微流控濃度梯度芯片的開發(fā)與生物化學(xué)應(yīng)用研究

石環(huán)環(huán)，曹禺，周亞諾，萬亞茹，趙亞麗

1.南昌航空大學(xué)教育部無損檢測重點實驗室，江西南昌330000；2.南昌航空大學(xué)測試與光電工程學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系，江西南昌330000；3.長沙市第四醫(yī)院/湖南師范大學(xué)附屬長沙醫(yī)院，湖南長沙410083

前言

細(xì)胞的應(yīng)激響應(yīng)與多種生物過程緊密相關(guān)，微流控濃度梯度芯片能夠構(gòu)造與生理環(huán)境接近的、具有濃度梯度刺激源的體外微環(huán)境，進(jìn)而揭示生物體對不同生物化學(xué)刺激的響應(yīng)，探究調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為的決定因素［1-2］。微流控濃度梯度芯片由于設(shè)計靈活易于調(diào)節(jié)的特點，能夠快速制備穩(wěn)定的濃度梯度，實現(xiàn)高通量反應(yīng)。得益于濃度梯度芯片微米級的通道尺寸，能夠?qū)⑵浼傻胶袠悠非疤幚砼c檢測單元的微流控系統(tǒng)中。生物分子在體內(nèi)的濃度梯度已經(jīng)被證實在癌癥轉(zhuǎn)移、傷口愈合以及生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用［3-4］?；谖⒘骺貪舛忍荻燃靶酒?xì)胞培養(yǎng)等技術(shù)，有助于實現(xiàn)細(xì)胞水平的藥物篩選和趨化性以及毒性分析等研究。本文綜述近3年濃度梯度芯片的開發(fā)及其在生物化學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究。

1 微流控芯片中濃度梯度的形成

1.1 微流控濃度梯度芯片的出現(xiàn)

宿主防御、創(chuàng)傷愈合、胚胎發(fā)生和癌癥轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程涉及許多可擴(kuò)散化學(xué)物質(zhì)的濃度梯度［5］。濃度梯度和濃度排列在細(xì)胞生物學(xué)、趨化因子、生物化學(xué)、表面微加工等研究中的作用也日趨重要。傳統(tǒng)上，移液管、凝膠等主要用于稀釋樣品和研究細(xì)胞在濃度梯度作用下的行為。然而，這些技術(shù)在生成復(fù)雜形狀的空間穩(wěn)定梯度時并不有效［6］。因此，迫切需要一種技術(shù)來產(chǎn)生并維持可預(yù)測的長期復(fù)雜樣品濃度梯度，用于檢測樣品濃度梯度與細(xì)胞應(yīng)答之間的相關(guān)性，實現(xiàn)高通量分析（如免疫分析和酶分析）和組合化學(xué)的高效多維篩選［7］。早在2000年，Jeon等［8］提出微流控濃度梯度的概念，基于低雷諾數(shù)條件下層流擴(kuò)散混合的原理設(shè)計了經(jīng)典的“圣誕樹模型”且沿用至今，通過控制輸入流體的相對流速，梯度的形狀可以連續(xù)改變。這一技術(shù)為研究依賴濃度梯度的生物化學(xué)現(xiàn)象提供了一個新平臺［9］。近年來，包括層流擴(kuò)散的微流控網(wǎng)絡(luò)在內(nèi)的多種類型濃度梯度生成芯片被廣泛用于高通量藥物篩選［10］，化學(xué)物質(zhì)毒性分析以及趨化性研究且收獲頗豐。微流控濃度梯度芯片的主要優(yōu)勢在于能夠通過靈活的通道網(wǎng)絡(luò)設(shè)計形成不同形狀的濃度梯度，適應(yīng)需求，且能夠維持濃度梯度的穩(wěn)定。微流控濃度梯度芯片的發(fā)展歷程見圖1。

圖1 微流控濃度梯度芯片的發(fā)展歷程Fig.1 Development history of microfluidic concentration gradient chip

1.2 微流控濃度梯度芯片的開發(fā)

