隆X小車蝗線粒體基因組全序列測(cè)定與分析*

孔 勇， 王眾瀟， 汪雨馨， 李 冉

(曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，273165，山東省曲阜市)

0引 言

線粒體是一種真核細(xì)胞器，由兩層膜包被，廣泛存在于昆蟲(chóng)體內(nèi)，在控制昆蟲(chóng)的新陳代謝、生命周期、凋亡、病害等方面起著重要作用[1]. 昆蟲(chóng)線粒體基因組為閉合的環(huán)狀雙鏈DNA，總長(zhǎng)一般為14～20 kb，能夠穩(wěn)定地編碼37個(gè)基因[2,3]. 線粒體基因組具有母系遺傳、較為保守的基因組分、進(jìn)化速率較快、不含內(nèi)含子等優(yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用于昆蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育、進(jìn)化和種群遺傳等方面的研究[4-7]. 除此之外，在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中，相比于祖先基因排列順序，有些昆蟲(chóng)類群的某些基因在經(jīng)歷重排事件后會(huì)發(fā)生方向和位置的改變[8]. 不同類群出現(xiàn)的基因重排在昆蟲(chóng)基因組進(jìn)化中具有一定規(guī)律，已有研究表明，基因重排能夠?yàn)樘骄坷ハx(chóng)之間的系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化關(guān)系提供證據(jù)[9]. 自1995年首個(gè)直翅目Orthoptera昆蟲(chóng)飛蝗Locustamigratoria的線粒體全基因組被報(bào)道以來(lái)，隨著各種測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，直翅目昆蟲(chóng)的線粒體基因組全序列逐漸被測(cè)定和注釋[10-12]. 迄今已測(cè)序的物種零星散布在各類群，亟需更多物種的線粒體基因組數(shù)據(jù)，為深入理解直翅目昆蟲(chóng)線粒體基因組起源和系統(tǒng)演化過(guò)程提供新的依據(jù).

隆X小車蝗OedaleusabruptusThunberg,1815隸屬于直翅目Orthoptera蝗總科Acridoidea蝗科Acrididae斑翅蝗亞科Oedipodinae，主要分布于我國(guó)的湖南、湖北、福建、海南、廣東、云南、廣西等省份及地區(qū)[13]. 該物種是禾本科植物的一種重要害蟲(chóng)，它的爆發(fā)對(duì)甘蔗、水稻、小麥、玉米、高粱等作物造成損害，進(jìn)而影響農(nóng)業(yè)發(fā)展[14]. 近年來(lái)對(duì)于隆X小車蝗的研究主要聚焦于行為和生理方面[14,15]. 由于其線粒體基因組的結(jié)構(gòu)和進(jìn)化特征仍不明確，對(duì)于該物種的系統(tǒng)發(fā)育分析主要基于單個(gè)基因或者形態(tài)特征[16]. 本研究采用Sanger測(cè)序技術(shù)測(cè)定隆X小車蝗的線粒體基因組全序列，對(duì)其基本結(jié)構(gòu)、核酸組分、蛋白編碼基因、tRNA和rRNA以及非編碼區(qū)等信息進(jìn)行全面分析，挖掘該物種的線粒體基因組特點(diǎn)，闡述其在直翅目昆蟲(chóng)線粒體基因組中的進(jìn)化共性. 同時(shí)，結(jié)合已發(fā)表的斑翅蝗亞科線粒體基因組序列對(duì)其系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系進(jìn)行了探討，為蝗科分類及直翅目線粒體基因組研究提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

隆X小車蝗成蟲(chóng)標(biāo)本采集于海南省三亞市吉陽(yáng)區(qū)六盤(pán)嶺. 所有標(biāo)本均野外采集后保存于無(wú)水乙醇中，并長(zhǎng)期貯存于實(shí)驗(yàn)室超低溫冰箱(-80 ℃). 標(biāo)本的形態(tài)鑒定工作由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)李保平教授幫助完成.

1.2 總DNA提取

本實(shí)驗(yàn)主要選取隆X小車蝗的后足肌肉組織，使用吸附式DNA提取試劑盒(TransGen)提取分析樣本的基因組總DNA. 使用NanoDrop 2000微量核酸/蛋白分析儀檢測(cè)提取的總DNA的濃度和質(zhì)量(純度). 對(duì)檢測(cè)合格的模板進(jìn)行稀釋并分裝，DNA樣品置于超低溫冰箱保存待用.

