大孔樹脂分離純化嘉蘭種子提取物中秋水仙堿的工藝研究*

劉建文，張寶蓉，莊燕琴,2，龔云麒，劉軍鋒

（1.昆藥集團(tuán)股份有限公司，云南 昆明 650100；2.云南省食品藥品審核查驗(yàn)中心，云南 昆明 650100）

嘉蘭（Gloriosa superba Linn.）為百合科（Liliaceae）嘉蘭屬植物，產(chǎn)于云南南部（西雙版納），生長于海拔950～1 250 m的林下或灌叢中，也分布于亞熱帶地區(qū)和非洲。據(jù)記載[1]其根狀莖有劇毒，含有秋水仙堿。秋水仙堿（Colchicine）是一種生物堿，其作為高效抗痛風(fēng)藥，早期是預(yù)防家族性地中海熱發(fā)作的首選藥物[2]，現(xiàn)主要用于治療關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕痛、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病[3-5]。有研究[6-8]表明小劑量的秋水仙堿對于痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的治療效果顯著。小劑量秋水仙堿的臨床療效與大劑量給藥相當(dāng)且不良反應(yīng)少，值得推廣[9]。由于秋水仙堿能夠抑制癌細(xì)胞的生長，因此，臨床也用于癌癥的治療，特別是對乳腺癌有一定療效[10]。

目前秋水仙堿多采用萃取法[11-13]進(jìn)行純化，萃取過程中使用了大量的二類溶劑，因此對環(huán)境保護(hù)和生產(chǎn)安全造成了巨大隱患。大孔樹脂是一種有機(jī)高聚物吸附劑，是吸附性和篩選性相結(jié)合的多孔性高分子材料[14-15]。大孔樹脂具有良好的穩(wěn)定性和選擇性，純化效果顯著[16-18]。由于大孔樹脂操作方便，吸附量大，分離速度快，并具有可再生等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于中草藥化學(xué)成分和高分子材料的分離和富集[19-21]。本研究以嘉蘭種子提取物中的秋水仙堿為指標(biāo)，篩選大孔樹脂分離純化秋水仙堿的工藝條件，旨在為秋水仙堿的純化研究奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器R-3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司）；Agilent1100高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；DFY-1000D型1000 g高速粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；ZNHW20000ML型電熱套（河南愛博科技公司）；SZCL-3B型數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；HWS-Z4型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；YY-TI-20L型超純水制備系統(tǒng)（成都優(yōu)越科技）。

1.2 試藥與試劑嘉蘭種子（批號：20190329）采集自云南南部西雙版納傣族自治州景洪市勐旺鄉(xiāng)，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)楊竹雅副教授鑒定為百合科植物嘉蘭（Gloriosa superba Linn.）的干燥種子；秋水仙堿對照品（批號：101176-202003）購自中國食品藥品檢定研究院；D001SD、AM007、ADS-8、ADS-5樹脂（天津南開和成科技有限公司）；甲醇為色譜純（德國默克公司）；乙醇為分析純；磷酸二氫鉀（四川西隴科學(xué)有限公司）；磷酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 秋水仙堿含量測定方法

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Thermo Acclaim 120C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇-水（32∶68）為流動相；檢測波長為245 nm；流速為1 mL/min；柱溫度為30℃；進(jìn)樣體積為20 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取秋水仙堿對照品適量置于棕色容量瓶中，用甲醇與水體積比為1∶1溶解并稀釋配制成質(zhì)量濃度為30 μg/mL的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取本品粉末（過三號篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，超聲（功率：100 W，頻率：40 kHz）處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 含量測定 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測定，即得。

2.2 大孔樹脂純化秋水仙堿的工藝研究

2.2.1 秋水仙堿提取液的制備 稱量粉碎后并過三號篩的2 kg嘉蘭種子，加入6倍體積的70%乙醇回流提取3次，每次2 h，抽濾后合并濾液，濃縮至浸膏狀，浸膏加水溶散（V藥材投料量∶V水=1∶1），水沉3次，抽濾后合并濾液，即得秋水仙堿提取液。

2.2.2 大孔樹脂型號的選擇 取相同型號的玻璃柱，分別用5 mL的D001SD（強(qiáng)酸型）、AM007（離子型）、ADS-8（非極性）、ADS-5（非極性）濕樹脂裝柱，倒入相同批次、相同體積10 mL的上樣液（質(zhì)量濃度為3.00 mg/mL）。室溫靜置24 h，收集流出液進(jìn)行HPLC檢測。之后，向吸附后樹脂中分別加入10 mL 95%乙醇解吸附，室溫靜置24 h，收集流出液進(jìn)行HPLC檢測。并通過下式對秋水仙堿吸附量及解吸量進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表1。

