基于純培養(yǎng)和高通量測(cè)序技術(shù)解析仙桃地區(qū)鲊菜細(xì)菌多樣性

胡雨婷，符 漫，王玉榮，張 彥，張海波，孫雅芳，郭 壯*

（1.湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽 441053；2.湖北文理學(xué)院 乳酸菌生物技術(shù)與工程襄陽市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 襄陽 441053；3.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003）

鲊菜是指以米粉或玉米粉為原料，以豇豆、冬瓜和蘿卜等各種切碎的蔬菜為輔料，加入食鹽和花椒密封發(fā)酵而成的一種傳統(tǒng)發(fā)酵食品[1]。鲊菜制作工藝相對(duì)簡單，制作環(huán)境相對(duì)開放，在湖北省仙桃市、天門市、荊門市和潛江市等地區(qū)有著廣泛的食用人群。有研究表明，由于受制作原料和當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境的影響，不同地區(qū)制作的同一發(fā)酵食品可能形成了各自較為獨(dú)特的微生物類群[2]，而獨(dú)特的微生物類群又對(duì)其產(chǎn)品品質(zhì)的形成及食用安全性具有重要的影響作用[3]。仙桃市位于華中腹地，北依漢水，南靠長江，具有全年氣候溫和、四季分明及無霜期長的特點(diǎn)，得天獨(dú)厚的自然條件和地理環(huán)境可能使當(dāng)?shù)刂谱鞯镊嚥颂N(yùn)含了較為豐富和獨(dú)特的微生物類群，然而目前關(guān)于此方面的研究尚少。

近年來以Illumina MiSeq為代表的第二代高通量測(cè)序技術(shù)在泡菜[4]、臘肉[5]、腐乳[6]和豆瓣醬[7]等我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品的微生物多樣性解析中有著廣泛的應(yīng)用，具有通量高和價(jià)格相對(duì)低廉的優(yōu)點(diǎn)[8]。作為華中和西南地區(qū)另一特色發(fā)酵食品，鲊廣椒亦是以米粉或玉米粉為原料密封發(fā)酵而成，與鲊菜的不同之處在于其使用的為二荊條辣椒，在湖北省恩施土家族苗族自治州、宜昌市、荊州市和神農(nóng)架林區(qū)有著廣泛的食用人群[9]。通過采用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)，王玉榮等[10]對(duì)宜昌市當(dāng)陽地區(qū)鲊廣椒細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析，發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬（Lactobacillus）為其主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，且Lactobacillus和普氏菌屬（Prevotella）對(duì)鲊廣椒風(fēng)味的形成具有積極的作用；李娜等[11]對(duì)荊州市洪湖地區(qū)鲊廣椒的乳酸菌多樣性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)Lactobacillus為其主要乳酸菌屬；席啦等[12]對(duì)宜昌市秭歸地區(qū)鲊廣椒細(xì)菌多樣性進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)Lactobacillus、戊糖片球菌屬（Pediococcus）和假單胞菌屬（Pseudomonas）為其優(yōu)勢(shì)菌屬。鲊菜和鲊廣椒作為湖北地區(qū)特色發(fā)酵食品，雖然在制作原料上存在一定的差異，但其制作工藝具有一定相似性，加之MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)在鲊廣椒微生物類群解析中有了成功的應(yīng)用，因而將該技術(shù)應(yīng)用于鲊菜的微生物群落結(jié)構(gòu)解析中具有較強(qiáng)的可行性。乳酸菌已廣泛應(yīng)用于乳制品、肉制品和果汁制品的生產(chǎn)加工中[13]，且對(duì)于人體的腸道防御、血糖血脂調(diào)節(jié)和身體免疫力提升等均具有明顯的作用[14]，是目前食品加工領(lǐng)域使用的主要菌種資源之一。前期研究亦證明鲊廣椒中存在豐富的乳酸菌資源，因而在對(duì)鲊菜微生物多樣性進(jìn)行解析的同時(shí)，采用傳統(tǒng)的微生物學(xué)手段對(duì)鲊菜中蘊(yùn)含的乳酸菌資源進(jìn)行收集亦具有積極的意義。

本研究采用純培養(yǎng)和MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的手段對(duì)仙桃地區(qū)鲊菜中細(xì)菌菌群多樣性進(jìn)行解析，對(duì)其蘊(yùn)含的乳酸菌資源進(jìn)行挖掘，在為鲊菜這一特色傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物類群解析提供數(shù)據(jù)支撐的同時(shí)，亦可為其后續(xù)產(chǎn)業(yè)化推動(dòng)提供菌株支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從湖北省仙桃市（E112°55′～113°49′，N30°04′～30°32′）城南菜市場、昌盛菜市場和沙嘴橋菜市場采集鲊菜樣品共9個(gè)，所有鲊菜的發(fā)酵時(shí)間在30～40 d之間，制作原料均為大米粉，添加蔬菜均為冬瓜。