1.3 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

本實(shí)驗(yàn)選擇了5對(duì)直翅目昆蟲(chóng)線粒體基因組通用引物[17,18]，將已擴(kuò)增片段作為上下游序列，使用軟件Premier 5設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增通用引物無(wú)法得到的片段，進(jìn)而獲取線粒體基因組全長(zhǎng)序列[19]. 本研究選用擴(kuò)增效率較高的ExTaq酶進(jìn)行擴(kuò)增，且總反應(yīng)體系為25 μL. PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?3 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，45～60 ℃(根據(jù)引物而定)退火30 s，72 ℃延伸1 min(根據(jù)產(chǎn)物長(zhǎng)度而定，擴(kuò)增效率為1 min/kb)，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；98 ℃變性10 s，72 ℃延伸1 min(根據(jù)產(chǎn)物長(zhǎng)度而定，擴(kuò)增效率為1 min/kb)，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸7 min；4 ℃結(jié)束并保存. PCR擴(kuò)增所得產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶單一、清晰且大小與本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的擴(kuò)增產(chǎn)物一致后，直接將PCR產(chǎn)物送至金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序.

1.4 線粒體基因組組裝、注釋及分析

測(cè)序結(jié)果首先利用NCBI中的Blastn進(jìn)行序列相似性比對(duì)，以確保所得序列為該物種的線粒體基因組序列. 隨后使用DNASTAR軟件中的SeqMan將測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接[20]. 最后，使用Geneious軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果重疊組裝驗(yàn)證[21]. 拼接完整的線粒體基因組序列使用在線軟件MITOS進(jìn)行初步注釋[22]. 蛋白編碼基因的起始位置利用近緣種參考序列進(jìn)行手動(dòng)校正. 使用ARWEN和tRNAscan-SE兩個(gè)軟件預(yù)測(cè)tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)[23,24]. 基因間隔、基因重疊以及AT富集區(qū)通過(guò)MEGA比對(duì)確定[25]. 線粒體基因組結(jié)構(gòu)圖通過(guò)在線軟件OGDRAW(https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html)繪制. 使用PhyloSuite和MEGA統(tǒng)計(jì)和分析堿基組分、密碼子使用和同義密碼子使用頻率[25,26]. 核苷酸組分的偏好性，即AT偏好性和GC偏好性的計(jì)算公式為：AT-skew = (A-T)/(A+T)和GC-skew = (G-C)/(G+C)[27].

1.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

為探究隆X小車蝗在斑翅蝗亞科中的分類地位及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，下載Genbank中的22個(gè)斑翅蝗亞科物種，并選取槌角蝗亞科Gomphocerinae的2個(gè)物種作為外群，重建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù). 使用PhyloSuite對(duì)13個(gè)蛋白編碼基因依次進(jìn)行提取、比對(duì)、修剪、串聯(lián)、數(shù)據(jù)分區(qū)和模型選擇[28]. 利用RAxML和MrBayes分別構(gòu)建ML樹(shù)(Maximum Likelihood)和BI樹(shù)(Bayesian Inference)[29,30]. 最后，使用Figtree 1.4對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行美化[31].

2 結(jié) 果

2.1 隆X小車蝗線粒體基因組結(jié)構(gòu)

隆X小車蝗線粒體基因組為全長(zhǎng)15 746 bp的閉合環(huán)狀雙鏈DNA結(jié)構(gòu)(GenBank登錄號(hào)：MK352098). 該線粒體全基因組共由37個(gè)典型的基因組成，包含13個(gè)蛋白編碼基因(PCGs)，22個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNAs)，2個(gè)核糖體RNA(rRNA)以及1個(gè)主要的非編碼AT富集區(qū)(AT-rich region). 其中23個(gè)基因由J鏈(Majority strand，J-strand)編碼，包括9個(gè)PCGs和14個(gè)tRNAs；其余14個(gè)基因由N鏈(Minority strand，N-strand)編碼，包括4個(gè)PCGs、8個(gè)tRNAs和2個(gè)rRNAs(見(jiàn)圖1，表1). 與假定的祖先昆蟲(chóng)亞庫(kù)巴果蠅Drosophilayakuba線粒體基因組相比，2個(gè)tRNAs的位置在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生顛倒，即基因排列順序發(fā)生變化，由tRNALys—tRNAAsp重排為tRNAAsp—tRNALys.

