纖維素降解菌長(zhǎng)枝木霉菌（Trichoderma longibrachiatum）ZJ-10的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

我國(guó)是畜禽養(yǎng)殖大國(guó)，據(jù)2020年中國(guó)統(tǒng)計(jì)年鑒顯示，2019年底全國(guó)羊存欄數(shù)達(dá)3.0億只，年產(chǎn)羊糞約3 億t[1]，其中40%的畜禽糞污未得到資源化利用或無(wú)害化處理[2]，其所造成的環(huán)境問(wèn)題日益突出。羊是典型的食草動(dòng)物，相較于其他畜禽廢棄物，羊糞含有較多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括大量未降解的纖維素與半纖維素。纖維素是由D-吡喃葡萄糖環(huán)彼此以β-1，4-糖苷鍵以C1椅式構(gòu)象聯(lián)結(jié)而成的線形高分子化合物[3]，具有在常溫下難以降解的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響著羊糞資源再利用的效率。

我國(guó)除了是畜禽養(yǎng)殖廢棄物產(chǎn)量大國(guó)，同時(shí)也是園林廢棄物產(chǎn)量大國(guó)。所謂園林廢棄物，也稱為園林垃圾或綠色垃圾，主要是指園林植物自然凋落或人工修剪所產(chǎn)生的枯枝、落葉、樹(shù)木與灌木剪枝及其他植物殘?bào)w等[4]，主要成分為纖維素和木質(zhì)素，不易被微生物降解利用，成為其被資源化再生利用的難點(diǎn)之一?，F(xiàn)階段處理園林廢棄物的方法主要有直接堆放、填埋或焚燒[5]，而這些方法會(huì)對(duì)環(huán)境造成極大的負(fù)面影響。要實(shí)現(xiàn)我國(guó)畜禽養(yǎng)殖和園林廢棄物高效化資源利用，首先要解決纖維素降解難的問(wèn)題。

纖維素在自然界中分布廣泛，不溶于水和普通酸堿，室溫下相對(duì)穩(wěn)定[6]。相較于物理法和化學(xué)法，生物法通過(guò)微生物侵入改變纖維素的結(jié)構(gòu)進(jìn)而加快其分解，具有反應(yīng)較溫和、成本較低、保護(hù)環(huán)境的優(yōu)點(diǎn)。目前已經(jīng)分離到的能夠分解纖維素的微生物主要分為細(xì)菌、真菌和放線菌3類[7]。相較細(xì)菌和放線菌，真菌產(chǎn)生的纖維素酶具有較強(qiáng)的活力。王金明[8]從豬糞樣品中篩選出了纖維素降解真菌，鑒定為煙曲霉（Aspergillus fumigatus）YC2，其生長(zhǎng)最適溫度為50 ℃，內(nèi)切葡聚糖酶［羧甲基纖維素（carboxyl methyl cellulose,CMC）酶］活力最高可達(dá)（1.803±0.062）U/mL。張冬雪等[9]從稻田土中篩選到纖維素降解真菌，鑒定為草酸青霉（Penicillium oxalicum），培養(yǎng)5 d 后CMC 酶活力為29.35 U/mL。李佳騰等[10]從杏鮑菇菌糠中篩選出黑曲霉（Aspergillus niger），培養(yǎng)8 d后CMC酶活力可達(dá)（1.27±0.02）U/mL?？梢钥闯觯叭撕Y選出的纖維素降解真菌酶活力較低。本研究采集杭州市余杭區(qū)鸕鳥(niǎo)鎮(zhèn)竹屑、枯枝爛葉等園林廢棄物以及羊糞等農(nóng)業(yè)廢棄物，擬從中分離篩選出產(chǎn)纖維素酶活力較高的真菌菌株，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacers,ITS）基因序列分析、纖維素酶活力測(cè)定；采用單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化菌株培養(yǎng)條件，通過(guò)Plackett-Burman（P-B）試驗(yàn)設(shè)計(jì)、Box-Benhnken（B-B）最陡爬坡路徑方法和響應(yīng)面法優(yōu)化菌株產(chǎn)酶配方，提高其降解纖維素的效率，以期對(duì)今后羊糞及竹屑等廢棄物資源化利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來(lái)源