QIAGEN DNeasy mericon Food Kit脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司；5×TransStartTMFastPfu Buffer、FastPfu Fly DNA Polymerase和脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）Mix：北京全式金生物技術(shù)有限公司；MRS合成培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；瓊脂糖（生化試劑）：北京索來寶生物技術(shù)有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）清潔試劑盒：武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司；克隆載體pMD18-T：大連寶生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

vetiri梯度基因擴(kuò)增儀：美國AB公司；PE300高通量測(cè)序平臺(tái)：美國Illumina公司；DG250型厭氧工作站：英國Don Whitley公司；CR21N型高速離心機(jī)：日本日立金屬株式會(huì)社；1645050基礎(chǔ)電泳儀：美國Bio-Rad公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國ProteinSimple公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鲊菜乳酸菌的分離鑒定

稱取10 g鲊菜樣品于裝有90 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，30 ℃振蕩0.5 h，使用MRS培養(yǎng)基于厭氧條件下培養(yǎng)48 h，挑取革蘭氏染色結(jié)果為陽性和過氧化氫酶結(jié)果為陰性的疑似乳酸菌菌株使用30%甘油保存[15]，-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

使用溴化十六烷基三甲銨（cetyltrimethyl ammonjum bromide，CTAB）法對(duì)疑似乳酸菌菌株中的DNA進(jìn)行提取[16]，并參照曾維友等[17]的方法對(duì)所提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳（120 V，30 min）檢測(cè)合格后進(jìn)行一系列的清潔、連接、轉(zhuǎn)化和克隆子的鑒定，挑選陽性克隆子送往武漢天一輝生物有限公司測(cè)序。測(cè)序序列進(jìn)行拼接并去除引物，在美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對(duì)，統(tǒng)計(jì)分離到的乳酸菌數(shù)量及鑒定種類。

1.3.2 鲊菜中微生物宏基因組DNA提取和Illumina MiSeq高通量測(cè)序

使用基因組提取試劑盒對(duì)鲊菜微生物宏基因組DNA進(jìn)行提取，置于-20 ℃?zhèn)溆?，以宏基因組DNA為模板，使用在前段加入了7個(gè)堿基核苷酸標(biāo)簽（barcode）的338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）引物，按照WANG Y等[18]的PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件對(duì)鲊菜樣品中的細(xì)菌16S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將檢測(cè)合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于Illumina MiSeq PE300平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.3 序列質(zhì)控和生物信息學(xué)分析

參照GUO Z等[19]的方法對(duì)測(cè)序的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、質(zhì)控和以QIIME平臺(tái)為依托進(jìn)行生物信息學(xué)分析。即：序列經(jīng)PyNAST軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)和對(duì)齊后選取100%和97%相似度進(jìn)行兩步UCLUST劃分，從而構(gòu)建分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）矩陣，隨后使用Chimera Slayer軟件剔除含有嵌合體的OTU，最后選取代表性序列在核糖體數(shù)據(jù)庫項(xiàng)目（ribosomal database project，RDP）進(jìn)行同源性比對(duì)，進(jìn)而明確鲊菜中微生物類群的分類學(xué)地位。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

使用MEGA 7.0和R軟件相結(jié)合的方法對(duì)乳酸菌分離株的系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行構(gòu)建，使用Excel 2010軟件對(duì)乳酸菌分離株相對(duì)含量的子母餅圖進(jìn)行繪制，使用Origin 2017軟件對(duì)鲊菜中平均相對(duì)含量＞1.0%的門和屬柱形圖進(jìn)行繪制，使用R軟件對(duì)核心OTU相對(duì)含量的熱圖進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 仙桃地區(qū)鲊菜中乳酸菌的分離、鑒定及相對(duì)含量分析

本研究通過純培養(yǎng)手段從14 個(gè)鲊菜中共分離得到了44 株乳酸菌，在對(duì)其16S rRNA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序和BLAST比對(duì)的基礎(chǔ)上，將其與模式菌株混合構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。

圖1 鲊菜中乳酸菌分離株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria isolates in Zha-vegetable

