谷氨酸棒桿菌中烷基過(guò)氧化物還原酶(CgAhp)抵御環(huán)境脅迫的作用機(jī)制*

李海燕, 胡夢(mèng)蝶, 劉 洋, 時(shí)玉珠, 廖鑫鳴, 司美茹

(曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,273165,山東省曲阜市)

0 引 言

活性氧(ROS)是光合作用和呼吸代謝等正常代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有毒副產(chǎn)物,受到氧化劑、低pH值、重金屬、高溫、聯(lián)胺(diamide)和抗生素等不利環(huán)境刺激的誘導(dǎo)[1]. 活性氧是一種高反應(yīng)性分子,如過(guò)氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(O2·-)和有機(jī)過(guò)氧化物等,能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)、DNA和細(xì)胞膜進(jìn)行修飾并造成不同程度的損傷,甚至導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)破壞并引發(fā)氧化應(yīng)激[2]. 在一定條件下活性蛋白結(jié)構(gòu)的改變或由于蛋白活性需要巰基的特異性氧化,2個(gè)半胱氨酸巰基之間形成二硫鍵使蛋白失活[3]. 為了對(duì)抗ROS毒性,細(xì)胞產(chǎn)生各種抗氧化酶,以持續(xù)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的變化并促進(jìn)蛋白的正確折疊[4].

ROS的酶清除系統(tǒng)涉及不同細(xì)胞區(qū)室中的許多酶催化反應(yīng). 從古細(xì)菌、低等原核生物到高等真核生物中發(fā)現(xiàn)基于硫醇的過(guò)氧化物酶構(gòu)成了一個(gè)大家族,包括過(guò)氧化物酶(Prx)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)和有機(jī)醇過(guò)氧化物酶(Ohr)[5,6]. 基于硫醇的過(guò)氧化物酶通過(guò)保守的活性半胱氨酸殘基代謝過(guò)氧化物時(shí),這些殘基會(huì)發(fā)生氧化. 為了完成催化循環(huán),必須對(duì)半胱氨酸殘基進(jìn)行還原. 這些過(guò)氧化物酶依賴不同的還原系統(tǒng),包括烷基氫過(guò)氧化物還原酶亞基F(AhpF)；硫氧還蛋白(Trx)和硫氧還蛋白還原酶(TrxR)；分枝硫醇氧化還原酶(Mrx1)、硫醇二硫化物交換蛋白類分枝硫醇氧化還原酶(DsbA-like Mrx1)、分枝硫醇還原酶(Mtr)、分枝硫醇(MSH)；烷基過(guò)氧化物還原酶D(AhpD)、二氫硫辛酰胺脫氫酶(Lpd)、二氫硫辛酰胺琥珀酰轉(zhuǎn)移酶(SucB)[7,8]等. 氧化過(guò)氧化物酶二硫氧化還原酶,如AhpF,Trx,Mrx1,DsbA-like Mrx1和AhpD,是還原系統(tǒng)的核心成員,直接與氧化過(guò)氧化物酶相互作用并將電子轉(zhuǎn)移到氧化過(guò)氧化物酶.

由4種不同亞單位AhpC,AhpD,AhpE和AhpF組成的烷基過(guò)氧化物還原酶Ahp是一類二硫鍵氧化還原酶的已知成員[9],也是具有傳播自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和直接解毒ROS能力的巰基依賴性Prx家族的成員[10]. 細(xì)菌中的AhpC和AhpE催化H2O2、叔丁基過(guò)氧化氫(t-BHP)、異丙苯過(guò)氧化氫(CHP)和過(guò)氧亞硝酸鹽的還原[11,12]. AhpF是一種具有氧化還原酶活性的黃素蛋白,可將氧化的AhpC還原為還原形式[8]. 在一些不含ahpF的細(xì)菌中,ahpD與ahpC或ahpF都沒(méi)有序列相似性,但在分枝桿菌和除蟲鏈霉菌中起到與ahpF類似的作用[9].因此,ahp的表達(dá)在氧化應(yīng)激中起重要作用. 谷氨酸棒桿菌是一種工業(yè)重要的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌,它含有3種Ahp同系物[NCgl2286(AhpD1),NCgl2349(AhpD2),NCgl0877(假定的Ahp)][13]. 谷氨酸棒桿菌AhpD1和AhpD2能協(xié)同Lpd/SucB/NADH系統(tǒng)通過(guò)自身活性位點(diǎn)二硫醇再生多種硫醇依賴性過(guò)氧化物酶[14],但有關(guān)NCgl0877的研究很少. 最近,Si等人發(fā)現(xiàn)NCgl0877是OsaR(有機(jī)過(guò)氧化物和抗生素敏感調(diào)節(jié)劑)的主要靶點(diǎn)之一,而OsaR參與氧化應(yīng)激反應(yīng)[15]. NCgl0877具有Cys-Pro-Gly-Cys(C-P-G-C)活性位點(diǎn),與AhpDs中的C-G-T-C或C-V-Y-C不同. 前期研究發(fā)現(xiàn),CXXC基序中半胱氨酸之間的2個(gè)中間殘基的差異會(huì)引起過(guò)氧化物酶二硫鍵還原酶的酶促反應(yīng)速度和底物偏好特性不同[16]. 因此,新C-P-G-C活性位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)促使研究NCgl0877(即CgAhp)在谷氨酸棒桿菌抗氧化中的作用.

