2016—2020年浙江地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型分子流行病學(xué)分析

徐麗華，蘇菲，李軍星，余斌，葉十一，楊富文，鄧?yán)麡s，毛慧敏，袁秀芳*

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州 310021；2.江山康農(nóng)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，浙江 衢州 324100）

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus,PCV）屬于圓環(huán)病毒科（Circoviridae）圓環(huán)病毒屬（Circovirus），為無囊膜單股環(huán)狀負鏈DNA 病毒。該病毒目前共分為豬圓環(huán)病毒1 型（PCV type 1, PCV1）、PCV2 和PCV3 3種血清型，PCV1首先于1974年在豬腎傳代細胞系（PK-15 細胞）中發(fā)現(xiàn)，對豬沒有致病性[1]。PCV3由PALINSKI等[2]于2016年首次報道，分離自發(fā)生豬皮炎和腎病綜合征（porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS）的母豬臟器和流產(chǎn)胎兒。PCV2 是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS）、豬呼吸道疾病綜合征（porcine respiratory disease complex,PRDC）和豬繁殖障礙等相關(guān)疾病的主要病原，目前在全球養(yǎng)殖場蔓延和流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[3]。

PCV2基因組大小為1 766～1 768 bp，主要包含5 個開放閱讀框（open reading frames, ORFs），其中以O(shè)RF1基因和ORF2基因最為重要。ORF1基因含有945 個堿基，編碼314 個氨基酸，表達PCV2 滾環(huán)復(fù)制相關(guān)的Rep 蛋白，也是相對保守的蛋白；ORF2基因位于DNA的互補鏈上，含有702或705個堿基，編碼234或235 個氨基酸，是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白（Cap蛋白），與病毒的免疫原性有關(guān)，具有較高的突變率。根據(jù)全基因遺傳距離和ORF2基因的遺傳距離，PCV2被分為PCV2a、PCV2b和PCV2c 3個基因型。近年來，有學(xué)者根據(jù)ORF2基因序列的進化樹分析，將PCV2 分為5 個基因型，即PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d 和PCV2e[4]。其中PCV2e 在傳統(tǒng)分類上屬于PCV2a的一個分支，而PCV2c僅在丹麥和巴西有報道，且與豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾?。╬orcine circovirus associated diseases,PCVAD）無關(guān)，而PCV2a、PCV2b 和PCV2d 均 已 經(jīng) 被 證 實 與PCVAD 有 關(guān)[5-6]。根據(jù)PCV2的遺傳演化軌跡，在2000年前PCV2a是國內(nèi)優(yōu)勢基因型，隨后由于基因變異，PCV2b 逐漸代替PCV2a，而近幾年在中國和其他國家PCV2d已逐漸成為新的優(yōu)勢基因型[4,6-8]。

本研究對2016—2020 年間采集自浙江省不同地區(qū)豬場的疑似病料，利用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）技術(shù)進行PCV2 檢測和陽性率統(tǒng)計。對部分陽性樣品進行全基因組克隆和測序，并與GenBank 中收錄的PCV2 疫苗株和參考株序列進行遺傳變異分析，以期了解和掌握浙江地區(qū)PCV2 的流行動態(tài)和遺傳變化趨勢，從而為PCV2的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

病毒核酸提取試劑盒（生產(chǎn)批號為Y503-G12、Y502-A10 等）購自江蘇省濟凡生物科技（常州）有限公司；高成功率PCR酶KOD FX購自日本TOYOBO公司；1 000 bp DNA分子標(biāo)志物、dNTPs、TOP10感受態(tài)細胞等均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；膠回收試劑盒、pMD19-T 載體均購自寶生物工程（大連）有限公司；無水乙醇、瓊脂糖、胰蛋白胨、酵母浸出物、氨芐西林（ampicillin,AMP+）等化學(xué)試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。PCV2陽性毒株由本實驗室分離保存。

ChemiDocXRS+凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；Tone 96G PCR儀購自德國Biometra公司；D-37520 Osterode 高速離心機購自德國Sigma 公司；Auto-Pure 32SH 全自動病毒核酸提取儀購自杭州奧盛儀器有限公司；Tissueiyser-24全自動樣品快速研磨儀購自上海凈信科技公司。

1.2 病料采集及處理

于2016—2020 年間，采集浙江省不同地區(qū)（杭州、嘉興、湖州、臺州、寧波、溫州、紹興、金華和衢州）疑似PCV2 感染豬的病料，包括血液、肺臟、脾臟、腹股溝淋巴結(jié)和胃底組織等樣品，于－70 ℃冰箱中保存，備用。

