跨膜蛋白的協(xié)助

脊索和底板細胞中活性Shh配體的分泌需要跨膜蛋白Disp1的協(xié)助（圖6）。Disp1上存在固醇感應(yīng)結(jié)構(gòu)域（sterol-sensing domain,SSD），可以識別膽固醇修飾的Shh-N，從而促進其分泌以及在組織中的長距離信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[43]。在純合的Disp1突變小鼠中，神經(jīng)管的背-腹圖式，尤其是腹側(cè)部分被嚴重破壞，并且沒有檢測到呈活性狀態(tài)的Shh配體[43]。然而也有實驗檢測出存在缺乏膽固醇修飾的Shh配體的非Disp1依賴性分泌途徑[44]，對此的解釋是：Disp1可以促進具有長距離和高活性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的活性Shh的組裝，而在短距離信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中，非Disp1依賴的途徑被激活，可調(diào)控神經(jīng)管腹側(cè)部分高濃度的Shh信號[40]。

3.2.3 硫酸乙酰肝素蛋白聚糖協(xié)助Shh 擴散

Shh沿著神經(jīng)管背-腹軸的擴散受幾種細胞外蛋白的調(diào)節(jié)，這些蛋白可以與Shh配體結(jié)合，從而限制雙脂質(zhì)修飾的Shh-N 的擴散，并改變其降解速率。硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycan,HSPG）是細胞外基質(zhì)的一種保守成分，被認為是調(diào)控Shh 擴散的胞外蛋白[45]。功能性HSPG 的形成依賴于由多種催化酶驅(qū)動的復(fù)雜翻譯后修飾過程，硫酸酯酶1作為催化過程中的關(guān)鍵酶，能夠催化HSPG的硫酸化，具有與高濃度的Shh蛋白和Nkx2.2（脊椎動物腹側(cè)神經(jīng)管中的保守標記基因）相同的表達模式[45]。

3.2.4 神經(jīng)祖細胞上的膜蛋白協(xié)助Shh 濃度梯度的建立

在Shh 從神經(jīng)管腹側(cè)擴散到背側(cè)的過程中，其與幾種跨膜蛋白之間的相互作用被認為是協(xié)助其濃度梯度形成的不可忽略的因素（圖6）。根據(jù)這些跨膜蛋白對Shh 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，可將其分為2 種類型：1）抑制性蛋白，包括Patch1 和Hhip1；2）促進性蛋白，包括Cdo、Boc（Cdo的同族）和Gas1[46-48]。

Patch1 在神經(jīng)祖細胞膜上表達，是Shh 蛋白的受體，可通過螯合配體和促進配體降解的方式引起Shh信號的細胞自主性抑制[49]。隨著Shh蛋白在組織中的擴散，螯合作用會逐漸降低Shh配體的利用率，導(dǎo)致受體細胞接收到的Shh配體減少，從而使其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能力減弱[49]。當這些由Patch1 和Hhip1 介導(dǎo)的配體依賴性拮抗作用（ligand-dependent antagonism,LDA）被阻斷時，呈現(xiàn)出p0～p2 神經(jīng)祖細胞的缺失及p3 和pMN 神經(jīng)祖細胞的增加[49]。在Shh 配體擴散過程中，內(nèi)吞作用和降解作用在遠離信號源的區(qū)域中增強，減弱了Shh信號的相對強度，與螯合作用一起維持Shh的濃度梯度[50]。

上述Shh信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)和濃度梯度形成的調(diào)控機制都是通過細胞自主途徑進行的。然而，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Hhip1 存在通過硫酸乙酰肝素相互作用對Shh 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進行調(diào)控的非細胞自主抑制途徑[51]。這一發(fā)現(xiàn)表明，盡管Shh 在胚胎發(fā)育過程中的作用機制已被很好地理解，但仍可能存在其他調(diào)節(jié)Shh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的新機制。