其中，C1為上樣液濃度，C2為吸附后溶液濃度，V1為上樣液體積，V2為樹脂體積。

其中，C為解吸附溶液濃度，V1為解吸液體積，V2為樹脂體積。

結(jié)果顯示，ADS-8、ADS-5對秋水仙堿的吸附量均較高，但ADS-8的解吸附量高于ADS-5。綜合可知，4種樹脂材料中ADS-8樹脂對秋水仙堿的吸附、解吸附效果較好，故選擇ADS-8大孔樹脂對嘉蘭種子提取物中的秋水仙堿進(jìn)行純化。（見表1）

表1 純化樹脂型號選擇

2.2.3 吸附流速的篩選 取10 mL的ADS-8樹脂裝柱，取上樣液（質(zhì)量濃度：2.25 mg/mL）100 mL上樣，流速分別為1、2、3、4 BV/h，接收流出液，每10 mL為一流分，檢測流出液中秋水仙堿含量，并記錄泄漏流分號。結(jié)果顯示，以1、2 BV/h的吸附速度上樣，接收流出液100 mL（1 BV）時(shí)，秋水仙堿吸附量分別為2.20、2.21 mg/mL；以3、4 BV/h的吸附速度上樣，接收流出液80 mL（0.8 BV）時(shí)，秋水仙堿吸附量逐漸降低。且吸附流速＞2 BV/h時(shí)，隨著吸附速度的加快，吸附量逐漸降低。在考慮到效率的情況下，選擇以2 BV/h為最適吸附流速。（見表2）

表2 ADS-8樹脂吸附流速篩選結(jié)果

2.2.4 洗脫溶劑的篩選 大孔樹脂擬采用乙醇-水混合溶劑洗脫，相同上樣條件下分別用水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇洗脫4 BV，洗脫流速為2 BV/h收集洗脫液，測定溶液中秋水仙堿含量及純度。結(jié)果可知，當(dāng)以水、10%乙醇作為洗脫溶劑時(shí)，洗脫液中未檢出秋水仙堿，無法洗脫目標(biāo)物；增加乙醇濃度可以將樹脂上的秋水仙堿洗脫，40%乙醇洗脫液中秋水仙堿的含量和純度均較高；但隨著乙醇濃度的增加，洗脫液中其他雜質(zhì)也被洗脫，導(dǎo)致秋水仙堿純度降低，不利于其分離純化，因此，考慮用水、10%乙醇洗脫去除部分色素及雜質(zhì)，然后將乙醇洗脫液的濃度控制在40%左右，并做進(jìn)一步的觀察。（見表3）

表3 一次純化洗脫溶劑選擇

2.2.5 水和10%乙醇洗脫倍數(shù)的篩選 取上樣液（質(zhì)量濃度：2.25 mg/mL）43 mL（相當(dāng)于原藥材10 g）上樣至分離柱，分離材料ADS-8樹脂40 mL，用水洗脫4 BV，再用10%乙醇洗脫4 BV，洗脫流速為80 mL/h（即2 BV/h），按體積計(jì)量收集水和10%乙醇洗脫液，每次接收40 mL。將每個(gè)體積的收集液用標(biāo)準(zhǔn)比色液比色，記錄現(xiàn)象后檢測其秋水仙堿含量。結(jié)果可知，水洗脫2 BV后，溶液為黃色調(diào)7色級且不再變化，10%乙醇洗脫3 BV后溶液為黃色調(diào)4色級且不再變化，經(jīng)檢測，水和10%乙醇洗脫液均不含秋水仙堿，為節(jié)約成本，選定先用水洗脫2 BV，再用10%乙醇洗脫3 BV，將部分色素及溶于水的雜質(zhì)除去。（見表4～5）

表4 水洗倍數(shù)選擇

表5 10%乙醇洗脫倍數(shù)選擇

2.2.6 35%～45%乙醇-水溶液洗脫情況 取相同條件的ADS-8層析柱（ADS-8體積40 mL），分別吸附等體積（43 mL）上樣液（質(zhì)量濃度：2.25 mg/mL）。層析柱分別以35%、40%、45%乙醇溶液洗脫，洗脫流速為80 mL/h。收集洗脫流出液，每40 mL（1 BV）為一流分，分別測定各流分的秋水仙堿峰面積及固形物質(zhì)量。根據(jù)所得秋水仙堿及固形物質(zhì)量繪制洗脫曲線。結(jié)果可知，10 BV的35%乙醇溶液、40%乙醇溶液、45%乙醇溶液對有效成分秋水仙堿的解析率（洗脫量/上樣量）分別約為90.41%、99.01%、99.54%。從生產(chǎn)成本和節(jié)約使用溶劑出發(fā)，考慮到使用40%、45%乙醇溶液時(shí)秋水仙堿的高轉(zhuǎn)移率差別不大，確定用40%乙醇溶液進(jìn)行秋水仙堿的洗脫。（見圖1～3、表6）