1.2.1 傳統(tǒng)“圣誕樹模型”的發(fā)展與改進(jìn)多數(shù)基于濃度梯度芯片的應(yīng)用仍舊沿用“圣誕樹模型”，但從芯片的設(shè)計制造方面都做出了較大的努力以更適用于特定的應(yīng)用需求。Chen等［15］采用有限元方法對雙入口及3入口的濃度梯度發(fā)生器進(jìn)行模擬，得到可控的任意近似線性曲線和任意二次方曲線的濃度分布，有助于不同生化樣本中細(xì)胞和分子的趨化性研究。類似地，Wang等［16］介紹了采用激光加工微通道的方式制備的一種聚甲基丙烯酸甲酯濃度梯度發(fā)生器，可產(chǎn)生近似線性和二次型濃度梯度曲線輸出。為了改進(jìn)“圣誕樹模型”注射泵進(jìn)液的方式，Park等［11］提出了一種通過按鈕驅(qū)動的微泵單元產(chǎn)生恒定體積的流體驅(qū)動樣本，能夠在兩種不同的樣品溶液之間產(chǎn)生6種濃度的線性梯度，該裝置不需要外部泵，更利于其與微型裝置（如96孔板）相集成，且流量可以通過手指按壓進(jìn)行調(diào)整。該裝置通過生成硝基苯磷酸底物的線性濃度梯度實現(xiàn)堿性磷酸酶的檢測。Ebadi等［17］介紹了一種名為樹狀濃度梯度發(fā)生器設(shè)計工具的軟件設(shè)計方法，這對于微加工、光刻和3D打印制造的濃度梯度芯片有很大幫助。通過改變軟件參數(shù)即可改變濃度梯度芯片輸出的濃度分布類型，且采用羅丹明-B和食用染料的梯度形成實驗驗證了軟件設(shè)計的可靠性。這對于大規(guī)模的芯片設(shè)計與制造是有益的，能夠提升高通量目標(biāo)物篩選的效率。

大多數(shù)現(xiàn)有的濃度梯度芯片只能在微米大小的尺寸中產(chǎn)生所需的濃度梯度。Rismanian等［18］將改進(jìn)的圣誕樹模型與一個微混合器相結(jié)合，設(shè)計了一種能夠在毫米大小尺寸中產(chǎn)生多種試劑（如藥物）的連續(xù)濃度梯度的芯片，實驗證明該裝置可以產(chǎn)生兩種試劑的連續(xù)濃度梯度，并將它們的所有可能的濃度組合傳遞到毫米大小的樣品。Shimizu等［19］提出了一種基于細(xì)胞外基質(zhì)的梯度發(fā)生器，構(gòu)造了具有由組織流動產(chǎn)生的連續(xù)化學(xué)濃度梯度的培養(yǎng)表面，利用3D打印水溶性犧牲模具的犧牲成型技術(shù)，快速制備了含有梯度發(fā)生器和微混合器的明膠基微通道。當(dāng)熒光染料溶液被引入通道時，微混合器增強(qiáng)了兩種溶液在連接處的混合。此外，通道中產(chǎn)生的濃度梯度通過細(xì)胞外基質(zhì)多孔性質(zhì)的間隙擴(kuò)散到器件的培養(yǎng)表面。在表面培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞對微通道間質(zhì)流產(chǎn)生的組胺濃度梯度做出了收縮反應(yīng)，這表明該裝置可以用于細(xì)胞對化學(xué)刺激反應(yīng)的基礎(chǔ)生物學(xué)研究和藥物體外實驗平臺。Hu等［20］介紹了一種低成本的類似圣誕樹模型的濃度梯度芯片，采用熱鍵合聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）技術(shù)分別制作了具有2個和3個進(jìn)口的濃度梯度發(fā)生器，該方法可以在不同流速下產(chǎn)生不同的濃度梯度，微通道的結(jié)構(gòu)設(shè)計為S形左右對稱，2進(jìn)口和3進(jìn)口濃度梯度發(fā)生器的濃度梯度分布分別呈近似線性和二次曲線。上述研究進(jìn)展表明，在經(jīng)典圣誕樹模型基礎(chǔ)上，針對具體應(yīng)用對象需要調(diào)整濃度梯度生成器的制造工藝、材質(zhì)以及尺寸等參數(shù)，以便適應(yīng)多場景的應(yīng)用需求。

為了解決濃度梯度受流速影響的問題，Hoving等［21］設(shè)計了一個改進(jìn)的圣誕樹狀微流控通道網(wǎng)絡(luò)，輸入流量可達(dá)200 μL/min，最大速度約333 mm/s，比現(xiàn)有的報道入口流速高出兩個數(shù)量級，極大地擴(kuò)展了應(yīng)用領(lǐng)域。類似地，Martin Cabaleiro等［22］報道了采用3D打印樹脂制備了類似圣誕樹濃度梯度發(fā)生器。通過限制在連續(xù)流梯度發(fā)生器下的流速，在到達(dá)下一個分叉之前在一個分支中實現(xiàn)完全混合，該濃度梯度生成器在低佩克萊特數(shù)下產(chǎn)生梯度的效果良好。此外，該濃度梯度生成器在混合前實現(xiàn)精確試劑量配比，因而生成的濃度梯度形狀與流速無關(guān)。