針對作用于Shh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的3種促進性蛋白Cdo、Boc和Gas1，它們能夠促進腹側(cè)細胞命運的決定，協(xié)助Shh 對腹側(cè)細胞圖式形成的調(diào)控。Cdo最初是在神經(jīng)管的腹側(cè)中線外表達，并與底板特化有關(guān)，敲除小鼠的Cdo基因會導(dǎo)致底板細胞減少[48]。而Gas1基因的缺失會導(dǎo)致胚胎的神經(jīng)管腹側(cè)細胞圖式的缺陷，并且這種缺陷在敲除Shh的胚胎中更為嚴重[47]。此外，Gas1－/－和Cdo－/－雙突變小鼠胚胎的底板、p3或pMN祖細胞域的缺失表明這2種蛋白對神經(jīng)管發(fā)育具有協(xié)同作用[47]。Cdo、Boc和Gas1基因突變小鼠已經(jīng)證實了這3種膜蛋白在神經(jīng)管腹側(cè)細胞圖式形成中的必要性[46-48]，并表明這3種蛋白可能在功能上存在相互補償作用[47-48]。同時，這3種蛋白的表達均受到Shh 信號的抑制作用，表明存在Shh信號的負反饋調(diào)節(jié)來為局部Shh濃度的波動提供補償機制，從而為形成和維持腹-背濃度梯度提供了一定程度的穩(wěn)定作用。此外，還發(fā)現(xiàn)了一些分子（如Scube2）參與調(diào)節(jié)Shh的擴散以及濃度梯度的形成[52]，但關(guān)于其功能的研究仍然有限。一個非常有趣的發(fā)現(xiàn)是，Scube2 可以在Shh 分泌細胞的細胞膜上與硫酸乙酰肝素形成釋放復(fù)合物，以協(xié)助Shh的分泌[52]。

由于有關(guān)Shh結(jié)合伴侶及其相應(yīng)機制的大量研究都是基于腫瘤模型，因此，后續(xù)應(yīng)更關(guān)注在神經(jīng)管器官發(fā)生中驗證Shh 信號的這些已知結(jié)論，以對Shh 信號進行更全面的探究。此外，動物模型實驗和數(shù)學(xué)建模的結(jié)合將有助于對Shh濃度梯度的形成過程進行更好地概括。

3.3 Shh 信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞應(yīng)答

當Shh信號在神經(jīng)管中形成從腹側(cè)到背側(cè)的濃度梯度后，神經(jīng)前體細胞可以感知并響應(yīng)Shh信號，從而產(chǎn)生整齊排列的腹側(cè)細胞圖式。其中，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞應(yīng)答的誘導(dǎo)是一個高度調(diào)節(jié)的過程，Shh配體的濃度和持續(xù)時間都可以參與神經(jīng)前體細胞命運的調(diào)控。

3.3.1 細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的開關(guān)——Smo 蛋白

在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的開始，胞外Shh 配體能夠與受體細胞上的跨膜蛋白Patch1 結(jié)合，從而解除對另一個跨膜蛋白Smo 的抑制作用[53]。隨后，Smo 的激活將細胞外Shh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程與其細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活聯(lián)系起來（圖6）。Smo激動劑和拮抗劑在神經(jīng)細胞中的協(xié)同應(yīng)用表明，Smo 的逐級激活（階梯式）而不是漸進激活（連續(xù)式）可能是細胞對Shh 濃度梯度響應(yīng)的重要機制[5]。

在脊椎動物中，纖毛對Shh細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具有重要作用[54]。在沒有Shh信號的情況下，位于纖毛底部的Patch1受體會抑制Smo向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，從而阻止下游信號激活。而當活性Shh配體與Patch1結(jié)合后，Patch1 會發(fā)生內(nèi)化和降解，從而解除對Smo 的抑制作用，并進一步在初級纖毛膜上積聚更多的Smo[54]。