取保存的病料0.1 g，置于小型離心管（Eppendorf 管）中，加入pH 7.4 磷酸緩沖鹽液（phosphate buffer saline, PBS）0.5 mL，用全自動研磨儀（90 Hz，60 s）研磨成勻漿，于－70 ℃條件下凍融3 次，以8 000g在4 ℃下離心5 min，取上清液0.15 mL，用病毒核酸提取試劑盒提取核酸，操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行，吸取病毒核酸50 μL，于－20 ℃條件下保存，備用。

1.3 引物設(shè)計

下載GenBank中收錄的PCV2全基因組序列，利用Primer Premier 5軟件設(shè)計PCV2檢測引物（F1/F2）和PCV2 全基因組測序引物（PCV2-1039F/PCV2-1039R，PCV2-867F/PCV2-867R），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息見表1。

表1 用于PCR的引物Table 1 Primers used for PCR

1.4 樣品中PCV2 的PCR 檢測

以上述提取的病毒核酸為模板，用病原檢測引物進行PCV2 檢測。PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：2×PCR緩沖液12.5 μL，2 mmol/L dNTPs 5.0 μL，上、下游引物各1.5 μL（濃度為5 μmol/L），KOD FX（1.0 U/μL）0.5 μL，病毒核酸DNA 2.0 μL，ddH2O 2.0 μL?；靹蚍盅b后置于PCR 擴增儀中，擴增條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，68 ℃退火及延伸1 min，35 個循環(huán)；68 ℃延伸7 min。反應(yīng)完成后，取5 μL PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，用ChemiDocXRS+凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。

1.5 PCV2 全基因組擴增和序列測定

選取PCV2 檢測為陽性的部分樣品的核酸，用2對全基因組序列擴增引物分別進行擴增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)液配制和擴增條件同1.4 節(jié)。擴增完成后，加入0.5 μL rTaq聚合酶，72 ℃延伸10 min。反應(yīng)完成后，取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠回收。

將膠回收產(chǎn)物克隆到pMD19-T 載體中，轉(zhuǎn)化入TOP10感受態(tài)細胞，隨后均勻涂布于含有氨芐西林抗性的Luria-Bertani（LB）平板上，于37 ℃條件下培養(yǎng)12～14 h。挑取單菌落，分別接種至LB培養(yǎng)基（含AMP+抗性）中，經(jīng)菌液PCR 鑒定正確后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.6 序列分析

將1.5 節(jié)中獲得的序列進行拼接得到完整的PCV2 序列，運用DNAStar 7.1 軟件和MEGA 5.1 軟件，與GenBank 中收錄的16 株P(guān)CV2 參考株序列進行同源性比較，以及進行核苷酸和氨基酸的遺傳進化分析。參考株序列見表2，其中PCV2-SH 株、PCV2-LG 株和PCV2-ZJ 株為疫苗株序列名稱。PCV2-SH 株序列從上海發(fā)病場克隆測序得到，PCV2-ZJ 株序列從浙江發(fā)病場克隆測序得到，兩者均屬于PCV2b 型，全基因組長度為1 767 bp。PCV2-LG 株序列從吉林發(fā)病場克隆測序得到，屬于PCV2a 型，全基因組長度為1 768 bp。其余參考株來自不同國家，全基因組長度為1 766～1 768 bp。

表2 PCV2參考株信息Table 2 Information of PCV2 reference strains

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床樣品的檢測結(jié)果

對2016—2020年間浙江省不同地區(qū)的1 725份疑似豬圓環(huán)病毒2 型感染的臨床樣品進行PCV2 的特異性擴增，同時設(shè)立陽性對照組和陰性對照組。凝膠電泳結(jié)果顯示擴增出469 bp的特異性條帶，與預(yù)期片段長度相同（圖1）。其中，檢測到PCV2陽性樣品為359 份，平均陽性率為20.8%（359/1 725）。2016—2020 年P(guān)CV2 陽性率分別為38.1%、23.2%、24.1%、12.5%和10.7%。PCV2陽性率逐年下降，2016年最高（38.1%），而2020年下降到10.7%（表3）。浙江省不同地區(qū)均檢測到PCV2，且不同區(qū)域間陽性率沒有明顯差異，說明PCV2 在浙江省不同地區(qū)感染較為普遍，且沒有存在明顯的地區(qū)差異。