圖1 隆X小車蝗線粒體基因組結(jié)構(gòu)

表1 隆X小車蝗線粒體基因組的注釋和基因結(jié)構(gòu)

2.2 隆X小車蝗線粒體基因組堿基組成

隆X小車蝗線粒體全基因組及其不同類型基因和AT富集區(qū)的核苷酸組分由MEGA分析統(tǒng)計(jì). 結(jié)果顯示，該線粒體全基因組的堿基組分為：A=45.09%，T=30.31%，G=10.03%，C=14.58%；A+T總含量為75.40%. PCGs，tRNAs，rRNAs和AT富集區(qū)的A+T含量分別為：74.27%，74.10%，77.11%，86.31%. 除此之外，隆X小車蝗線粒體基因組全序列、tRNAs和AT富集區(qū)呈現(xiàn)AT偏斜，全線粒體基因組,PCGs,tRNAs和AT富集區(qū)呈現(xiàn)CG偏斜.

2.3 隆X小車蝗線粒體基因組蛋白編碼基因

隆X小車蝗線粒體基因組13個(gè)PCGs總長(zhǎng)度為11 173 bp，約占全序列的70.96%，其中ATP8(156 bp)序列最短，ND5(1 714 bp)序列最長(zhǎng). ND1,ND4,ND4L和ND5等4個(gè)基因由N鏈編碼，其余9個(gè)基因由J鏈編碼(見(jiàn)表1). 13個(gè)基因均起始于典型的ATN密碼子(ATA，ATG，ATC，ATT)，其中7個(gè)基因以ATG作為起始密碼子. 終止密碼子方面，10個(gè)基因是以TAN(3個(gè)基因?yàn)門(mén)AG，8個(gè)基因?yàn)門(mén)AA)為終止密碼子，而COI,COII和ND5終止于不完整的密碼子T. 除終止密碼子外，共編碼3 714個(gè)氨基酸. 使用頻數(shù)最多的密碼子是AUU，共331次(RSCU=1.72)(圖2). 隆X小車蝗線粒體基因組所有蛋白質(zhì)的氨基酸組成中異亮氨酸Isoleucine(Ile)，亮氨酸Leucine 2(Leu 2)和苯丙氨酸Phenylalanine(Phe)數(shù)量相對(duì)較多.

圖2 隆X小車蝗線粒體基因組蛋白編碼基因同義密碼子相對(duì)使用度

2.4 隆X小車蝗線粒體基因組tRNA基因和rRNA基因

隆X小車蝗線粒體基因組包含全部22個(gè)典型的tRNA基因，其中有2個(gè)氨基酸包含兩組同功受體(Leucine和Serine). 所有tRNA長(zhǎng)度在64～71 bp之間，序列最長(zhǎng)的是tRNASer(UCN)，tRNALys和tRNAVal，最短的是tRNAArg. 利用MITOS預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示，21個(gè)tRNAs都能夠形成典型的三葉草結(jié)構(gòu)，具有完整的氨基酸接受臂、雙氫尿嘧啶(DHU)臂和TΨC臂，而tRNASer(AGN)由于缺少一個(gè)穩(wěn)固的雙氫尿嘧啶(DHU)臂而無(wú)法形成三葉草結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖3). 除了正常的堿基配對(duì)外，在預(yù)測(cè)的tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)中共發(fā)現(xiàn)24個(gè)堿基錯(cuò)配的情況，其中G—U錯(cuò)配比較常見(jiàn)，共出現(xiàn)19對(duì).

圖3 隆X小車蝗線粒體基因組tRNA基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)

隆X小車蝗線粒體基因組包含2個(gè)與其他蝗蟲(chóng)序列具有同源性的rRNAs，分別是大亞基12S和大亞基16S. 12S的長(zhǎng)度為828 bp，位于tRNAVal和AT富集區(qū)之間，16S長(zhǎng)度為1 317 bp，位于tRNALeu(CUN)和tRNAVal之間.

2.5 隆X小車蝗線粒體基因組非編碼區(qū)

隆X小車蝗線粒體基因組共測(cè)得16個(gè)基因間隔區(qū)，長(zhǎng)度為1～21 bp；且基因排列緊湊，共發(fā)現(xiàn)11個(gè)基因重疊區(qū)，長(zhǎng)度為1～8 bp. 在基因ATP8與ATP6之間發(fā)現(xiàn)保守的重疊序列ATGATAA，在基因ND4與ND4L之間發(fā)現(xiàn)保守的重疊序列TTAACAT. 除此之外，隆X小車蝗線粒體基因組含有一段長(zhǎng)的非編碼區(qū)(891 bp)，即為AT富集區(qū)或稱控制區(qū)，位于tRNASer(UCN)和ND1之間，A+T含量為86.31%，表現(xiàn)出明顯的AT堿基偏向性.