試驗(yàn)樣品為采集自杭州市余杭區(qū)鸕鳥(niǎo)鎮(zhèn)的毛竹竹屑、枯枝爛葉及新鮮羊糞。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）15.0 g、NH4NO31.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO41.0 g、去離子水1 L。剛果紅培養(yǎng)基配制參考馬欣雨等[11]的方法。羧甲基纖維素（CMC）真菌培養(yǎng)基：參考甄靜等[12]的方法，倒平板前，在100 mL 培養(yǎng)基中加入10 g/L 鏈霉素30 μL、2%去氧膽酸鈉200 μL。濾紙崩解培養(yǎng)基：KH2PO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、CaCl20.1 g、NaCl 0.1 g、FeCl30.01 g、NaNO32.5 g、pH 7.2～7.3、去離子水1 L。液體產(chǎn)酶鑒定培養(yǎng)基參考張玉云等[13]的方法：蛋白胨5.0 g、酵母膏2.0 g、（NH4）2SO42.0 g、KH2PO44.0 g、NaCl 4.0 g、濾紙0.5 g、CMC-Na 10.0 g、去離子水1 L，自然pH 值。種子培養(yǎng)基配制參考諸葛誠(chéng)祥[14]的方法。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 降解菌的富集與分離

分別取5 g 竹屑、枯枝爛葉、羊糞樣品，放入盛有150 mL 已滅菌富集培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，在30 ℃、180 r/min 搖床中振蕩培養(yǎng)48 h 后，移取5 mL培養(yǎng)液至另一盛有新鮮富集培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。富集數(shù)次后，移取1 mL培養(yǎng)液于裝有10 mL 無(wú)菌水的試管中，得到1×10－1稀釋液，用無(wú)菌移液管吸取1 mL 1×10－1稀釋液，放入裝有9 mL 無(wú)菌水的試管中，吹吸2 次，手動(dòng)振搖，使充分混勻，得到1×10－2稀釋液，同上，依次連續(xù) 稀 釋，制 成1×10－3、1×10－4、1×10－5、1×10－6、1×10－7濃度梯度菌懸液，接種到固體CMC培養(yǎng)基平板上，用涂布棒涂布均勻，于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，多次繼代純化培養(yǎng)，直至得到純的單菌株。

1.2.2 降解菌的初篩

采用馬欣雨等[11]的剛果紅染色法培養(yǎng)菌株，測(cè)量水解圈直徑（H）和菌落直徑（C），計(jì)算水解能力（H/C），每株菌株重復(fù)測(cè)量3 次，菌株纖維素水解能力與H/C值呈正比，根據(jù)比值選取高產(chǎn)酶菌株。

濾紙的崩解實(shí)驗(yàn)：把分離純化得到的不同菌株置于50 mL 的種子培養(yǎng)基中，在30 ℃、180 r/min 搖床中振蕩培養(yǎng)2 d制成種子液。再分別接種于盛有濾紙崩解培養(yǎng)基的試管中，每支試管底部放入一條l cm×6 cm的濾紙條（3個(gè)重復(fù)）。將濾紙烘干、稱量，記錄每張濾紙的初質(zhì)量，分別在30 ℃、180 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)15 d，觀察并記錄濾紙的崩解情況。根據(jù)濾紙的崩解情況來(lái)初步判斷菌株降解纖維素的能力。挑選濾紙崩解程度高的菌株進(jìn)行下一步的篩選。用稀鹽酸和硝酸的混合液沖洗去除菌體，反復(fù)緩慢沖洗濾紙，然后將濾紙置于80 ℃烘箱中烘干并稱量，計(jì)算濾紙的失重率：

1.2.3 降解菌的復(fù)篩

1.2.3.1 粗酶液的制備

挑取經(jīng)劃線培養(yǎng)的單菌落于50 mL液體產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃、180 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)7 d，獲得的發(fā)酵液在4 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min，上清液即為粗酶液，用于酶活力的測(cè)定。

1.2.3.2 酶活力測(cè)定

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：用已配制好的1 mg/mL葡萄糖溶液作為母液，參照諸葛誠(chéng)祥[14]的方法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于后續(xù)纖維素酶活力的計(jì)算。

用GHOSE[15]的方法測(cè)定內(nèi)切葡聚糖酶活力。酶活力單位定義為：在50 ℃、pH 4.8條件下，每毫升酶液在1 min內(nèi)產(chǎn)生1 mg葡萄糖為1個(gè)酶活力單位（U）。

式中：E為樣品的酶活力，U/mL；S為樣品的平均吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的葡萄糖質(zhì)量濃度，mg/mL；N為粗酶液的稀釋倍數(shù)；1 000為mg與μg之間的換算倍數(shù)；t為反應(yīng)時(shí)間，min；V為參與反應(yīng)的粗酶液體積，mL。