圖1 豬圓環(huán)病毒2型PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of PCV2

表3 不同年份（2016—2020年）PCV2的陽性率Table 3 Positive rates of PCV2 from 2016 to 2020

2.2 全基因組擴增和測序結(jié)果

在PCV2檢測為陽性的樣品中按年份隨機選取條帶較亮的樣品共36份，其中，2016年7份、2017年7 份、2018 年9 份、2019 年7 份、2020 年6 份，進行PCV2 全基因組的擴增、克隆和序列測定。經(jīng)測序獲得36 株P(guān)CV2 全基因序列，其中全長為1 766 bp的有4 株，1 767 bp 有25 株，1 768 bp 有7 株。序列根據(jù)樣品采集區(qū)域名稱的拼音首字母和采集年月日（YYYYMMDD）進行組合命名。

2.3 PCV2 全基因組序列同源性比較和序列分析

將測序所得36 株序列與GenBank 中的16 株參考株序列進行同源性比較和遺傳進化分析。結(jié)果表明：36 株P(guān)CV2 序列的核苷酸同源性為94.0%～99.9%，與國產(chǎn)疫苗株（SH 株、LG 株和ZJ 株）的核苷酸同源性為94.7%～98.5%，與13 株參考株的核苷酸同源性為92.9%～99.8%，其中DQ20200115 株與EU148505 株親緣關(guān)系最遠，同源性為92.9%；XS20160217 株與PCV2d-AH 株親緣關(guān)系最近，同源性為99.8%。按照基因型分類，36 株P(guān)CV2 序列分為3 個基因型，其中11 株為PCV2a 型，8 株為PCV2b 型，17 株為PCV2d 型，沒有分離到PCV2c型和PCV2e型。隨時間遷移，屬于PCV2d亞型的序列數(shù)量呈增加趨勢，其中2019年最多，有7株（圖2）。

圖2 基于PCV2全基因組的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic trees based on sequences of PCV2 whole genome

2.4 PCV2 ORF1 基因核苷酸及氨基酸序列的同源性比較

本實驗測得36株P(guān)CV2序列的ORF1基因全長均為945 bp，所得序列之間的核苷酸同源性為97.1%～100.0%，其中HZ20170510 株與JX20170804 株、DQ20160422 株與LX20181101 株、JH20200608 株與QZ20200521 株、PY20190323 株與WZ20181116 株核苷酸同源性最高（100.0%）；與國產(chǎn)疫苗株（SH株、LG株和ZJ 株）的核苷酸同源性為96.9%～98.9%；與13株參考株的核苷酸同源性為95.9%～100.0%，其中JS20190419 株和PCV2e EF524526 株同源性最低（95.9%），QZ20200521 株、JH20200608 株和PCV2d HM038030株同源性最高（100.0%）。各PCV2序列的ORF1基因可編碼315個氨基酸，36株P(guān)CV2序列的氨基酸同源性為98.1%～100.0%，與國產(chǎn)疫苗株（SH株、LG株和ZJ株）的氨基酸同源性為97.8%～100.0%，與13株參考株的氨基酸同源性為97.4%～100.0%。

2.5 PCV2 ORF2 基因核苷酸及氨基酸序列的同源性比較

本實驗測得36 株序列PCV2ORF2基因全長分別為705 bp（16 株）和702 bp（20 株）。所得序列之間的核苷酸同源性為88.7%～100.0%，其中DQ20201115株與JX20200715株、HZ20200323株與QZ20200521株同源性最高（100.0%）；與國產(chǎn)疫苗株（SH 株、LG 株和ZJ 株）的核苷酸同源性為90.2%～99.6%；與13 株參考株的核苷酸同源性為85.0%～100.0%。另外所得序列DQ20201115株、JX20200715株和參考株P(guān)CV2c EU148503、PCV2c EU148505 的同 源 性 最 低（85.0%），JS20190419 株 與PCV2d HM038017 株、PCV2d HM038030 株的同源性最高（100.0%）（圖3）。

圖3 36株序列ORF2基因核苷酸序列同源性比較Fig.3 Homology comparisons of ORF2 gene nucleotide sequences of 36 strains

PCV2ORF2基因可分別編碼235或234個氨基酸，相互之間氨基酸同源性為86.3%～100.0%，與國產(chǎn)疫苗株（SH株、LG株和ZJ株）的氨基酸同源性為87.2%～98.3%，與13 株參考株的氨基酸同源性為82.1%～100.0%。