圖1 35%乙醇-水溶液洗脫曲線

圖2 40%乙醇-水溶液洗脫曲線

圖3 45%乙醇-水溶液洗脫曲線

表6 不同濃度洗脫液對秋水仙堿的解析率

2.2.7 40%濃度乙醇洗脫倍數(shù)篩選 取處理好的200 mL的ADS-8樹脂裝柱，上樣（質(zhì)量濃度：2.25 mg/mL）215 mL提取液（相當(dāng)于50 g藥材），用水洗脫2 BV和10%乙醇洗脫3 BV后，再以40%乙醇洗脫，洗脫流速為400 mL/h（即2 BV/h）。以200 mL為單位收集40%乙醇洗脫液，按照體積逐倍進(jìn)行接收，分別用HPLC測定1～8 BV。結(jié)果可知，40%乙醇洗脫至第8 BV時(shí)，秋水仙堿的含量和轉(zhuǎn)移率都較低，且純度基本維持在27%～29%。為了盡可能收集秋水仙堿，以減少其損失，綜合考慮，以40%乙醇洗脫8 BV，并收集40%乙醇洗脫液，其效果較好。（見表7）

表7 40%乙醇洗脫倍數(shù)確定

2.2.8 洗脫流速的篩選 取處理好的100 mL的ADS-8樹脂裝柱，上樣液（質(zhì)量濃度：2.25 mg/mL）108 mL（相當(dāng)于25 g藥材），以2 BV/h流速上樣，用水洗脫2 BV和10%乙醇洗脫3 BV后，再用40%乙醇洗脫8 BV，洗脫流速分別為2、3、4 BV/h，收集洗脫液。每1 BV為一個(gè)流分，檢測其中秋水仙堿的含量及洗脫液干質(zhì)量，繪制洗脫曲線。結(jié)果可知，8 BV的40%乙醇溶液以2、3、4 BV/h洗脫流速對有效成分秋水仙堿的解吸率（洗脫量/上樣量）分別為97.56%、91.30%、87.51%。以2 BV/h的洗脫流速對秋水仙堿的洗脫效果較好，故確定用2 BV/h的洗脫流速進(jìn)行洗脫。（見圖4～6、表8）

圖4 洗脫流速2 BV/h洗脫曲線

圖5 洗脫流速3 BV/h洗脫曲線

圖6 洗脫流速4 BV/h洗脫曲線

表8 洗脫流速的篩選結(jié)果

2.2.9 驗(yàn)證試驗(yàn) 稱量粉碎后并過三號篩的2 kg嘉蘭種子，用6倍體積的70%乙醇，回流提取3次，每次2 h。濃縮至流浸膏加水溶散（V藥材投料量∶V水=1∶1），水沉3次，過濾后收集濾液。取3根相同規(guī)格的玻璃層析柱，裝入處理過的ADS-8樹脂各2 L，秋水仙堿上樣液（質(zhì)量濃度：2.00 mg/mL）1.5 L（相當(dāng)于500 g藥材）以2 BV/h的流速分別上樣，以2 BV/h的流速用水洗脫2 BV和10%乙醇洗脫3 BV后，再用40%乙醇洗脫8 BV，收集40%乙醇洗脫液，測定其中秋水仙堿的含量并計(jì)算轉(zhuǎn)移率。結(jié)果可知，按照該工藝實(shí)施可將嘉蘭種子提取液中的秋水仙堿的轉(zhuǎn)移率保持在64%左右，其純度也提高了約8.0倍。（見表9）

表9 ADS-8樹脂工藝驗(yàn)證結(jié)果

3 討 論

本研究建立了嘉蘭種子提取物中秋水仙堿的純化工藝，通過比較不同大孔樹脂對嘉蘭種子提取物中秋水仙堿的純化效果，以吸附量、解吸附量、轉(zhuǎn)移率、純度和含量等考察指標(biāo)，最終確定的秋水仙堿的純化工藝為：吸附流速為2 BV/h；以水洗脫2 BV和10%乙醇洗脫3 BV后，再以40%乙醇溶液洗脫8 BV，收集40%乙醇洗脫流出液；洗脫流速為2 BV/h。

經(jīng)過工藝驗(yàn)證，ADS-8型大孔樹脂對嘉蘭種子提取物中秋水仙堿的分離純化效果較好，多次試驗(yàn)確定了工藝具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。其適用于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)，也為臨床研究進(jìn)一步提供了工作基礎(chǔ)和技術(shù)支持。