1.2.4 菌株的鑒定

1.2.4.1 形態(tài)學(xué)觀察

將篩選菌株進(jìn)行平板培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后對(duì)其進(jìn)行形態(tài)觀察[16]。

1.2.4.2 分子生物學(xué)鑒定

對(duì)篩選菌株進(jìn)行測(cè)序?qū)嶒?yàn)，采用通用生物（安徽）股份有限公司合成的引物ITS1（5′-TCCGTAGG TGAACCT-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGA TATGC-3′）進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）實(shí)驗(yàn)。根據(jù)所得測(cè)序目的序列到NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行BLAST 比對(duì)。通過(guò)MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確認(rèn)分離菌的分類地位。

1.2.5 菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.2.5.1 培養(yǎng)基初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響

設(shè)定接種量為4%，在30 ℃、180 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)，測(cè)定不同復(fù)合培養(yǎng)基初始pH 對(duì)菌種產(chǎn)CMC酶活力的影響。調(diào)節(jié)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基初始pH分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 和8.0。在第5 天測(cè)定CMC酶活力。

1.2.5.2 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

設(shè)定培養(yǎng)基初始pH 為7.0，在30 ℃、180 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)，測(cè)定不同接種量對(duì)菌種產(chǎn)CMC酶活力的影響。分別設(shè)定接種量為1%、2%、3%、4%、5%和6%。在第5天測(cè)定CMC酶活力。

1.2.5.3 轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響

設(shè)定培養(yǎng)基初始pH 為7.0，接種量為4%，在30 ℃下測(cè)定不同轉(zhuǎn)速對(duì)菌種產(chǎn)CMC 酶活力的影響。轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為100、120、140、160、180、200 r/min。在第5天測(cè)定CMC酶活力。

1.2.5.4 溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

設(shè)定培養(yǎng)基初始pH 為7.0，接種量為4%，轉(zhuǎn)速為180 r/min，測(cè)定不同溫度對(duì)菌種產(chǎn)CMC 酶活力的影響。設(shè)定溫度分別為25、30、35、40、45、50 ℃。在第5天測(cè)定CMC酶活力。

1.2.5.5 菌株產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

為優(yōu)化菌株的產(chǎn)酶條件，本試驗(yàn)將液體產(chǎn)酶培養(yǎng) 基 中 的CMC-Na、（NH4）2SO4、蛋 白 胨、MgSO4·7H2O、KH2PO4、CaCl2·2H2O、酵母膏的7個(gè)濃度作為影響因素，利用P-B設(shè)計(jì)對(duì)這7個(gè)因素進(jìn)行分析，確定各因素的重要性，通過(guò)B-B最陡爬坡路徑方法確定重要因子的最適濃度范圍，利用Design-Expert 8.0 軟件進(jìn)行多元回歸擬合分析，通過(guò)測(cè)定CMC 酶活力確定最佳培養(yǎng)基配方。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解真菌的初篩

通過(guò)富集培養(yǎng)基對(duì)竹屑、枯枝爛葉、羊糞等材料進(jìn)行初步分離純化后，將1×10－4、1×10－5、1×10－6濃度稀釋菌液分別涂布于羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）瓊脂真菌培養(yǎng)基上，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，48 h后挑取單個(gè)菌落，劃線分離純化。共得到17株具有纖維素降解能力的真菌菌株，命名為ZJ-1～ZJ-17。從不同菌株在剛果紅培養(yǎng)基上的降解情況（表1）來(lái)看，17 株真菌對(duì)纖維素都有一定的降解作用，以H/C比值大于1.5 為界限，具有較強(qiáng)纖維素降解能力的菌株為ZJ-1、ZJ-3、ZJ-7、ZJ-8、ZJ-9、ZJ-10、ZJ-13、ZJ-15、ZJ-17。從不同菌株濾紙崩解試驗(yàn)情況及分解率（表1）可見(jiàn)，ZJ-7、ZJ-10、ZJ-15、ZJ-17 的纖維素降解能力較強(qiáng)，濾紙開(kāi)始崩解的時(shí)間較早，且在15 d試驗(yàn)結(jié)束后濾紙呈不定狀或糊狀；而ZJ-4、ZJ-8、ZJ-11、ZJ-12、ZJ-14、ZJ-16的纖維素降解能力較弱，15 d 后濾紙只是邊緣軟化。結(jié)合剛果紅培養(yǎng)基降解效果和濾紙崩解試驗(yàn)結(jié)果（表1）初步篩選后，得到4 株纖維素降解能力較好的真菌菌株，分別為ZJ-7、ZJ-10、ZJ-15、ZJ-17，用于下一步的復(fù)篩試驗(yàn)。