2.6 Cap 蛋白的氨基酸序列分析

ORF2基因編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白（Cap 蛋白），其唯一糖基化位點位于第143—145位氨基酸，測序所得36株序列糖基化位點均為天冬酰胺（N）、酪氨酸（Y）、絲氨酸（S）（NYS），屬于高度保守[9-11]。從圖4可以看出，不同亞型的氨基酸序列差異明顯，同一亞型的氨基酸序列也存在個別點突變，但沒有發(fā)現(xiàn)插入或缺失。變異位點分布在Cap蛋白的不同位置，但其變異度比較高的主要區(qū)域為第53—91、121—136、190—210位氨基酸。另外也存在一些散在的突變位點，分別位于第30、85、101、124、161、171位氨基酸等，這些點突變沒有顯示和亞型相關(guān)，但隨時間推移可能會出現(xiàn)新的抗原變異。

圖4 PCV2 Cap蛋白的氨基酸序列多重比對分析Fig.4 Multiple alignment analysis of amino acid sequences of PCV2 Cap protein

與PCV2-LG 株氨基酸序列相比，所得序列中PCV2a 亞型的突變位置主要為T47A、R63S、A68S、M72L、I76L、N77D、V123I、T131M/I、R132K、A133V、T134P、L136Q、L185M；與PCV2-ZJ 株氨基酸序列相比，PCV2b 亞型的突變位置主要為R59K、K63R、A190T；與PCV2d HM038030 株序列相比，PCV2d 亞型的突變位置主要為R168G；與疫苗株序列相比，優(yōu)勢基因型PCV2d 亞型的特異性突變位點主要集中在I53、N68、L89、T121、R168、I215。而Cap 蛋白的B 細胞抗原表位分別位于第47—63、65—87、113—139、165—200 位氨基酸和C端的最后4位氨基酸，T細胞抗原表位分別位于第61—160、210—230位氨基酸[10-12]。顯示不同亞型的突變位點均位于B細胞和T細胞抗原表位區(qū)域，抗原表位在免疫壓力下易發(fā)生突變，從而改變PCV2蛋白的抗原性和致病力。另外，17株P(guān)CV2d亞型的序列中，除了序列LQ20171115 和LS20200831外，其余15株蛋白質(zhì)長度均為235個氨基酸，分析顯示其終止密碼子發(fā)生突變，Cap 蛋白C 末端增加了1個賴氨酸K，導(dǎo)致了Cap蛋白大小的改變。

3 討論與結(jié)論

自2000 年首次證實PCV2 在我國豬場感染以來，全國各地眾多豬場陸續(xù)發(fā)現(xiàn)PCV2 的流行和暴發(fā)，其感染率高且常和豬藍耳病毒、豬偽狂犬病毒、副豬嗜血桿菌等混合感染，給養(yǎng)殖企業(yè)帶來不可估量的經(jīng)濟損失[7-8，12-15]。本研究對2016—2020年間采集的浙江省不同地區(qū)1 725 份疑似豬圓環(huán)病毒2 型感染的臨床樣品進行了PCV2 檢測，樣本平均陽性率為20.8%（359/1 725），其中2016—2020年P(guān)CV2陽性率分別為38.1%、23.2%、24.1%、12.5%和10.7%。5 年來PCV2 陽性率總體呈逐年下降趨勢，原因有：一方面2014年浙江省實施“五水共治”，對省內(nèi)養(yǎng)豬個體戶的養(yǎng)殖場進行了拆除整治，養(yǎng)豬環(huán)境得到很大改善，豬場發(fā)病率明顯下降；另一方面2018 年非洲豬瘟在我國多個省市呈點狀暴發(fā)后，全國禁止生豬跨省調(diào)運，阻礙了豬場疫病的傳播。與王小敏等[10]在華東地區(qū)（2010—2015 年）、鄧文芳等[11]在華中地區(qū)（2017—2018年）的PCV2分子流行病學(xué)調(diào)查相比，本研究中PCV2 陽性率較低，可能與近幾年P(guān)CV2滅活疫苗在浙江地區(qū)普遍使用和養(yǎng)殖企業(yè)生物安全意識提高有關(guān)；與吳明臻等[12]在浙江省金華地區(qū)的PCV2流行病學(xué)調(diào)查相比，本研究中PCV2陽性率較高，其原因可能是該研究中樣品來源是豬場血清樣本，而本研究采集的都是臨床疑似PCV2 發(fā)病樣品。

