非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵對葡萄酒香氣的影響

羅來慶，林海明，焦宇知，丁玉勇，張浩東，張 峰

（1.江蘇省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院 酒店學(xué)院，江蘇 淮安 223003；2.江蘇省漣水中等專業(yè)學(xué)校，江蘇 淮安 223003）

葡萄酒的釀造是釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，SC）將糖轉(zhuǎn)化為酒精以及多種微生物協(xié)同參與的過程[1]，酵母菌自身發(fā)酵特性和代謝途徑的不同，同時也會造成葡萄酒具有品質(zhì)[2]和風味[3]的不同。目前，商業(yè)釀酒酵母的使用最為廣泛，既具有良好的發(fā)酵特性又能夠提升葡萄酒的口感與品質(zhì)，但其會造成葡萄酒一些關(guān)鍵香氣的丟失[4]。而有些非釀酒酵母（non-S.cerevisiae，NSC）能夠賦予葡萄酒更加復(fù)雜的香氣[5]并且具有較好的發(fā)酵性能。香氣物質(zhì)是評價葡萄酒品質(zhì)和風味的重要指標，葡萄原料、釀酒酵母和釀造工藝是決定香氣物質(zhì)的關(guān)鍵因素[6-7]。因此使用非釀酒酵母對葡萄酒進行增香釀造和改善葡萄酒品質(zhì)的研究越來越多。如畢赤酵母被證明在葡萄酒增香釀造提高花果香氣中具有極大應(yīng)用潛力，其具有高產(chǎn)乙酸乙酯和乙酸異丁酯等酯類特性[8]，祝霞等[9]利用戴爾有孢圓酵母（Torulaspora debrueckii）和SC混合發(fā)酵葡萄酒，可明顯提升貴人香低醇白葡萄酒的香氣品質(zhì)；BELY M等[10-11]利用戴爾有孢圓酵母與SC按20∶1混合發(fā)酵使葡萄酒中的揮發(fā)酸酸度和乙醛含量降低了50%～60%。因此，選擇優(yōu)質(zhì)的非釀酒酵母對葡萄酒的增香釀造具有重要的意義。

試驗以前期研究從新疆天山北麓產(chǎn)區(qū)釀酒葡萄表皮分離篩選得到的3株優(yōu)質(zhì)野生非釀酒酵母菌為基礎(chǔ)，探究非釀酒酵母菌的增香釀造潛力，用3株非釀酒酵母與商業(yè)釀酒酵母混合發(fā)酵赤霞珠干紅葡萄酒，通過頂空固相萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（headspace solid phase extraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技術(shù)檢測酒樣的揮發(fā)性香氣成分，結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA）及氣味活度值（ordor activity value，OAV）對酒樣的主要揮發(fā)性香氣成分進行比較，以期開發(fā)具有增香釀造潛力的非釀酒酵母，為釀造具有本地特色的葡萄酒提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠（Cabernet Sauvignon）釀酒葡萄：2021年10月采自新疆西域明珠葡萄酒有限公司葡萄園，葡萄可溶性固形物質(zhì)量分數(shù)21.32%，可滴定酸質(zhì)量濃度為7.21 g/L，pH 3.6，采后置于4 ℃冷庫中保藏。

AWRI 796型活性釀酒酵母（S.cerevisiae）：澳大利亞Mauribrew公司；果膠酶（≥500 U/mg）、偏重亞硫酸鉀（分析純）：法國LALLEMAND公司；2-辛醇（色譜純）：上海源葉生物科技有限公司。

畢赤克魯維酵母（P.kluyveri）HSX-5、長孢洛德酵母（L.elongisporus）MNS-6、戴爾有孢圓酵母（T.debrueckii）YQX-8，30%無菌甘油-80 ℃保藏。

1.2 儀器與設(shè)備

75 μm CAR/PDMS萃取頭：美國Supelco公司；HP-INNOWax毛細管色譜柱（30 mm×0.25 mm×0.5 μm）、7890B-5977A型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司；C-MAG HS 4型磁力攪拌器：德國IKA公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株的活化

釀酒酵母活化：按照商業(yè)酵母使用說明活化，并調(diào)整菌濃度為1×106CFU/mL；非釀酒酵母活化[12]：通過6%無菌葡萄糖溶液28 ℃培養(yǎng)24 h擴大培養(yǎng)兩次，第3次使用糖度為8%的葡萄汁溶液接種第2次擴培發(fā)酵液，28 ℃培養(yǎng)24 h后調(diào)整菌體濃度為1×106CFU/mL。