除了利用傳統(tǒng)的微流控芯片材料［聚二甲基硅氧烷（PDMS）、PMMA、玻璃等］，紙基微流控芯片也越來越成為研究熱點。由于梯度的動態(tài)形成是基于化學(xué)物質(zhì)在流體中的橫向擴(kuò)散，在紙通道中分子的橫向流動主要受機(jī)械擴(kuò)散控制，這與分子擴(kuò)散有本質(zhì)區(qū)別，因此，在紙上設(shè)計梯度發(fā)生器需要不同于傳統(tǒng)微流體中使用的策略。Schaumburg等［23］利用計算機(jī)模擬研究紙基微流控濃度梯度發(fā)生器的優(yōu)化設(shè)計，討論Whatman濾紙濃度梯度芯片的設(shè)計與制備，建立了二維平面紙和三維垂直紙兩種新的金字塔網(wǎng)絡(luò)模型。在紙和類似多孔基質(zhì)中適當(dāng)?shù)乩脵C(jī)械擴(kuò)散會給紙基濃度梯度芯片帶來巨大潛力。

1.2.2 新型微流控濃度梯度芯片開發(fā)經(jīng)典的“圣誕樹模型”原理簡單，因易于操作而具有廣泛應(yīng)用，然而其也存在通道冗長、梯度形成時間長、梯度易受流速影響等缺點，因此，為克服上述問題，越來越多的新型濃度梯度的設(shè)計被報道。Futai等［24］開發(fā)了一種包含窄微通道的濃度梯度生成芯片，該窄通道具有適當(dāng)?shù)牧髯?，既能滿足試驗物質(zhì)的快速引入，又能長期保持梯度。該芯片能夠保持Alexa螢石熒光染料濃度梯度至少48 h。生成和維持長期穩(wěn)定的梯度是當(dāng)前微制造系統(tǒng)的一個挑戰(zhàn)。Parittotokkaporn等［25］開發(fā)了一個簡單的流體驅(qū)動微流控系統(tǒng)，芯片采用聚二甲基硅氧烷材質(zhì)通過標(biāo)準(zhǔn)軟光刻技術(shù)制備而成，在1～10 μL/h低流量控制下產(chǎn)生熒光染料梯度，梯度在1 h內(nèi)形成，在2 h～5 d內(nèi)能夠保持穩(wěn)定。Shi等［12］通過將4組進(jìn)樣口（樣品和緩沖液）依次連接到主通道，確定進(jìn)樣口的位置和層流類型，建立濃度梯度。由于樣本比例被事先分配好，因而濃度梯度的產(chǎn)生只需要將樣本充分混合即可，而不受入口流速的影響。從主通道引出9個微混合通道，以有效地混合層流。將方波結(jié)構(gòu)與微通道側(cè)壁槽相結(jié)合，設(shè)計了一種比傳統(tǒng)蛇形混合通道混合指數(shù)更高的微混合通道。在流速為2 280 μL/min情況下，按照快速微混合原理，線性濃度梯度可在數(shù)秒內(nèi)實現(xiàn)，且梯度形狀與流速無關(guān)。

具有理想梯度的表面已被證明是一種強(qiáng)大的工具。Zhou等［13］展示了一種新型的微流控網(wǎng)絡(luò)，可以在微流控通道內(nèi)建立濃度梯度進(jìn)行表面聚合或化學(xué)沉積，從而實現(xiàn)聚二甲基硅氧烷基底上穩(wěn)定的特征梯度。該芯片可用于制備底物在蛋白質(zhì)吸附和納米粒子固定化等多個領(lǐng)域，實現(xiàn)生化分析與傳感的實際應(yīng)用。此外，Hong等［26］提出了一種用于復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)微流控濃度梯度發(fā)生器反設(shè)計的深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型。該方法將濃度梯度和產(chǎn)生濃度梯度的設(shè)計參數(shù)分別作為深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入和輸出，并映射它們之間的關(guān)系。此外，他們提出了一種基于替代優(yōu)化和自適應(yīng)采樣的微流控濃度梯度發(fā)生器設(shè)計方法，以滿足規(guī)定的濃度梯度［27］。在許多生化實驗中，控制特定位置的濃度梯度是至關(guān)重要的。Liu等［28］基于聚二甲基硅氧烷的透氣性，提出了一種可調(diào)濃度梯度發(fā)生器，該發(fā)生器由氣泡通道中的聲學(xué)振蕩氣泡驅(qū)動，位置可控。濃度梯度的調(diào)節(jié)可以通過改變氣泡的數(shù)量和位置來實現(xiàn)。該器件制作簡單、反應(yīng)靈敏、生物相容性好，特別適用于對時間可控性要求較高的生物學(xué)研究。