1 材料與方法

1.1 菌株和生長(zhǎng)條件

本研究使用的菌株和質(zhì)粒列于表1[17,18]. 采用Luria-Bertani(LB)肉湯和平板分別在37 ℃和30 ℃下培養(yǎng)大腸桿菌或谷氨酸棒桿菌RES167. 根據(jù)司美茹[4]的方法制備Δcgahp基因缺失菌株和相應(yīng)互補(bǔ)菌株. 含500 mM山梨糖醇(BHIS)的腦心浸液肉湯培養(yǎng)基用于產(chǎn)生和維持谷氨酸棒桿菌RES167中基因的突變體[19]. 在培養(yǎng)基中加入0.5 mM異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(Sigma-Aldrich)誘導(dǎo)互補(bǔ)菌株中pXMJ19-cgahp衍生物上cgahp基因的表達(dá). 大腸桿菌DsbA來(lái)自廣東深圳市鑫博生生物科技有限公司. 抗生素添加濃度為：卡那霉素,大腸桿菌50 μg/mL,谷氨酸棒桿菌25 μg/mL；萘啶酮酸,谷氨酸棒桿菌40 μg/mL；氯霉素,大腸桿菌20 μg/mL,谷氨酸棒桿菌10 μg/mL.

表1 菌株、質(zhì)粒和引物

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

本研究使用的引物如表1所示. 采用引物對(duì)Ocgahp-F和Ocgahp-R從谷氨酸棒桿菌 RES167基因組DNA中擴(kuò)增出谷氨酸棒桿菌cgahp基因(ncgl0877)區(qū)域并克隆到EcoRI和XhoI位點(diǎn)之間的pET28a載體中,得到pET28a-cgahp.

利用引物對(duì)Dcgahp-F1/Dcgahp-R1和Dcgahp-F2/Dcgahp-R2采用兩步重疊PCR方法構(gòu)建讀碼框缺失483-bp的DNA片段,并進(jìn)行雙酶切插入自殺質(zhì)粒pK18mobsacB中獲得pK18mobsacB-Δcgahp[20].

利用引物對(duì)Ccgahp-F/Ccgahp-R從谷氨酸棒桿菌基因組DNA中擴(kuò)增cgahp基因開(kāi)放閱讀框區(qū)DNA片段,獲得pXMJ19-cgahp. 將得到的DNA片段用SalI和BamHI進(jìn)行剪切,然后克隆到SalI和BamHI位點(diǎn)之間的pXMJ19載體上.

1.3 重組蛋白的過(guò)表達(dá)和純化

將BL21(DE3)(pET28a-cgahp)菌株在含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行37 ℃、220 rpm振蕩培養(yǎng). 當(dāng)OD600 nm為0.6時(shí),加入0.5 mM IPTG,22 ℃培養(yǎng)10 h后,4 ℃離心收集細(xì)胞. 細(xì)胞顆粒懸浮在30 mL裂解緩沖液中[10 mM Tris(pH 6.8),10%甘油和10 mM β-巰基乙醇(β-ME)]經(jīng)超聲處理,10 000×g離心60 min. 用His?Bind Ni-NTA樹(shù)脂(Novagen,Madison,WI)純化上清中的目標(biāo)蛋白. 純化的His6-tag蛋白在4 ℃下用PBS透析濃縮,用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)[通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)估計(jì)純度大于95%].