1.3.2 赤霞珠干紅葡萄酒的制備

選取新鮮的赤霞珠葡萄，除梗、去雜質(zhì)壞果，破碎，取1.2 L葡萄醪置于2 L玻璃瓶中，添加100 mg/L偏重亞硫酸鉀，2 h后按照10 mg/L加入果膠酶并20 ℃浸漬24 h。處理后按照葡萄醪體積的5%（V/V）接種菌株HSX-5、菌株YQX-8、菌株MNS-6，發(fā)酵48 h后按照5∶1比例接入釀酒酵母（SC），在25 ℃條件下進行酒精發(fā)酵，以釀酒酵母單菌發(fā)酵作為空白對照。在酒精發(fā)酵時，每天測溫度和比重，當比重為0.993～0.996時，進行皮渣分離。皮渣分離后監(jiān)控酒樣中還原糖含量，待還原糖含量低于3 g/L時加入100 mg/L偏重亞硫酸鉀終止發(fā)酵，收集葡萄汁于4 ℃進行蘋果酸-乳酸發(fā)酵30 d，得到赤霞珠干紅葡萄酒。每個酒樣分為三部分，在15 ℃條件下裝瓶保存待分析。

1.3.3 理化指標測定

葡萄酒酒度、殘?zhí)?、總酸等理化指標參照國標GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[13]測定。

1.3.4 揮發(fā)性香氣物質(zhì)的測定

揮發(fā)性香氣成分測定采用SPME-GC-MS法，具體參考余歡等[14]的方法。

揮發(fā)性香氣物質(zhì)的提?。喝?0mL葡萄酒樣品置于20mL頂空瓶中，加入5 μL 100 μg/mL的2-辛醇后加入磁力轉(zhuǎn)子并密封頂空瓶，將老化后的75 μmCAR/PDMS萃取頭插入樣品瓶頂空部分，于45 ℃吸附45 min，吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進樣口，于250 ℃解吸3 min，啟動GC-MS儀器進行分析。

GC-MS分析主要參考PLESSAS S等[15]方法。氣相色譜條件：采用恒定流量模式，起始柱溫40 ℃，以5 ℃/min升至90 ℃；再以10 ℃/min升至230 ℃，保留7 min。載氣為純度99.99%的氦氣（He），流量0.8 mL/min，汽化室溫度230 ℃。質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量70 eV，接口溫度為250 ℃，離子源溫度為200 ℃，燈絲發(fā)射電流為100 μA，檢測器電壓1 kV。

定性定量方法：通過比較質(zhì)譜與美國國家標準技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）15質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫結(jié)合文獻比對來鑒定化合物質(zhì)，保留正、反匹配度均大于800（最大值為1 000）的鑒定結(jié)果。揮發(fā)性物質(zhì)的定量[13]采用內(nèi)標法，以2-辛醇作為內(nèi)標，其計算公式如下：

式中：CX為待測組分質(zhì)量濃度，μg/L；M1為各組分的峰面積；M2為內(nèi)標物的峰面積；V1為內(nèi)標物質(zhì)量濃度，μg/L。

同時通過香氣濃度除以其閾值計算各香氣化合物的氣味活度值（OAV），OAV越大香氣化合物對風味的貢獻越大。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0進行香氣物質(zhì)組間顯著性差異分析（Duncan檢驗，P＜0.05），使用Origin Pro 2019軟件進行PCA主成分分析，Microsoft Office 2016進行揮發(fā)性香氣數(shù)據(jù)的整理。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤霞珠干紅葡萄酒理化指標

不同菌株發(fā)酵赤霞珠干紅葡萄酒樣品發(fā)酵結(jié)束后的理化指標測定結(jié)果見表1。由表1可知，4個酒樣的酒精度在12%vol左右，殘?zhí)蔷陀? mg/L，發(fā)酵比較徹底，沒有酸敗現(xiàn)象。與對照組SC相比混合發(fā)酵酒樣總酸質(zhì)量濃度上升，但揮發(fā)酸質(zhì)量濃度均降低，這與BELY M等[10]研究結(jié)果一致。pH值均在3.4左右，葡萄酒具有較好的穩(wěn)定性以及感官品質(zhì)。不同菌株發(fā)酵赤霞珠干紅葡萄酒酒樣理化指標均符合國家標準GB/T 15037—2006《葡萄酒》[16]，適用于后續(xù)對其香氣成分的測定。