由圖1可知，HBUAS56196等18株菌株被鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），HBUAS56207等15株菌株被鑒定為戊糖乳桿菌（L.pentosus），菌株HBUAS56205、HBUAS56208和HBUAS56218被鑒定為黑氏乳桿菌（L.hammesii），菌株HBUAS56206和HBUAS56236被鑒定為消化乳桿菌（L.alimentarius），菌株HBUAS56250被鑒定為棒狀乳桿菌（L.coryniformis），菌株HBUAS56227被鑒定為發(fā)酵乳桿菌（L.fermentum），菌株HBUAS56202被鑒定為乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），菌株HBUAS56217被鑒定為綠色魏斯氏菌（Weissella viridescens），菌株HBUAS56224被鑒定為腸膜明串珠球菌（Leuconostoc mesenteroides），菌株HBUAS56216被鑒定為假腸膜明串珠球菌（L.pseudomesenteroides）。由此可見，仙桃地區(qū)鲊菜中乳酸菌分離株主要隸屬于Lactobacillus，累計(jì)占總分離株的90.91%。進(jìn)一步對(duì)各乳酸菌分離株的類群構(gòu)成及其相對(duì)含量進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，隸屬于Lactobacillus的種包含6 個(gè)，為L.plantarum、L.pentosus、L.hammesii、L.alimentarius、L.fermentum和L.coryniformis，分別占總分離株含量的40.91%、34.09%、6.82%、4.55%、2.27%和2.27%；隸屬于Leuconostoc的種包含2 個(gè)，分別為L.mesenteroides和L.pseudomesenteroides，均占總分離株含量的2.27%；隸屬于Weissella和Lactococcus的種各有1 個(gè)，分別為W.viridescens和L.lactis，均占總分離株含量的2.27%。由此可見，L.plantarum和L.pentosus為仙桃鲊菜中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌。大米或玉米等谷物在發(fā)酵過程中，L.plantarum的存在能顯著提升谷物的質(zhì)構(gòu)、蒸煮及感官品質(zhì)，并使得其蛋白質(zhì)、脂肪及灰分含量顯著減少，總淀粉和直鏈淀粉含量顯著增加，同時(shí)使糊化黏度和起始糊化溫度降低，糊化焓值增加，從而更有利于谷物品質(zhì)的提高[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，仙桃地區(qū)鲊菜中含有L.pentosus，有研究指出在發(fā)酵過程中該類群菌株具有較強(qiáng)降解亞硝酸鹽的能力[21]。

圖2 鲊菜中乳酸菌分離株相對(duì)含量的餅圖Fig.2 Pie plot of relative contents of lactic acid bacteria isolates in Zha-vegetable

2.2 基于門和屬分類水平鲊菜細(xì)菌相對(duì)含量的分析

本研究進(jìn)一步對(duì)14個(gè)鲊菜中微生物基因組進(jìn)行了提取，在對(duì)9 個(gè)樣品微生物基因組進(jìn)行成功提取的基礎(chǔ)上，使用MiSeq高通量技術(shù)對(duì)其細(xì)菌多樣性進(jìn)行解析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，9個(gè)樣品共產(chǎn)生286 471條高質(zhì)量的16S rRNA序列，經(jīng)比對(duì)鑒定為7個(gè)門、18個(gè)綱、32個(gè)目、68個(gè)科和142個(gè)屬，其中不能鑒定到門和屬水平的序列占總序列數(shù)的0.87%和19.36%。若在9 個(gè)樣品中某一細(xì)菌門或?qū)俚钠骄鄬?duì)含量≥1.00%，則將其定義為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門或?qū)伲嚥酥袃?yōu)勢(shì)細(xì)菌門的構(gòu)成見圖3。

圖3 鲊菜中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門的相對(duì)含量Fig.3 Relative contents of dominant bacterial phyla in Zha-vegetable

由圖3可知，仙桃地區(qū)鲊菜中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為硬壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），其平均相對(duì)含量分別為91.97%和7.13%。不同樣品在門水平上細(xì)菌類群的構(gòu)成即存在一定差異，樣品XT2和XT3中Proteobacteria相對(duì)含量高達(dá)68.62%和72.89%，而其他7 個(gè)樣品以Firmicutes為主且平均相對(duì)含量高達(dá)95.00%以上。為進(jìn)一步揭示不同樣品間細(xì)菌類群的差異，本研究進(jìn)一步對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬的含量進(jìn)行解析，結(jié)果見圖4。

圖4 鲊菜中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬的相對(duì)含量Fig.4 Relative contents of dominant bacterial genera in Zha-vegetable

由圖4可知，鲊菜中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬主要包括Lactobacillus、Leuconostoc、Weissella、Pseudomonas和腸桿菌屬（Enterobacter），其中Lactobacillus、Leuconostoc和Weissella均隸屬于Firmicutes，其相對(duì)含量分別為85.03%、3.31%和1.68%；Pseudomonas和Enterobacter隸屬于Proteobacteria，相對(duì)含量分別為1.50%和1.05%。Lactobacillus、Leuconostoc和Weissella均為乳酸菌，累計(jì)相對(duì)含量高達(dá)90.02%，且通過純培養(yǎng)方式獲得了隸屬于上述菌屬的分離株。由此可見，仙桃地區(qū)鲊菜中蘊(yùn)藏著豐富的乳酸菌資源。乳酸菌可以產(chǎn)生多種氨基酸、維生素和酶等活性物質(zhì)，從而提高和改善發(fā)酵食品的營養(yǎng)價(jià)值，在發(fā)酵過程中通過厭氧發(fā)酵產(chǎn)生乳酸和丙酸從而對(duì)發(fā)酵環(huán)境中某些腐敗微生物和致病微生物的生長具有抑制作用[22]。