本研究中，2016—2020年浙江省不同地區(qū)36株P(guān)CV2全基因序列的核苷酸長度為1 766～1 768 bp，核苷酸同源性為94.0%～99.9%，與國產(chǎn)疫苗株序列（SH 株、LG 株和ZJ 株）的核苷酸同源性為94.7%～98.5%，與13 株參考株序列的核苷酸同源性為92.9%～99.8%，這與吳瑗等[13]在浙江省及周邊地區(qū)（2007—2012年）的PCV2全基因序列遺傳分析結(jié)果相似，說明浙江地區(qū)PCV2毒株序列整體比較穩(wěn)定，沒有明顯的時間差異和地域差異，與國內(nèi)外不同PCV2毒株序列的差異也不大。

目前，大量文獻[9-12,16-18]報道了國內(nèi)PCV2 的流行逐漸從PCV2b 亞型向PCV2d 亞型轉(zhuǎn)變。浙江省不同地區(qū)PCV2 流行情況是PCV2a（11/36）、PCV2b（8/36）和PCV2d（17/36）3 種亞型共存，沒有發(fā)現(xiàn)PCV2c、PCV2e亞型，目前PCV2d是浙江地區(qū)PCV2流行的優(yōu)勢毒株亞型。接種疫苗是應(yīng)對PCV2感染的主要手段，而國內(nèi)現(xiàn)有的PCV2 商品化疫苗僅針對PCV2a（LG株）和PCV2b（SH株和ZJ株）2個亞型，對其他亞型毒株感染不能提供完全的交叉保護力，致使在臨床PCV2感染中疫苗的防控效果不甚理想。

PCV2ORF1基因編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的Rep蛋白。本研究中36株序列ORF1基因編碼的蛋白質(zhì)長度均為315 個氨基酸，所得序列相互間氨基酸同源性為98.1%～100.0%，與國產(chǎn)疫苗株序列的氨基酸同源性為97.8%～100.0%，與參考株序列的氨基酸同源性為97.4%～100.0%。說明PCV2ORF1基因相對比較穩(wěn)定，變異不大。

相對于Rep蛋白，PCV2ORF2基因編碼的Cap蛋白是病毒刺激機體產(chǎn)生中和抗體的主要結(jié)構(gòu)蛋白。Cap蛋白易突變，其變異程度遠遠高于其他蛋白，使PCV2毒株的變異進化、新毒株的不斷出現(xiàn)成為可能。本研究中，36株序列中該蛋白質(zhì)的長度分別為234或235 個氨基酸，各序列間氨基酸同源性為86.3%～100.0%，與國產(chǎn)疫苗株序列的氨基酸同源性為87.2%～98.3%，與參考株序列的氨基酸同源性為82.1%～100.0%，說明大部分序列的ORF2基因發(fā)生了變異。位于不同亞型的氨基酸序列差異明顯，同一亞型的序列也存在個別點突變，但沒有發(fā)現(xiàn)插入或缺失。在B 細胞抗原表位區(qū)（第47—63、65—87、113—139、165—200 位氨基酸和C 端最后4 位氨基酸）和T 細胞抗原表位區(qū)（第61—160、210—230 位氨基酸）的氨基酸序列存在較多變異，這與趙軍等[14]在四川地區(qū)對PCV2的調(diào)查分析結(jié)果相似。這些位點的變異可能會改變Cap 蛋白的免疫原性，特別是N75、I76、T131、I206位點的變異，因為這些氨基酸位點處于Cap 蛋白的免疫反應(yīng)區(qū)域內(nèi)[15-18]，有可能導(dǎo)致PCV2 的致病性增強。另外，PCV2d 亞型中有15 株序列在C 端出現(xiàn)了1 個賴氨酸K 的延伸，這與郭龍軍等[19]、王小敏等[10]的報道一致；OLVERA等[20]也證實由于ORF2基因終止密碼子發(fā)生突變，Cap 蛋白C端出現(xiàn)了1個賴氨酸延伸的現(xiàn)象。賴氨酸是一種限制性氨基酸，對機體免疫系統(tǒng)活性有一定的影響，推測該氨基酸的延伸也可能影響Cap 蛋白的免疫功能或增加病毒的致病性。

綜上所述，本研究對2016—2020年間浙江省不同地區(qū)PCV2 流行情況進行了調(diào)查，并對全基因組序列和Cap 蛋白進行了遺傳變異分析，結(jié)果顯示浙江地區(qū)PCV2d為優(yōu)勢基因型。本研究闡明了近5年浙江地區(qū)PCV2的流行變化趨勢，豐富了PCV2的流行病學(xué)資料，為浙江地區(qū)養(yǎng)殖企業(yè)針對PCV2 感染疫苗的選擇和研究機構(gòu)新型疫苗的研發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。