2.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

為明確隆X小車蝗在斑翅蝗亞科中的系統(tǒng)發(fā)育地位，我們選擇25個(gè)物種(Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)已提交的22個(gè)斑翅蝗亞科物種+1個(gè)新測(cè)物種+2個(gè)槌角蝗亞科外群)分別構(gòu)建最大似然樹(shù)(ML)和貝葉斯樹(shù)(BI). 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)以PCG數(shù)據(jù)集(13 PCGs，11 082 bp)來(lái)構(gòu)建. 結(jié)果表明BI樹(shù)的節(jié)點(diǎn)支持率總是高于ML樹(shù)、且兩種分析方法所得到的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)完全一致(見(jiàn)圖4). 系統(tǒng)發(fā)育分析均支持小車蝗屬Oedaleus為單系群，即該屬4個(gè)物種聚為一支. 同時(shí)，系統(tǒng)樹(shù)顯示小車蝗屬物種與云斑車蝗Gastrimargusmarmoratus(車蝗屬)為姐妹群，再與飛蝗屬Locusta聚在一起，由于車蝗屬目前僅僅只有1個(gè)物種具有線粒體基因組，此發(fā)育關(guān)系仍需要更多的取樣物種來(lái)驗(yàn)證. 在小車蝗屬內(nèi)部，隆X小車蝗與亞洲小車蝗Oedaleusasiaticus互為姐妹群，黃脛小車蝗Oedaleusinfernalis和紅脛小車蝗Oedaleusmanjius互為姐妹群. 具體的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系如下：((隆X小車蝗+亞洲小車蝗)+(黃脛小車蝗+紅脛小車蝗)).

圖4 基于13個(gè)蛋白編碼基因序列構(gòu)建的斑翅蝗亞科系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3討 論

直翅目昆蟲(chóng)的線粒體基因組和其他昆蟲(chóng)一樣為閉合雙鏈DNA，包含典型的37個(gè)基因：13個(gè)蛋白編碼基因，22個(gè)tRNA基因和2個(gè)rRNA基因. 目前已發(fā)表的直翅目昆蟲(chóng)完整線粒體基因組長(zhǎng)度為14 957 bp(蜢總科，Pseudothericlescompressifrons，KM657335)到17 033 bp(中華華綠螽Sinochlorasinensis，MK903598). 本研究所測(cè)的隆X小車蝗的線粒體全基因組為15 746 bp，介于直翅目線粒體基因組長(zhǎng)度范圍之內(nèi)，與已發(fā)表的斑翅蝗亞科昆蟲(chóng)線粒體全基因組大小十分接近. 與假定的祖先昆蟲(chóng)線粒體基因組相比，隆X小車蝗的2個(gè)tRNAs在進(jìn)化過(guò)程中位置發(fā)生顛倒，由tRNALys—tRNAAsp重排為tRNAAsp—tRNALys. 目前，對(duì)造成基因重排現(xiàn)象的解釋有很多種，如重組、復(fù)制隨機(jī)刪除模型、復(fù)制非隨機(jī)丟失模型以及由tRNA基因錯(cuò)誤起始引起的復(fù)制等. tRNAAsp—tRNALys重排在蝗下目昆蟲(chóng)中非常保守，可以用復(fù)制隨機(jī)刪除模型解釋. 早期研究認(rèn)為該重排模式可能是蝗下目Acrididea重要的進(jìn)化特征，可為后續(xù)開(kāi)展該類昆蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育研究提供假定的靶標(biāo)[32]. 系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果均顯示小車蝗屬與車蝗屬為姐妹群，而后與飛蝗屬聚為一支. 該系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與利用單個(gè)基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果并一致[33]，可能的原因是在我們的研究中車蝗屬僅有一個(gè)代表物種. 小車蝗屬4個(gè)種聚為一支且4個(gè)物種的進(jìn)化關(guān)系為((隆X小車蝗+亞洲小車蝗)+(黃脛小車蝗+紅脛小車蝗)). 即在小車蝗屬中隆X小車蝗和亞洲小車蝗親緣關(guān)系較近，該結(jié)果支持傳統(tǒng)的形態(tài)分類和基于單個(gè)基因的系統(tǒng)發(fā)育分析[16]. 如需進(jìn)一步明確小車蝗屬、車蝗屬和飛蝗屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，更多的物種取樣和線粒體基因組序列需要補(bǔ)充.