表1 不同菌株的水解能力、濾紙崩解情況及分解率Table 1 Hydrolysis capacities of different strains,disintegration of filter paper and decomposition rate

2.2 纖維素降解真菌的復(fù)篩

以葡萄糖溶液的質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.744 2x－0.024 4（R2=0.999 4）。

用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar,PDA）培養(yǎng)基分別培養(yǎng)ZJ-7、ZJ-10、ZJ-15 和ZJ-17一段時(shí)間，并取同一濃度下的各菌液1 mL 接種于50 mL 產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)7 d。每天定時(shí)取樣，測(cè)定各菌株CMC酶活力，并繪制酶活力隨時(shí)間的變化曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。從中可知，ZJ-7、ZJ-10、ZJ-15 的CMC 酶活力均在第5 天達(dá)到最大值，分別為51.40、63.52、59.46 U/mL。ZJ-17 的CMC 酶活在第4天達(dá)到最大值，為52.29 U/mL。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)纖維素降解真菌產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effects of different incubation times on the enzyme production of cellulose-degrading fungi

通過(guò)CMC 酶活力測(cè)定進(jìn)行高效纖維素降解菌的復(fù)篩，并確定不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)降解真菌產(chǎn)酶活力的影響，得到了1 株纖維素降解酶活力較高的真菌ZJ-10。對(duì)ZJ-10菌株進(jìn)行菌種鑒定。

2.3 菌株ZJ-10 鑒定

2.3.1 菌株ZJ-10 形態(tài)學(xué)觀察

菌株ZJ-10 在纖維素分解菌培養(yǎng)基（30 ℃）上培養(yǎng)24 h后進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，菌落呈絮狀、淡黃色，生長(zhǎng)后期變?yōu)榻瘘S色，表面有凸起，周圍扁平、有褶皺。

2.3.2 菌株ZJ-10 分子生物學(xué)鑒定

經(jīng)測(cè)序可知菌株ZJ-10 的ITS 序列長(zhǎng)度為650 bp，在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，得到的相似性大于97%的序列均屬于木霉菌屬（Trichoderma），結(jié)合生理生化特性和形態(tài)學(xué)觀察，初步確定菌株ZJ-10 為木霉真菌，且與長(zhǎng)枝木霉菌（Trichoderma longibrachiatum）的相似性更高（圖2），故將其命名為T(mén).longibrachiatumZJ-10。使用MEGA 7.0 軟件對(duì)菌株ZJ-10與其他8株菌構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果如圖2所示。

圖2 基于菌株ZJ-10及相關(guān)rDNA ITS序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based on strain ZJ-10 and the related rDNA ITS sequence

2.4 菌株ZJ-10 條件優(yōu)化

2.4.1 菌株ZJ-10 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

由圖3A 可以看出，隨著接種量的增加，菌株CMC 酶活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。接種量為3%時(shí)，CMC酶活力達(dá)到最大，為60.35 U/mL。接種量在2%～4%時(shí)，菌株ZJ-10 產(chǎn)CMC 酶活力較高。綜上所述，菌株ZJ-10的最適產(chǎn)酶接種量為3%。

由圖3B 可以看出：隨著產(chǎn)酶培養(yǎng)基初始pH 的增加，菌株CMC酶活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且在pH 6.5時(shí)的值最大，為69.61 U/mL；在pH 8.0時(shí)的值最小，為40.50 U/mL。綜上所述，菌株ZJ-10的最適產(chǎn)酶初始pH 為6.5，且該菌株在pH＞7.0 時(shí)CMC酶活力大大降低。

由圖3C可以看出，轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶活力的影響相較其他幾個(gè)因素小。隨著轉(zhuǎn)速的提高，菌株CMC 酶活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)轉(zhuǎn)速為160 r/min時(shí)，CMC酶活力達(dá)到最高，為62.62 U/mL；當(dāng)轉(zhuǎn)速為100 r/min 時(shí)，CMC 酶活力最小，為45.51 U/mL。綜上所述，菌株ZJ-10 的最適產(chǎn)酶轉(zhuǎn)速為160 r/min。

