低能量脈沖電磁場對金黃色葡萄球菌生長的影響及其與抗生素的協(xié)同抑菌作用

李旭綱，陳一心,2，邱旭升,2

1.南京中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合鼓樓臨床醫(yī)學院，江蘇南京210008；2.南京鼓樓醫(yī)院骨科，江蘇南京210008

前言

感染性骨不連一直是骨科臨床治療的棘手問題，其治療目標是消除感染、促進骨折愈合，手術治療是目前唯一有效的治療方法。雖然近年來由于優(yōu)良的內(nèi)固定材料及手術方法的改進，感染性骨不連的治療效果有了很大的改善，但其花費高且術后仍存在感染復發(fā)、骨折不愈合的風險［1］。因此，尋找一種無創(chuàng)、經(jīng)濟且有效的治療方法十分必要。脈沖電磁場（Pulsed Electromagnetic Field, PEMF）用于骨不連的治療已有40多年，其可以控制破骨細胞的形成，刺激人骨髓基質(zhì)細胞,促進成骨細胞的增殖,從而加快骨不連愈合［2-4］。如果PEMF 同時具有抑菌或殺菌作用，那便為感染性骨不連的治療提供新的思路。近年來，應用各種物理磁學抑菌的報道不少，其中包括極低頻電磁場、旋轉磁場、靜磁場等等［5-7］。Del Re等［6］研究發(fā)現(xiàn)極低頻電磁場的暴露使得大腸桿菌內(nèi)熱休克蛋白增多，從而促使細菌凋亡；Fojt 等［8］認為電磁場可能對細胞膜中離子通道滲透性產(chǎn)生影響，從而影響離子進入細胞的運輸，從而導致生物體內(nèi)的生物變化，另一個可能的影響是由于磁場暴露而形成自由基［9］。而對于低能低強度PEMF 對細菌的作用，尚沒有相關報道。因此，本研究選用骨科感染常見致病菌金黃色葡萄球作為研究對象，研究PEMF對金黃色葡萄球菌生長的影響及其與抗生素之間的協(xié)同作用。

1 實驗材料

1.1 菌種

金黃色葡萄球菌（ATCC 29213），來自南京鼓樓醫(yī)院檢驗科。

1.2 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（南京便診生物科技有限公司）；哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基（江門市凱林貿(mào)易有限公司）。

1.3 儀器與設備

骨生長刺激儀（荷蘭IMD.B.V 公司，Orthopulse?Bone Growth Stimulator，能產(chǎn)生場強1 Gs、頻率15 Hz、脈寬5 μs、脈沖群寬5 ms、脈沖群不應期62 ms的PEMF）；DENSICHECK比濁儀（法國生物梅埃利公司）；DRP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海森信實驗儀器有限公司）。

2 實驗方法

2.1 菌液制配

采用接種環(huán)選取單個直徑約2 mm的標準金黃色葡萄球菌菌株菌落，使用平板劃線接種法接種至新的哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，置入37 ℃溫箱培養(yǎng)24 h。隔天取出血瓊脂培養(yǎng)基再次選取單個直徑約2 mm菌落比濁至0.5麥氏度（相當于1.0×108個細菌/mL）備用。

2.2 不同作用時長的PEMF 對金黃色葡萄球菌生長的影響

取無菌12 孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入2 mL 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；將備用菌液稀釋104倍后加入培養(yǎng)板，每孔加入500 μL。PEMF 組培養(yǎng)皿置于骨生長刺激儀線圈式換能器中央，開啟設備，使之充分暴露于PEMF；對照組培養(yǎng)皿置于骨生長刺激儀線圈式換能器中央，關閉設備。所有培養(yǎng)板均置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)，每間隔2 h 取培養(yǎng)液倍比稀釋后接種至哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃溫箱培養(yǎng)24 h 后計菌落數(shù)（Colony Forming Unit, CFU）。分別對2、4、6、8 h 這4 個時間點的細菌數(shù)進行計數(shù)，每個時間點各組均重復6次。

2.3 PEMF與抗生素對金黃色葡萄球菌的聯(lián)合影響

實驗分4 組，即對照組、PEMF 組、抗生素組、PEMF+抗生素組。將備用菌液稀釋至105CFU/mL，頭孢呋辛配至0.687 5 μg/mL，取無菌12 孔細胞培養(yǎng)板。對照組與PEMF 組加50 μL 105CFU/mL 菌液、450 μL 生理鹽水以及2 mL 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；抗生素組和PEMF+抗生素組加50 μL 105CFU/mL 菌液、450 μL 0.687 5 μg/mL 抗生素以及2 mL 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；PEMF 組及PEMF+抗生素組培養(yǎng)皿置于骨生長刺激儀線圈式換能器中央，開啟設備，使之充分暴露于PEMF；對照組、抗生素組培養(yǎng)皿置于骨生長刺激儀線圈式換能器中央，關閉設備。所有培養(yǎng)板均置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)，8 h后取培養(yǎng)液倍比稀釋后接種至哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃溫箱培養(yǎng)24 h 后計菌落數(shù)。每組重復6次。