為了更好地理解Shh的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，仍需要對Smo激活后的下游機制做更多的研究。在過去的20年中，已經(jīng)確定了位于Smo下游的幾個關(guān)鍵成分[54]。Cos2（Costal 2）是果蠅中一種與微管相關(guān)的驅(qū)動蛋白樣蛋白，可以直接與Smo的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相互作用[55]，在沒有Shh信號的情況下，Cos2可以阻斷Smo 下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，Cos2 還可以激活Gli（glioma-associated oncogene）家族鋅指蛋白直系同源物Ci（cubitus interruptus），這是Shh轉(zhuǎn)錄激活功能所需的細胞質(zhì)鋅指蛋白[56]。但是，脊椎動物中的2 個Cos2直系同源基因Kif和Kif27似乎并不參與Shh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在哺乳動物細胞中使用shRNA進行的敲低實驗進一步支持了這種差異[57]，表明哺乳動物中Cos2相關(guān)蛋白的功能與Shh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)無關(guān)，這可能是因為脊椎動物的Smo含有與果蠅的Smo截然不同的Cos2相互作用的結(jié)構(gòu)域。然而，在某些脊椎動物（如斑馬魚）中，通過對反義嗎啉代（morpholino）寡核苷酸介導(dǎo)的Kif7（Cos2直系同源物）的敲低實驗發(fā)現(xiàn)，Kif7-KD魚系與野生型斑馬魚之間存在一定差異[58]。類似地，當通過抑制Gli 入核及調(diào)節(jié)基因表達時，Sufu（suppressor of fused）可以與Cos2 一起發(fā)揮作用，進一步抑制下游信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[59]。

3.3.2 分級Gli 活性介導(dǎo)分級Shh 信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)

Shh信號通過Smo在細胞內(nèi)進行轉(zhuǎn)導(dǎo)后，能夠催化不同類型的Gli作為轉(zhuǎn)錄因子進入細胞核并調(diào)節(jié)基因表達，以實現(xiàn)Shh信號對細胞命運的調(diào)控作用[56]（圖6）。在脊椎動物中，介導(dǎo)Shh 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的Gli 有3種（Gli1～Gli3）[60-61]：Gli1為依賴于Shh信號的促進型轉(zhuǎn)錄因子；Gli3能夠抑制Shh信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)和相關(guān)基因的表達；與Gli1和Gli3不同，Gli2具有強大的基因激活和抑制功能，作為促進型轉(zhuǎn)錄因子，Gli2能夠被催化成抑制形式，但其阻遏物活性不受Shh的調(diào)節(jié)，從而具有獨立的抑制Shh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力[60]。目前的實驗表明，Gli2 在神經(jīng)管中的主要作用是激活性的，在Gli2－/－小鼠胚胎中，神經(jīng)管腹側(cè)，尤其是底板中的細胞類型受到嚴重破壞[61]。Gli3 在Shh 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起劑量依賴性的轉(zhuǎn)錄抑制子的作用，在Gli3突變體小鼠中觀察到神經(jīng)管細胞強烈的腹側(cè)化表型，這支持了Gli3對Shh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具有抑制作用的結(jié)論[62]。

圖6 Shh信號的產(chǎn)生、分泌和轉(zhuǎn)導(dǎo)Fig.6 Production,secretion and transduction of Shh signaling

在Shh 配體濃度梯度作用下，在神經(jīng)管中也誘導(dǎo)出了相似的Gli濃度梯度[63]，這種濃度梯度對于腹側(cè)細胞圖式的產(chǎn)生是必需的。功能獲得實驗進一步支持了這一結(jié)論，該實驗通過逐漸改變Gli 的活性成功地重現(xiàn)了部分背-腹圖式[64]。