1.4 氧化劑、烷化劑、重金屬和還原劑敏感性檢測(cè)

根據(jù)Rawat等人[21]的研究,采用紙片擴(kuò)散對(duì)菌株的藥劑敏感性進(jìn)行分析. 取100 μL對(duì)數(shù)中期的培養(yǎng)物(約107cfu)涂在LB平板上,然后將10 μL試劑原液浸泡過(guò)的濾紙片輕輕放于LB平板上. 試劑原液為200 mM H2O2,0.5 mM次氯酸(HClO),5 mM diamide,11 mM CHP,60 mMt-BHP,70 mM 1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB),1 mM碘乙酰胺(IAM),25 mg/mL鏈霉素(STR),5 mg/mL環(huán)丙沙星(CIP),0.5 mM氯化鎘(CdCl2)和10 mM硫酸鎳(NiSO4). 在30 ℃下孵育2～3 d,測(cè)量抑菌圈的直徑. 實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3個(gè)獨(dú)立生物學(xué)重復(fù).

1.5 氧化型CgAhp-S2的體外制備

根據(jù)Van Laer等人[22]的方法制備氧化型CgAhp-S2(含分子內(nèi)二硫鍵的CgAhp).

1.6 TrxR/NADPH,MSH/Mtr/NADPH和Lpd/SucB/NADH途徑氧化CgAhp-S2的穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)研究

在340 nm(ε340=of 6220 M-1cm-1)處連續(xù)監(jiān)測(cè)TrxR/NADPH、MSH/Mtr/NADPH或Lpd/SucB/NADH途徑中NADPH或NADH作用的氧化型CgAhp-S2依賴性氧化,反應(yīng)混合物為300 μL,含有50 mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5),1 mM EDTA,不同濃度的氧化型CgAhp-S2和可能作為電子供體的還原Trx生成系統(tǒng)[5 μM TrxR、40 μM Trx、300 μM NADPH]、MSH系統(tǒng)[5 μM Mtr,500 μM MSH,300 μM NADPH]或Lpd系統(tǒng)[5 μM Lpd,5 μM SucB,300 μM NADH]. 反應(yīng)均于37 ℃進(jìn)行. 在于37 ℃溫育3 min后的反應(yīng)混合物中加入氧化型CgAhp-S2開(kāi)啟反應(yīng). 以不含CgAhp-S2作為對(duì)照.kcat和Km值通過(guò)GraphPad Prism 5程序?qū)ichaelis-Menten方程進(jìn)行非線性擬合獲得.

1.7 CgAhp協(xié)同Lpd/SucB/NADH電子途徑還原過(guò)氧化物酶活性測(cè)定

參照王建波等人[18]的方法進(jìn)行活性測(cè)定.

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)分析是通過(guò)成對(duì)的雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)確定的. 用GraphPad Prism Software進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(GraphPad Software,San Diego California USA).

2 結(jié)果與討論

2.1 CgAhp的特性

谷氨酸棒桿菌ncg10877基因位于bp 969458至969940之間,編碼由160個(gè)氨基酸殘基組成的假定Ahp,分子量為18.0 kDa. 如圖1所示,NCgl0877蛋白與Achromobacterxylosoxidans、Nitrosococcuswatsonii,Citrobacterfreundii,Simplicispirasuum和CandidatusNitrosoglobus中Ahp的Cys-XX-Cys活性位點(diǎn)氨基酸序列相似性分別為51.3%、53.9%、52.9%、50.0%和52.4%.

圖1 CgAhp與其他生物體中Ahp的多序列比對(duì)

迄今為止,Ahp蛋白根據(jù)功能特征分為2類：二硫化物氧化還原酶包括2-Cys AhpD和1-Cys AhpF,以及巰基過(guò)氧化物酶家族的Prx,包括AhpC和AhpE[10,23]. 根據(jù)氨基酸序列,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)谷氨酸棒桿菌的NCgl0877與2-Cys AhpD共享一個(gè)高度保守的Cys-X-X-Cys(C-X-X-C)催化特征基序,這與具有2個(gè)活性半胱氨酸的過(guò)氧化物酶不同,例如AhpC這一過(guò)氧化物(如圖1B). AhpC通過(guò)保守的N末端半胱氨酸殘基(Cp)分解過(guò)氧化物而被氧化. 為了完成催化循環(huán),氧化性Cp會(huì)被C端半胱氨酸殘基CR還原,導(dǎo)致AhpC形成分子內(nèi)二硫鍵[12,24]. 2-Cys AhpD通過(guò)Cys-X-X-Cys活性位點(diǎn)的N端和C端Cys將氧化的過(guò)氧化物酶恢復(fù)為還原態(tài)[14]. 因此,推測(cè)谷氨酸棒桿菌的NCgl0877可能作為氧化態(tài)過(guò)氧化物酶的還原酶,而不是充當(dāng)過(guò)氧化物酶.