2 微流控濃度梯度芯片的應(yīng)用

2.1 高通量藥物篩選

微流控濃度梯度芯片由于可以在芯片內(nèi)部建立起穩(wěn)定的濃度梯度，且可以與3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，因此越來越受到關(guān)注，被廣泛地用于細(xì)胞水平的藥物篩選研究。3D細(xì)胞培養(yǎng)在模擬體內(nèi)腫瘤的結(jié)構(gòu)和生理條件方面被認(rèn)為更具臨床意義。Lim等［14］開發(fā)了一種帶有細(xì)胞培養(yǎng)裝置的微流控濃度梯度發(fā)生器，可以使細(xì)胞形成球狀體并在腫瘤藥物梯度存在的情況下生長。當(dāng)結(jié)腸癌細(xì)胞成一個單一的球狀體，球狀體在癌癥藥物梯度伊立替康的存在下培養(yǎng)3 d，球狀體的數(shù)量、圓度和細(xì)胞存活率與藥物濃度成反比。這些結(jié)果表明帶有細(xì)胞培養(yǎng)裝置的藥物濃度梯度芯片有可能成為篩選腫瘤藥物療效的平臺。2型糖尿病藥物篩選的體外模型對制藥業(yè)至關(guān)重要。Luo等［29］研制了一種基于微流控技術(shù)的環(huán)形藥物濃度梯度芯片，并集成了胰島素瘤細(xì)胞系的3D培養(yǎng)。在高濃度葡萄糖作用下細(xì)胞的增殖，先是促進(jìn)后抑制，胰島素分泌功能也在高濃度葡萄糖作用下先增強(qiáng)后抑制。這個模型可以幫助找到刺激胰島素分泌的藥物。Shen等［30］開發(fā)了一種簡單緊湊的微流控芯片，可以在大流量范圍內(nèi)快速構(gòu)建多種溶質(zhì)的3個濃度梯度，生成的3個穩(wěn)定、準(zhǔn)確、可控的藥物梯度可以評價對兩種腫瘤細(xì)胞系（MCF-7和HepG2）的治療效果。

抗生素的最低抑菌濃度是確定抗生素的藥劑和抑制細(xì)菌生長的最小劑量的有效值。Tang等［31］提出了一種基于離心微流控的高度自動化線性濃度梯度發(fā)生器，該裝置進(jìn)行了抗菌藥物藥敏試驗。采用線性濃度梯度生成一系列濃度的氨芐青霉素，自動與大腸桿菌混合，通過測定懸浮液的光譜吸光度，確定氨芐青霉素對大腸桿菌的最低抑菌濃度值。類似地，Shi等［12］成功地利用研制的微流控濃度梯度芯片實現(xiàn)了抗菌藥物頭孢唑肟對大腸桿菌的最低抑菌濃度的篩選。Zhang等［32］利用濃度梯度芯片用于細(xì)菌快速生長和抑菌試驗，可以在芯片上定量測定阿莫西林抑制細(xì)菌的生長情況，以較低的細(xì)菌初始濃度在6 h內(nèi)獲得最低抑菌濃度值。此外，梯度條件下微流控芯片細(xì)胞存活率與傳統(tǒng)培養(yǎng)實驗存活率呈線性關(guān)系?；谖⒘骺貪舛忍荻刃酒乃幬锖Y選有利于個性化醫(yī)療新方法的開發(fā)。

2.2 化學(xué)毒性分析

微流控濃度梯度芯片能夠用于生成化學(xué)刺激因子的濃度梯度，利用受試物的響應(yīng)評價化學(xué)刺激因子的毒性［33］。Bagheri等［34］采用微流控濃度梯度生成器進(jìn)行碳量子點對單細(xì)胞真核模型生物酵母菌畢赤酵母的毒性分析，酵母細(xì)胞增殖的生長抑制和各種芽殖細(xì)胞形態(tài)的變化與碳量子點的濃度相關(guān)。研究表明微流控梯度生成器有潛力作為一種細(xì)胞水平上評估納米材料毒性的工具。類似地，Park等［35］利用梯度發(fā)生器與3D體外細(xì)胞培養(yǎng)模擬體內(nèi)微環(huán)境，用于檢測感染尤文氏肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。Zhang等［36］描述了一種化學(xué)梯度生成器輔助微流體細(xì)胞系統(tǒng)，用于在通量方式下動態(tài)研究典型環(huán)境污染物誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞損傷，結(jié)果證明微流控系統(tǒng)在精確和長期化學(xué)梯度生產(chǎn)中具有較高的穩(wěn)定性和可靠性，對支氣管的靜脈曲張炎癥和細(xì)胞毒性反應(yīng)進(jìn)行了實時監(jiān)測和測量，苯并芘定向引導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞萎縮，提示其對呼吸系統(tǒng)有明顯的炎癥和細(xì)胞毒性作用?；谖⒘骺貪舛忍荻壬尚酒幕瘜W(xué)梯度通過與模式生物相互作用，結(jié)合多種形式的芯片檢測技術(shù)（如表面增強(qiáng)拉曼光譜［37］），能夠在環(huán)境監(jiān)測和藥物開發(fā)等領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用前景。