由圖3D 可以看出：隨著培養(yǎng)溫度的上升，菌株ZJ-10的CMC酶活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在25～35 ℃條件下產(chǎn)酶活力上升較快，35～40 ℃條件下產(chǎn)酶活力上升較緩慢，CMC酶活力在培養(yǎng)溫度為40 ℃時(shí)達(dá)到最大值，為59.76 U/mL。綜上所述，菌株ZJ-10的最適產(chǎn)酶溫度為40 ℃。

圖3 接種量（A）、初始pH（B）、轉(zhuǎn)速（C）、溫度（D）對(duì)菌株ZJ-10產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effects of inoculation amount(A),initial pH(B),rotation speed(C),and temperature(D)on the enzyme production of strain ZJ-10

2.4.2 菌株ZJ-10 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.4.2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用Minitab 軟件對(duì)產(chǎn)酶培養(yǎng)基各因素的P-B試驗(yàn)進(jìn)行方差分析。由表2 可知，根據(jù)效應(yīng)值的絕對(duì)值可知，影響CMC酶活力的關(guān)鍵因素為：X3（蛋白胨）＞X2（CMC-Na）＞X7（NaCl）＞X1（濾紙）＞X4（酵母膏）＞X6［（NH4）2SO4］＞X5（KH2PO4）。從P值來(lái)看，X2（CMC-Na）和X3（蛋白胨）為極顯著影響因素，X7（NaCl）為顯著影響因素。綜上所述，取X2（CMC-Na）、X3（蛋白胨）、X7（NaCl）進(jìn)行響應(yīng)面分析，以確定其所對(duì)應(yīng)的最優(yōu)水平。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及各因素響應(yīng)評(píng)價(jià)Table 2 Plackett-Burman experimental design and evaluation of the response of various factors

2.4.2.2 Box-Benhnken 最陡爬坡路徑方法及響應(yīng)面分析

為確定3個(gè)因素的最適濃度范圍，將NaCl（A）、蛋白胨（B）和CMC-Na（C）質(zhì)量濃度分別設(shè)置為2～7、3～8、8～13 g/L，以CMC 酶活力作為判定指標(biāo)。結(jié)果如表3 所示，NaCl、蛋白胨和CMC-Na 最適質(zhì)量濃度范圍分別為4～6、5～7、10～12 g/L。

表3 NaCl、蛋白胨和CMC-Na最適質(zhì)量濃度范圍確定Table 3 Determination of optimum concentration ranges of NaCl,peptone and CMC-Na

以NaCl（4～6 g/L）、蛋白胨（5～7 g/L）、CMCNa（10～12 g/L）為自變量，CMC 酶活力作為因變量，采用B-B 試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)菌株ZJ-10 的產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，共設(shè)計(jì)17 個(gè)試驗(yàn)組，各水平選擇結(jié)果與分析見(jiàn)表4。利用Design-Expert 8.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到回歸方程：CMC 酶活力/(U/mL)=73.58+2.60A+4.15B+5.26C+1.48AB－1.03AC+0.61BC－3.12A2－4.43B2－1.85C2。

表4 Box-Benhnken試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of Box-Benhnken experiment

由模型回歸方程方差分析可知，該回歸模型P=0.001 7＜0.000 1，表明該回歸方程達(dá)到極顯著水平，該方程失擬項(xiàng)F值為4.70（F＞0.05），表明該方程失擬不顯著，說(shuō)明該回歸模型擬合程度好，數(shù)據(jù)可靠，可以用于產(chǎn)酶培養(yǎng)基的優(yōu)化。回歸方程的決定系數(shù)R2=0.939 4＞0.9，表明模型能解釋93%響應(yīng)值的變化，回歸擬合程度較好。校正決定系數(shù)=0.861 5＞0.8，說(shuō)明預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間具有高度相關(guān)性。在該回歸模型中，一次項(xiàng)B、C和二次項(xiàng)B2對(duì)菌株ZJ-10 CMC 酶活力的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），A和A2達(dá)到顯著水平，交互項(xiàng)AB、AC、BC和C2均無(wú)顯著影響，且A、B、C影響的顯著性與P-B試驗(yàn)得到的結(jié)果一致。結(jié)合響應(yīng)面結(jié)果（圖4）分析，可以看出各因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響[17]。