根據(jù)CXXC催化基序,迄今為止報(bào)道的谷氨酸棒桿菌過(guò)氧化物酶的還原酶可以分為7種：Trx[Cys-Gly-Pro-Cys(C-G-P-C)],Mrx1[Cys-Pro-Tyr-Cys(C-P-Y-C)],AhpD[Cys-Gly-Thr-Cys(C-G-T-C),Cys-Val-Tyr-Cys(C-V-Y-C)],DsbA-like Mrx1[Cys-Pro-Phe-Cys(C-P-F-C)],NrdH[Cys-Val-Gln-Cys(C-V-Q-C)]和Mrx3 [Cys-Gly-Ser-Cys(C-G-S-C)](如圖1B). NCgl0877形成了1個(gè)新的種類,保留了Cys-Pro-Gly-Cys(C-P-G-C)活性位點(diǎn). 此外如圖1B所示,NCgl0877的CXXC 催化基序中2個(gè)半胱氨酸之間的殘基與Mrx1(C-P-Y-C)和DsbA-like Mrx1(C-P-F-C)更相似,而與AhpD(C-G-T-C或C-V-Y-C)不同. 以前的研究表明,催化CXXC基序中2個(gè)半胱氨酸間插入殘基的差異導(dǎo)致二硫鍵氧化還原酶具有不同的酶促反應(yīng)速率和底物偏好特性[16]. 因此,新型C-P-G-C活性位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)促使研究谷氨酸棒桿菌NCgl0877. 根據(jù)其類似于二硫化物氧化還原酶的活性行為,將其命名為CgAhp.

2.2 cgahp的缺失突變體對(duì)有機(jī)過(guò)氧化物脅迫敏感

最近,Si等人發(fā)現(xiàn)谷氨酸棒桿菌的cgahp基因是OasR的主要靶點(diǎn)之一,它與谷氨酸棒桿菌的氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)[15]. 因此,推測(cè)CgAhp也可能在氧化應(yīng)激中發(fā)揮作用. 為了了解CgAhp在氧化應(yīng)激抗性反應(yīng)中的生理功能,通過(guò)同源重組基因敲除獲得的谷氨酸棒桿菌 RES167 菌株中cgahp缺失突變體,并以紙片擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)測(cè)定其抗ROS的表型. 如圖2所示,由帶有氧化應(yīng)激誘導(dǎo)試劑的紙片(φ=5 mm)引起的含有高拷貝數(shù)空質(zhì)粒pXMJ19的谷氨酸棒桿菌RES167親本菌株(該菌株命名為WT)、Δcgahp(pXMJ19)突變株(缺乏cgahp基因的菌株含有空的pXMJ19)和Δcgahp(pXMJ19-cgahp)(Δcgahp被攜帶野生型cgahp基因的質(zhì)粒補(bǔ)充)的抑制區(qū)直徑(cm). 點(diǎn)圖顯示了每種試劑的3個(gè)樣本的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差. 插圖顯示了正常條件下菌株的生長(zhǎng)曲線. 通過(guò)在指定時(shí)間點(diǎn)測(cè)量A600來(lái)監(jiān)測(cè)LB中指定菌株的生長(zhǎng).