3.3.3 Shh 信號的時間調(diào)控機制

與BMP相似，神經(jīng)管腹側(cè)圖式的精確形成不僅取決于Shh 的濃度梯度，還與細胞暴露于Shh 配體的階段和持續(xù)時間有關(guān)[5,49,64]。2007 年，DESSAUD等[5]提出了Shh調(diào)控神經(jīng)管背-腹圖式形成的時間模型，該模型結(jié)合了Shh 信號的濃度作用和持續(xù)時間作用，認為受體細胞的敏感性將經(jīng)歷逐漸降低的過程。最初，由于細胞對Shh配體具有高敏感度，所以較低的Shh濃度即可激活足夠水平的Gli活性，以用于調(diào)控基因表達和細胞命運決定。而隨著神經(jīng)管的發(fā)育，脫敏的神經(jīng)祖細胞在與初始階段相同的Shh濃度作用下只能誘導(dǎo)較低的細胞反應(yīng)。在這種機制的作用下，相同濃度的Shh 信號實現(xiàn)了在不同的發(fā)育階段誘導(dǎo)出不同細胞命運的能力[65]。該模型和脫敏假設(shè)獲得了Patch1 響應(yīng)實驗的支持：在Shh的誘導(dǎo)下，反應(yīng)細胞傾向于表達更多的抑制性蛋白，如Patch1[66]，而為了補償這些抑制性相互作用以實現(xiàn)正常的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞反應(yīng)，就需要更高濃度的Shh配體[5]。

4 神經(jīng)管類器官的研究與應(yīng)用現(xiàn)狀

類器官是在體外構(gòu)建的含有多種器官特異性細胞類型的自組織結(jié)構(gòu)，并具有相應(yīng)器官的特定功能。近年來，類器官技術(shù)發(fā)展迅速，已成為研究器官發(fā)育、信號調(diào)控和疾病發(fā)生的重要手段。類器官通常由胚胎干細胞、器官祖細胞或誘導(dǎo)性多能干細胞組織并分化而成。目前比較成熟的類型包括腦、腸、肝、胰和上皮類器官等，已廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)探索和疾病研究。

近年來，神經(jīng)系統(tǒng)類器官廣泛發(fā)展，并被應(yīng)用于神經(jīng)發(fā)生和疾病方面的研究。2013 年建立的利用hPSC 誘導(dǎo)神經(jīng)類器官的培養(yǎng)系統(tǒng)，部分真實地再現(xiàn)了人類大腦的發(fā)育和組織過程[67]，同時，該培養(yǎng)系統(tǒng)將神經(jīng)系統(tǒng)類器官從傳統(tǒng)的二維組織培養(yǎng)體系轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)雜的三維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，實現(xiàn)了對體內(nèi)環(huán)境的較好模擬。其他培養(yǎng)方式包括培養(yǎng)具有早期神經(jīng)命運的類器官球、無血清培養(yǎng)的類胚體樣聚集體（SFEBq）等，以及LANCASTER 實驗室構(gòu)建的最新的腦類器官培養(yǎng)體系及其進一步的改進，都能夠獲得極為復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，甚至是培養(yǎng)出難以通過離體獲得的星形膠質(zhì)命運的細胞[67-70]。對于神經(jīng)管這樣一個模式化且復(fù)雜的重要結(jié)構(gòu)，其類器官的培養(yǎng)經(jīng)歷了不斷發(fā)展的過程，然而培養(yǎng)出能夠重現(xiàn)體內(nèi)類似的細胞空間分布（每種細胞類型和細胞外基質(zhì)沿著3個體軸位于其對應(yīng)的位置處）的類器官已成為目前整個類器官技術(shù)發(fā)展所面臨的棘手挑戰(zhàn)。