由圖4亦可知，樣品XT2和XT3中蘊(yùn)含細(xì)菌的多樣性明顯高于其他7 個(gè)樣品，其中樣品XT2除含有58.36%的Lactobacillus外，亦含有Enterobacter、Weissella、根瘤菌屬（Rhizobium）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、Pediococcus和沙雷氏菌屬（Serratia）等細(xì)菌，相對(duì)含量分別為5.84%、5.03%、4.80%、4.74%、2.42%和1.63%；樣品XT3中Lactobacillus的相對(duì)含量僅為25.46%，但其Leuconostoc的相對(duì)含量高達(dá)29.66%，除此以外亦含有Weissella、Lactococcus、Pseudomonas、穩(wěn)桿菌屬（Empedobacter）、Enterobacter、漫游球菌屬（Vagococcus）、Klebsiella和塔特姆菌屬（Tatumella），相對(duì)含量分別為9.41%、4.83%、3.53%、3.51%、3.15%、1.88%、1.40%和1.10%。經(jīng)對(duì)其α多樣性進(jìn)行計(jì)算發(fā)現(xiàn)，在測(cè)序深度為14 000條時(shí)，樣品XT2和XT3的香農(nóng)指數(shù)分別為4.90和6.38，而其他7個(gè)樣品的平均香農(nóng)指數(shù)僅為2.81。Enterobacter[23]、Klebsiella[24]、Serratia[25]和Empedobacter[26]多為條件致病菌，可引起原發(fā)性或繼發(fā)性的感染，因而樣品XT2和XT3在食用過程中可能存在一定的安全隱患，究其原因可能是在發(fā)酵過程中陶壇沒有密封好或原料受到了外界環(huán)境的污染[10]。

2.3 核心OTU及其在各樣品中的分布

采用兩步UCLUST對(duì)序列進(jìn)行劃分且去除嵌合體后，本研究共得到了9 230個(gè)OTU，若某一OTU在9個(gè)樣品中均存在則將其定義為核心OTU。雖然納入本研究的樣品細(xì)菌多樣性存在一定差異，但解析不同樣品中共有的細(xì)菌類群，對(duì)探討發(fā)酵食品品質(zhì)的形成和食用安全性均具有較大的意義[27]。本研究共發(fā)現(xiàn)6個(gè)核心OTU，其系統(tǒng)發(fā)育樹及各OTU在9個(gè)樣品中的含量見圖5。

圖5 核心操作分類單元矩陣系統(tǒng)發(fā)育樹及其在各鲊菜中的相對(duì)含量Fig.5 Phylogenetic tree of core operational taxonomic units and their relative contents in each Zha-vegetable

由圖5可知，6個(gè)核心OTU在系統(tǒng)發(fā)育樹中整體劃分為2個(gè)大類，其中OTU2192、OTU7256和OTU4221隸屬于Lactobacillus，其在9 個(gè)樣品的平均相對(duì)含量分別為6.59%、1.91%和39.96%；OTU3876、OTU4651和OTU1861隸屬于Pseudomonas，平均相對(duì)含量分別為0.02%、0.03%和0.01%。由此可見，Lactobacillus是仙桃地區(qū)鲊菜中的主要核心細(xì)菌類群。雖然各樣品中Pseudomonas的相對(duì)含量較低，但有研究指出該菌株致病力較低但其抗藥性較強(qiáng)，在自然界中廣泛存在，是導(dǎo)致傷口感染的細(xì)菌之一[28]。由此可見，在鲊菜制作及發(fā)酵過程中，保證環(huán)境及發(fā)酵器皿的潔凈度、對(duì)發(fā)生腐敗及霉變的原料及時(shí)剔除和保證鲊菜發(fā)酵過程中陶壇的密封性是極為必要的[10]。

3 結(jié)論

本研究采用傳統(tǒng)微生物學(xué)方法和高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)仙桃地區(qū)14 份鲊菜樣品中細(xì)菌菌群多樣性進(jìn)行了解析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Firmicutes和Proteobacteria為鲊菜中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門，Lactobacillus、Leuconostoc、Weissella、Pseudomonas和Enterobacter為鲊菜中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，L.plantarum和L.pentosus為鲊菜中主要的乳酸菌類群。