2.3 趨化性研究

趨化性是細(xì)胞在化學(xué)梯度作用下，向上或向下移動以響應(yīng)引誘劑或驅(qū)避劑的過程，是細(xì)胞對環(huán)境變化反應(yīng)的一個主要因素。采用濃度梯度芯片有利于實現(xiàn)模式生物趨化行為的定量分析。Wang等［38］首次將濃度梯度芯片與微藻處理檢測系統(tǒng)相結(jié)合，用于快速評估壓載水化學(xué)處理的有效性，篩選處理的最佳時間以及試劑濃度。濃度梯度芯片可以快速生成所需的任何濃度，對微藻細(xì)胞進(jìn)行驅(qū)離，同時用葉綠素的平均熒光強(qiáng)度檢測微藻的去除效果。類似地，Wang等［39］提出了一種包含微藻細(xì)胞分離、處理和生存能力表征的微流控系統(tǒng)，能夠快速有效地識別和分離微藻細(xì)胞，利用濃度梯度發(fā)生器，自動生成具有梯度濃度的化學(xué)試劑，篩選最佳的微藻驅(qū)離濃度。基于濃度梯度發(fā)生器和細(xì)胞檢測技術(shù)，能夠針對包括海洋模式生物在內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行趨化性研究，有利于在生態(tài)環(huán)境保護(hù)等分析領(lǐng)域的新應(yīng)用。

2.4 材料合成

微流控濃度梯度芯片還能夠利用自身的優(yōu)勢同時形成多種材料制備的條件，在生物材料及納米材料制備等方面有所幫助。Li等［40］設(shè)計了一種簡單的三重梯度微流控芯片，用于高效篩選化學(xué)空間。該裝置的篩選效率有數(shù)量級的提高，該裝置篩選了溶菌酶和胰蛋白酶兩種模型蛋白的結(jié)晶條件，并用X射線衍射證實了晶體結(jié)構(gòu)。Liu等［41］設(shè)計一種簡單可控的方法，通過結(jié)合液滴產(chǎn)生和梯度發(fā)生器，同時制備4種不同類型的微粒子，通過操縱聚（乳酸-二羥乙酸）濃度梯度、聚（癸內(nèi)酯）/聚（乳酸-二羥乙酸）比例梯度和碳酸二甲酯/二氯甲烷比例梯度，可以產(chǎn)生不同大小、異質(zhì)性和各向異性的微粒子。因此，基于微流控濃度梯度芯片的材料合成條件的篩選也逐漸成為其新的應(yīng)用領(lǐng)域，能夠廣泛地用于材料合成和化學(xué)篩選、給藥制劑、生物檢測鑒別、微傳感器和組織工程等領(lǐng)域［42］。

3 展望

濃度梯度芯片是微流控芯片技術(shù)的一個重要分支。研究者通過優(yōu)化經(jīng)典的“圣誕樹”模型以及開發(fā)全新的濃度梯度芯片，能夠?qū)崿F(xiàn)不受入口流速影響的濃度梯度，通過修改設(shè)計參數(shù)實現(xiàn)特定的梯度形狀并維持?jǐn)?shù)天的穩(wěn)定，通過改進(jìn)加工工藝以及材料，能夠適用于多場景下的應(yīng)用需求。得益于微流控濃度梯度芯片設(shè)計靈活、梯度穩(wěn)定以及與多種檢測技術(shù)相結(jié)合的優(yōu)勢，在腫瘤藥物篩選、抗生素最低抑菌濃度篩選、藥物開發(fā)、毒性分析，趨化性研究以及材料合成等領(lǐng)域得到充分應(yīng)用。針對特定應(yīng)用需求（如生物檢測［8］，基于可穿戴式設(shè)備的個性化醫(yī)療［43-44］等），開發(fā)新型的濃度梯度芯片將是后續(xù)發(fā)展的熱點。