圖2 谷氨酸棒桿菌的Δcgahp菌株對(duì)有機(jī)過(guò)氧化物脅迫更敏感

在正常生長(zhǎng)條件下CgAhp被認(rèn)為在谷氨酸棒桿菌RES167中是非必需的,但與WT(pXMJ19)菌株(含有空質(zhì)粒pXMJ19的野生型谷氨酸棒桿菌菌株)相比,Δcgahp(pXMJ19)菌株(含pXMJ19空質(zhì)粒且缺失cgahp的突變體)對(duì)CHP和t-BHP的耐受性降低,其抑菌圈明顯大于WT(pXMJ19)菌株. 為了證實(shí)其敏感性是由于缺少cgahp基因造成的,將含有野生型谷氨酸棒桿菌cgahp基因的質(zhì)粒pXMJ19引入Δcgahp缺失突變體中,構(gòu)建互補(bǔ)菌株Δcgahp(pXMJ19-cgahp),并進(jìn)行互補(bǔ)實(shí)驗(yàn). 如圖2所示,互補(bǔ)菌株Δcgahp(pXMJ19-cgahp)在CHP和t-BHP下產(chǎn)生明顯小的抑菌圈,與WT(pXMJ19)菌株相當(dāng),其抗性表型幾乎完全在Δcgahp(pXMJ19-cgahp)菌株中恢復(fù). 然而WT(pXMJ19)、Δcgahp(pXMJ19)和Δcgahp(pXMJ19-cgahp)菌株在H2O2、HClO,diamide,CDNB,IAM,STR,CIP,CdCl2和NiSO4脅迫下無(wú)顯著性差異. 因此,CgAhp參與抗有機(jī)過(guò)氧化物脅迫的過(guò)程.

2.3 氧化型CgAhp優(yōu)先利用Lpd/SucB/NADH電子途徑再生

谷氨酸棒桿菌通過(guò)MSH/Mtr/NADPH系統(tǒng)、TrxR/NADPH系統(tǒng)和Lpd/SucB/NADH系統(tǒng)3種普遍存在的電子轉(zhuǎn)移途徑來(lái)還原氧化還原酶活性位點(diǎn)半胱氨酸之間的二硫鍵,為了確定可能與氧化CgAhp還原耦聯(lián)的電子供體途徑. 首先用聯(lián)胺制備CgAhp-S2,其活性位點(diǎn)半胱氨酸之間有單個(gè)二硫鍵(CgAhpox). 再添加CgAhp-S2作為電子轉(zhuǎn)移途經(jīng)的底物測(cè)定穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué).

圖3 氧化的CgAhp-S2優(yōu)選通過(guò)Lpd/SucB/NADH途徑還原

使用GraphPad Prism 5程序,通過(guò)Michaelis-Menten穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)評(píng)估MSH/Mtr/NADPH(A),TrxR/NADPH(B)或Lpd/SucB/NADH(C)途徑對(duì)氧化型CgAhp-S2的還原. 數(shù)據(jù)表示為3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD表示. 將不同濃度的氧化CgAhp-S2與預(yù)培養(yǎng)的反應(yīng)混合物混合.

如圖3所示,CgAhp-S2對(duì)于MSH/Mtr/NADPH,TrxR/NADPH或Lpd/SucB/NADH電子供體途徑的Km值、Kcat值和催化系數(shù)分別為12.51±2.37 μM,0.03±0.002 s-1和(2.39±0.08)×103M-1s-1,4.85±0.89 μM,0.11±0.01 s-1和(2.27±0.13)×104M-1s-1,1.21±0.13 μM,19.61±0.39 s-1和(1.63±0.04)×107M-1s-1. 雖然CgAhp-S2可通過(guò)上述3種電子途徑被還原,但CgAhp-S2與Lpd/SucB/NADH途徑的催化系數(shù)比TrxR/NADPH和MSH/Mrt/NADPH途徑的催化系數(shù)高幾個(gè)數(shù)量級(jí),表明CgAhp-S2更傾向于Lpd/SucB/NADH途徑. 因此,CgAhp-S2主要通過(guò)Lpd/SucB/NADH還原系統(tǒng)來(lái)還原,這與Su等人針對(duì)谷氨酸棒桿菌AhpDs報(bào)告的結(jié)果一致[14].

2.4 CgAhp協(xié)同Lpd/SucB/NADH電子途徑還原過(guò)氧化物酶

為確定CgAhp是否能夠再生硫醇依賴性過(guò)氧化物酶,在飽和濃度的過(guò)氧化物和不同濃度的CgAhp(0～500 μM)下,協(xié)同CgAhp/Lpd/SucB/NADH還原系統(tǒng)進(jìn)行了過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定.

表2 CgAhp具有硫醇依賴性過(guò)氧化物酶還原能力

通過(guò)CgAhp系統(tǒng)(0～500 μM CgAhp,5 μM Lpd,和5 μM SucB)對(duì)過(guò)氧化物(500 μM的MPx and Prx,或1 mM的Ohr和OsmC)和過(guò)氧化物酶(0.5 μM MPx和Prx,或0.1 μM Ohr和OsmC)進(jìn)行過(guò)氧化物酶測(cè)定. 數(shù)據(jù)為3次獨(dú)立測(cè)定值的平均值,并使用GraphPad Prism 5程序進(jìn)行非線性回歸分析. ND表示在使用的條件下沒(méi)有可檢測(cè)到的活性.