應(yīng)用Design-Expert 8.0軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行優(yōu)化分析，得到菌株ZJ-10 最佳CMC 酶活力的產(chǎn)酶培養(yǎng)基條件為NaCl 5 g/L、蛋白胨7 g/L、CMC-Na 12 g/L，此時(shí)CMC 酶活力可達(dá)到84.54 U/mL。根據(jù)以上結(jié)果，進(jìn)行重復(fù)搖菌試驗(yàn)，在最適產(chǎn)酶條件、最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方的條件下測(cè)定CMC 酶活力為80.32 U/mL，比優(yōu)化前提高了26.45%，說(shuō)明響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)酶條件在一定程度上具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 討論

微生物降解法因其能夠提高園林廢棄物利用效率、保護(hù)環(huán)境且耗能小，已被廣泛關(guān)注[7]。降解纖維素的微生物主要分為3 大類：細(xì)菌、真菌和放線菌[18]。其中，纖維素真菌在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生大量穿透力強(qiáng)的菌絲，通過(guò)增大接觸面積加快其降解速率[19]；且真菌在酸性條件下能分泌大量胞外酶，加快纖維素降解的過(guò)程[20]。

白洪志等[21]將從生態(tài)環(huán)境破壞較少的野生森林土樣中篩選到的綠色木霉（Trichoderma viride）C-08 在搖瓶培養(yǎng)5 d 后發(fā)現(xiàn)，其CMC 酶活力為21.58 U/mL。寧露佳等[22]篩選到的棘孢木霉（Trichoderma asperellum）M5菌株的CMC酶活力為9.17 U/mL。本研究從竹屑、枯枝爛葉等廢棄物中分離出17 株纖維素降解真菌，經(jīng)過(guò)剛果紅培養(yǎng)基和濾紙崩解試驗(yàn)初篩，得到4 株纖維素降解能力較強(qiáng)的菌株，進(jìn)一步對(duì)這4 株菌株的CMC 酶活力進(jìn)行測(cè)定，最終篩選出1 株高效纖維素降解真菌ZJ-10，其CMC 酶活力在未優(yōu)化前為63.52 U/mL，經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和菌種鑒定，初步確認(rèn)其為木霉屬真菌T.longibrachiatum，與白洪志等[21]和寧露佳等[22]的研究結(jié)果相比，本研究所篩選出的菌株具有較強(qiáng)的產(chǎn)CMC酶能力。

為進(jìn)一步提高菌株ZJ-10 的酶活力，通過(guò)單因素試驗(yàn)分別研究接種量、初始pH、轉(zhuǎn)速、溫度對(duì)菌株ZJ-10 產(chǎn)CMC 酶活力的影響，得出菌株ZJ-10 最適培養(yǎng)條件。響應(yīng)面法被普遍應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，雷文平等[23]通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)凝固型發(fā)酵椰奶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，在最優(yōu)條件下制備的凝固型發(fā)酵椰奶感官得分可達(dá)到85.3分。胡文兵等[24]利用響應(yīng)面法探究了超聲波結(jié)合復(fù)合酶處理提取青錢(qián)柳多糖的工藝條件并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析。但響應(yīng)面法在產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方優(yōu)化方面的應(yīng)用較少，為了優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方，本試驗(yàn)通過(guò)P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方中顯著影響因素為NaCl、蛋白胨和CMC-Na，通過(guò)B-B最陡爬坡路徑方法確定顯著影響因素的最適質(zhì)量濃度范圍為NaCl 4～6 g/L、蛋白胨5～7 g/L、CMC-Na 10～12 g/L，再利用響應(yīng)面法（即多元回歸分析方法）尋求適合菌株ZJ-10的最優(yōu)產(chǎn)酶配方。經(jīng)過(guò)對(duì)培養(yǎng)條件和產(chǎn)酶培養(yǎng)基的優(yōu)化，菌株ZJ-10的CMC酶活力可達(dá)到80.32 U/mL。

4 結(jié)論

本研究在竹屑、枯枝爛葉和羊糞等廢棄物中分離篩選出1 株高纖維素降解率的木霉真菌T.longibrachiatumZJ-10，其最適培養(yǎng)條件為接種量3%，初始pH 6.5，轉(zhuǎn)速160 r/min，溫度40 ℃，培養(yǎng)5 d后能達(dá)到最大產(chǎn)酶活力；最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方為NaCl 5 g/L、蛋白胨7 g/L、CMC-Na 12 g/L，這在一定程度上為降解纖維素提供了新的微生物資源。