2.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件對上述計數(shù)結果進行分析，先進行方差齊性判斷，符合正態(tài)分布的測量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,采用成組樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 不同作用時長的PEMF 對金黃色葡萄球菌生長的影響

2 h與4 h PEMF組與對照組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。6 h與8 h的PEMF干預則顯著抑制了金黃色葡萄球菌的生長，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），6 h時PEMF組菌落計數(shù)約為對照組的23%（P<0.001）；8 h時PEMF組菌落計數(shù)約為對照組的28%（P=0.001）。詳見表1、圖1。

表1 不同PEMF干預時長下金黃色葡萄球菌的細菌數(shù)（±s）Tab.1 Bacterial count of Staphylococcus aureus under different intervention durations of PEMF(Mean±SD)

表1 不同PEMF干預時長下金黃色葡萄球菌的細菌數(shù)（±s）Tab.1 Bacterial count of Staphylococcus aureus under different intervention durations of PEMF(Mean±SD)

細菌數(shù)=菌落數(shù)×倍比稀釋數(shù)

作用時長/h 對照組PEMF組t值P值2 4 6 8 341±33 2 718±661 49 567±5 462 298 333±61 389 315±11 2 567±448 11 650±4 103 83 000±223 334 1.657 0.490 13.192 6.924 0.158 0.644<0.001 0.001

圖1 PEMF不同干預時長哥倫比亞血瓊脂板培養(yǎng)圖片F(xiàn)ig.1 Columbia blood agar plate culture under different intervention durations of PEMF

3.2 PEMF與抗生素對金黃色葡萄球菌的聯(lián)合影響

經(jīng)倍比稀釋（104倍），對照組、PEMF組、抗生素組和PEMF+抗生素組菌落計數(shù)結果分別為（65.2±11.4）、（21.8±7.9）、（22.8±2.9）、（6.0±2.9）CFU/mL。PEMF組、抗生素組、PEMF+抗生素組菌落計數(shù)分別是對照組的32%、34%，10%，都顯著少于對照組（P<0.05）；同時PEMF+抗生素組菌落計數(shù)顯著少于單獨的PEMF組和抗生素組（P<0.05）（圖2）。

圖2 PEMF與抗生素對金黃色葡萄球菌的聯(lián)合影響（體外干預8 h）Fig.2 Synergistic antibacterial effect of PEMF and antibiotics on Staphylococcus aureus(in vitro intervention for 8 hours)

4 討論

感染性骨不連涉及感染和骨不連，多由嚴重開放性骨折所致，感染是骨不連的主要原因。消除感染，促進骨折愈合是感染性骨不連治療的目標，手術治療是目前治療感染性骨不連的唯一手段，但其費用昂貴，且常需二次手術治療［1］。作為一種被美國FDA批準應用于臨床的治療技術，PEMF擁有無創(chuàng)、溫和、經(jīng)濟等優(yōu)點，是一種很有希望的骨感染輔助治療方法。

4.1 低能量PEMF的臨床應用

能用于臨床治療的PEMF往往是低能低強度的。早在1981年Heckman 等［2］發(fā)現(xiàn)PEMF 可有效促進骨折愈合；Garland 等［10］通過對139 名骨不連患者的長期隨訪發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過每天至少3 h的PEMF治療，患者骨不連愈合率約為80%。林通等［11］發(fā)現(xiàn)PEMF 聯(lián)合雙膦酸鹽及鈣劑治療老年骨質(zhì)疏松癥在止痛及增加骨密度值方面有更好的療效。有研究表明PEMF 可通過對一氧化氮信號傳導的PEMF 效應來控制傷口中內(nèi)源性IL-1β 的動力學，從而通過調(diào)節(jié)機體的抗炎途徑來減少術后的疼痛和麻醉藥的使用［12-14］；潘云虎等［15］通過對糖尿病大鼠急性下肢缺血模型的實驗研究發(fā)現(xiàn)PEMF 可通過刺激血管內(nèi)皮細胞釋放FGF-2促進糖尿病大鼠急性下肢缺血的血管新生。Kwan等［16］的一項臨床隨機對照研究發(fā)現(xiàn)PEMF 可能改善微循環(huán)，從而促進慢性糖尿病足潰瘍的傷口愈合。低能量PEMF 在治療骨質(zhì)疏松、促進骨折愈合、減少術后疼痛以及改善微循壞方面均有一定的積極作用。此外，亦有不少動物實驗結果表明PEMF有促進神經(jīng)損傷修復的功能，但缺少相應的臨床研究報導支持［17-18］。