如表2所示,MPx協(xié)同CgAhp/Lpd/SucB/NADH系統(tǒng)對(duì)CHP的Kcat和Km值分別為4.11±0.53 s-1和28.92±0.31 μM. 獲得催化效率14.27×104M-1s-1與谷氨酸棒桿菌中AhpD2對(duì)MPx(約34.7× 104M-1s-1)的數(shù)據(jù)相似[14]. 在以CgAhp/Lpd/SucB/NADH體系為電子受體還原Prx、Ohr和OsmC中也觀察到類似的結(jié)果. CgAhp/Lpd/SucB/NADH系統(tǒng)中Prx、Ohr和OsmC對(duì)CHP的催化效率分別為9.3×104M-1s-1,106.9×104M-1s-1和186.3×104M-1s-1. 雖然CgAhp/Lpd/SucB/NADH系統(tǒng)在以H2O2為底物時(shí)支持MPx和Prx的過(guò)氧化物酶活性,但催化活性相對(duì)低. 當(dāng)H2O2作為底物時(shí),CgAhp/Lpd/SucB/NADH還原系統(tǒng)對(duì)Ohr和OsmC活性的促進(jìn)作用非常差,這與Si等人分別報(bào)導(dǎo)的谷氨酸棒桿菌中僅有且主要是用于有機(jī)過(guò)氧化物解毒的Ohr和OsmC的結(jié)果相一致[25,26]. 與谷氨酸棒桿菌AhpD1和AhpD2一樣,CgAhp具有更廣泛的還原能力[14]. 它不僅能再生有機(jī)過(guò)氧化物解毒過(guò)氧化物酶,還能再生無(wú)機(jī)過(guò)氧化物解毒過(guò)氧化物酶. 盡管先前的研究表明Ohr和OsmC可以采用Trx再生系統(tǒng)還原底物CHP(Ohr和OsmC的催化效率分別為10×104M-1s-1和21.2×104M-1s-1),但它們?cè)隗w外對(duì)CgAhp的親和力高于Trx. 這些數(shù)據(jù)表明CHP而非H2O2作為底物時(shí),CgAhp/Lpd/SucB/NADH系統(tǒng)更有效地支持Ohr和OsmC的活性. 此外,CgAhp優(yōu)先支持Ohr和OsmC的活性. 當(dāng)使用CHP作為底物時(shí),MPx和Prx在CgAhp/Lpd/SucB/NADH體系中的催化效率顯著低于谷氨酸棒桿菌MPx和Prx在Trx體系中的催化效率(MPx,58.5×104M-1s-1；Prx,264.1×104M-1s-1)[27,28],比谷氨酸棒桿菌Ohr和OsmC催化CgAhp/Lpd/SucB/NADH體系的反應(yīng)低約8～20倍. 綜上所述,CgAhp優(yōu)選還原依賴NADH的過(guò)氧化物酶Ohr和OsmC；CgAhp具有更廣泛的還原能力；CgAhp是一種重要的胞質(zhì)烷基過(guò)氧化氫氧化還原酶,參與過(guò)氧化物酶的再生.

3 結(jié) 語(yǔ)

在本研究中,通過(guò)生理生化分析揭示了一種新的烷基過(guò)氧化氫還原酶CgAhp. CgAhp增強(qiáng)了谷氨酸棒桿菌對(duì)有機(jī)過(guò)氧化物脅迫的抗性. CgAhp優(yōu)先通過(guò)耦聯(lián)Lpd/SucB/NADH電子途徑,將各種氧化態(tài)過(guò)氧化物酶還原. 另外,CgAhp能更有效地支持有機(jī)過(guò)氧化物清除酶Ohr和OsmC的活性. 因此,CgAhp屬于二硫化物氧化還原酶的成員,而不是硫醇特異性抗氧化蛋白過(guò)氧化物酶家族的成員. 簡(jiǎn)而言之,本研究首次證明具有一個(gè)新的C-P-G-C活性位點(diǎn)的CgAhp代表了一類類似AhpD的分子,主要通過(guò)維持Ohr和OsmC的過(guò)氧化物酶活性來(lái)實(shí)現(xiàn)谷氨酸棒桿菌的抗氧化防御. 同時(shí)本研究為其他生物體類似酶的正確分類鋪平了道路,并擴(kuò)大了二硫化物氧化還原酶的類型.