2013年初，SASAI提出了一個想法：為通過細胞自組織培養(yǎng)的三維類器官提供與在胚胎發(fā)育過程中位置和濃度相同的形態(tài)素，以誘導(dǎo)具有更高體內(nèi)類似性的類器官模型[71]。令人高興的是，近年來，對形態(tài)素濃度梯度的深入研究和先進生物工程技術(shù)的發(fā)展，為克服這一挑戰(zhàn)提供了樂觀的前景。例如：將含有不同濃度形態(tài)素的微珠遞送至特定區(qū)域來實現(xiàn)在單細胞水平上誘導(dǎo)不對稱的干細胞分裂[72]，或是利用微流體裝置在類器官中產(chǎn)生時空可調(diào)節(jié)的形態(tài)素濃度梯度，以及通過模擬Shh和BMP的反平行濃度梯度和其他2個相關(guān)信號（Wnt和視黃酸）的轉(zhuǎn)導(dǎo)，以在小鼠胚胎干細胞的不同區(qū)域誘導(dǎo)不同類型的神經(jīng)細胞命運[73]。這些技術(shù)為人們以正確的方式誘導(dǎo)特定細胞的自組織提供了足夠的信心。除了利用這些技術(shù)，最近，CEDERQUIST 等使用能夠誘導(dǎo)表達Shh的轉(zhuǎn)基因hPSC模擬信號源，利用產(chǎn)生并擴散的Shh 在類器官中形成了適當?shù)臐舛忍荻?，并在這種Shh 濃度梯度下成功地誘導(dǎo)了具有高度體內(nèi)相似性細胞命運和空間排布的獨特的人前腦類器官[8]（圖7）。

圖7 利用Shh濃度梯度體外指導(dǎo)前腦類器官的形成示意圖Fig.7 Schematic description of applying Shh concentration gradient to instruct forebrain organoid formation in vitro

5 小結(jié)與展望

本綜述主要總結(jié)了2 個關(guān)鍵的形態(tài)素（BMP 和Shh）在脊椎動物神經(jīng)管背-腹圖式形成過程中的作用。在神經(jīng)管形成過程中，位于神經(jīng)管最背側(cè)區(qū)域的頂板分泌的BMP 及位于腹側(cè)的脊索和底板分泌的Shh形成反平行濃度梯度，以誘導(dǎo)背-腹圖式的形成。Shh 可以通過分泌、擴散和降解的不同調(diào)控機制形成腹-背濃度梯度，而BMP 的背-腹?jié)舛忍荻鹊男纬珊途S持方式尚待確定。建立濃度梯度后，這2個形態(tài)素都可以通過時空調(diào)節(jié)機制和相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進一步調(diào)控細胞命運。近年來，越來越多的體內(nèi)研究揭示了形態(tài)素濃度梯度在器官發(fā)生中的作用，并被逐步應(yīng)用于構(gòu)建類器官的研究中。

然而，要真正通過構(gòu)建形態(tài)素濃度梯度模仿生物體發(fā)育過程并進行深入研究仍然存在一些挑戰(zhàn)。第一，基于當前的技術(shù)，在特定時間和特定位置直接測量體內(nèi)形態(tài)素的絕對濃度非常困難；第二，要在體外建立適當?shù)男螒B(tài)素濃度梯度，不僅要考慮形態(tài)素的產(chǎn)生，還要考慮其擴散和降解；第三，由自組織產(chǎn)生的極高局部濃度極大地增加了形態(tài)素濃度梯度的復(fù)雜性；第四，由于細胞圖式的產(chǎn)生不僅依賴于形態(tài)素的空間調(diào)節(jié)，還與暴露于形態(tài)素的時間相關(guān)，因此，對細胞的誘導(dǎo)時間需要精確控制；第五，對于某些形態(tài)素（如BMP），圖式的誘導(dǎo)可能依賴于由不同配體組合成的二聚體，并且對于不同的二聚體，其功能是否依賴于濃度梯度仍有待驗證。但我們相信，利用形態(tài)素濃度梯度并結(jié)合三維打印等生物工程方法是指導(dǎo)胚胎干細胞或誘導(dǎo)多能干細胞在體外產(chǎn)生具有正確結(jié)構(gòu)和功能的類器官的最有前景的策略，克服這些挑戰(zhàn)必將大力推動整個發(fā)育生物學(xué)和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展。