4.2 高能量PEMF的殺菌應用

目前關于PEMF 對細菌作用的研究主要集中在污水處理、食品消毒領域，其所采用的PEMF 為高能高強度電磁場，并不能應用于人體。如Piyadasa等［19］研究發(fā)現(xiàn)商用水處理器所產(chǎn)生的PEMF 可導致細菌活力和培養(yǎng)能力下降；李梅等［20］發(fā)現(xiàn)長時間高強度的PEMF 暴露使細胞表面發(fā)生了不可修復的破損現(xiàn)象，造成細菌正常功能的喪失；張咪［21］發(fā)現(xiàn)高強度脈沖磁場可有效殺滅食品中的李斯特菌，并認為高強度PEMF 的暴露加快了鈣離子的跨膜運動,胞內(nèi)鈣離子濃度的升高導致了李斯特菌的死亡。

4.3 低能量PEMF的殺菌作用

與已有報導的高能量PEMF殺菌報導不同，本研究采用可供臨床應用的低能量PEMF，發(fā)現(xiàn)低能量的PEMF 也同樣具有殺菌作用。研究結果表明2 h和4 h 的PEMF 干預組計數(shù)結果無統(tǒng)計學差異，該時期的細菌處于遲緩期，是細菌對新環(huán)境的適應過程，代謝活躍但分裂緩慢；而6 h與8 h的PEMF干預則顯著抑制了金黃色葡萄球菌的生長，此時期的細菌處于對數(shù)生長期，該時期細菌大小、形態(tài)、染色、生物活性都很典型，對外界環(huán)境因素的作用敏感［22］?，F(xiàn)有研究表明不同電磁場的脈沖個數(shù)、持續(xù)時間、頻率都是可變的，這些因素可能導致微生物失活的不可逆電穿孔機制，如電解和釋放幾種自由基，從而導致單獨或與電場聯(lián)合殺滅微生物［23］。同樣，細菌膜電位也會隨著PEMF的干預而發(fā)生改變，使細菌的代謝狀態(tài)發(fā)生根本性的生物學變化［24］，這一變化可能促使細菌膜的損傷，影響細菌增殖［25］。此外，本研究還表明PEMF 與抗生素具有協(xié)同抗菌作用。Pilla 等［26］研究發(fā)現(xiàn)在PEMF作用下，細胞內(nèi)Ca2+釋放，導致Ca2+與鈣調(diào)蛋白的結合增加以及與新陳代謝、炎癥、細胞凋亡等相關的下游信號通路增多。可見，與藥物療法不同，PEMF 干預很可能通過幾個生物級聯(lián)而不是一個狹窄的信號通路發(fā)揮作用。我們也因此猜想PEMF 與抗生素之間不僅僅是單方面抑菌作用的疊加，二者之間可能也存在相互的作用。另一方面，有文獻報道PEMF的干預可誘導機體產(chǎn)生一氧化氮，一氧化氮是為數(shù)不多的已知的氣體信號分子之一，具有擴張血管、減輕炎癥的作用［27］。由于感染的骨組織血供受到破壞，因此骨組織中抗生素的濃度往往達不到最低殺菌濃度，因此單純使用抗生素治療骨感染效果往往不理想［28］，一氧化氮的擴血管作用可改善局部的微循環(huán)，從而提高局部抗生素濃度。所以我們猜想在體內(nèi)，PEMF 與抗生素的協(xié)同抑菌作可能優(yōu)于體外。

本研究也存在一定的局限性。PEMF 療法影響生物學的生物物理和細胞機制是復雜的，仍需進一步深入研究。此外，本研究僅選取了骨感染中最常見的金黃色葡萄球菌，PEMF 對于骨感染中其它相關細菌是否同樣存在抑制作用，值得進一步研究。

5 結論

本研究發(fā)現(xiàn)低能量PEMF 可以顯著抑制對數(shù)生長期金黃色葡萄球菌，同時與抗生素之間具有協(xié)同抑菌作用，另一方面，PEMF 對促進骨折愈合、減少術后疼痛以及改善微循壞均有一定的積極作用，可應用于臨床。因此，PEMF 是一種很有希望的骨感染輔助治療方法。