表1 不同菌株發(fā)酵干紅葡萄酒樣品理化指標檢測結(jié)果Table 1 Determination results of physical and chemical indexes of dry red wine samples fermented by different yeast strains

2.2 赤霞珠干紅葡萄酒揮發(fā)性香氣成分

由表2可知，在不同菌株發(fā)酵赤霞珠干紅葡萄酒酒樣中共檢出56種揮發(fā)性香氣物質(zhì)，其中SC酒樣37種，PK1酒樣41種，PK2酒樣44種，PK3酒樣39種，包括16種酯類、19種醇類、9種醛類、7種酸類、2種酮類和3種萜烯類。各混合發(fā)酵酒樣組間除酸類物質(zhì)之外，其他香氣物質(zhì)組成和含量之間均存在顯著差異（P＜0.05），既有新生成的物質(zhì)，也有損失的物質(zhì)，非釀酒酵母對葡萄酒酯類和醇類物質(zhì)改善最為顯著。

表2 不同菌株發(fā)酵干紅葡萄酒樣品的揮發(fā)性香氣成分測定結(jié)果Table 2 Determination results of volatile aroma compounds in dry red wine samples fermented by different yeast strains

續(xù)表

2.2.1 非釀酒酵母對葡萄酒香氣成分的影響

釀酒酵母在酒精發(fā)酵過程中通過自身代謝生成酒精的同時會產(chǎn)生甘油和高級醇等副產(chǎn)物[21]，其中高級醇對葡萄酒的風味具有重要作用，當質(zhì)量濃度＞400 mg/L時，會使葡萄酒具有強烈的刺鼻味，而當質(zhì)量濃度＜300 mg/L時，可以使葡萄酒的香氣更具復(fù)雜性[22]。由圖1和表2可知，在各混合發(fā)酵葡萄酒樣品中共檢出19種醇類物質(zhì)，總質(zhì)量濃度均＜300 mg/L，相較于單菌發(fā)酵的SC酒樣，混合發(fā)酵酒樣中的高級醇含量均顯著增加（P＜0.05），主要是異戊醇和2-苯乙醇含量的顯著增加（P＜0.05）。其中異戊醇含量從44.25mg/L（SC酒樣）上升至58.21mg/L（PK1酒樣）、54.80mg/L（PK2酒樣）和57.02 mg/L（PK3酒樣），分別上升32%、24%和29%，且其OAV＞1，是葡萄酒的主要香氣物質(zhì)。適量的異戊醇可以增加葡萄酒的醇厚感。2-苯乙醇可以賦予葡萄酒玫瑰和蜂蜜氣味[23]，同時也是威代爾冰葡萄酒的特征香氣[24]，通常相較于釀酒酵母，非釀酒酵母具有更強的產(chǎn)2-苯乙醇能力。研究發(fā)現(xiàn)混合發(fā)酵樣品的2-苯乙醇含量均高于單菌發(fā)酵酒樣SC，其中PK3酒樣中2-苯乙醇質(zhì)量濃度最高（4 367.91 μg/L），說明長孢洛德酵母更具產(chǎn)2-苯乙醇能力。在檢測到的其他醇類物質(zhì)中，PK1酒樣新生成了月桂醇、2-癸烯-1-醇，PK2酒樣新生成了2,3-丁二醇、3-乙基-2-戊醇、正癸醇，PK3酒樣2,3-丁二醇、正癸醇、1,3-丁二醇，在一定程度上使葡萄酒風味更具復(fù)雜性。

圖1 不同菌株發(fā)酵干紅葡萄酒樣中各類別揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量比較Fig.1 Comparison of contents of various types of volatile aroma compounds in dry red wine samples fermented by different yeast strains

酯類物質(zhì)對葡萄酒的花果香氣具有主要貢獻[22]。在葡萄酒樣品中共檢出16種酯類物質(zhì)，其中SC酒樣（12種）、PK1酒樣（12種）、PK2酒樣（15種）、PK3酒樣（13種），相較于SC酒樣（17.73 mg/L），PK1酒樣（22.68 mg/L）和PK2酒樣（20.92 mg/L）混合發(fā)酵酒樣酯類物質(zhì)總含量均顯著升高（P＜0.05）。主要表現(xiàn)為辛酸乙酯、己酸乙酯和乙酸乙酯含量的上升以及物質(zhì)組成的差異，其中辛酸乙酯具有白蘭地的香氣，己酸乙酯具有草莓、菠蘿香氣，乙酸乙酯可賦予葡萄酒微帶果香的酒香氣味。同時PK1新生成了乙酸異丁酯和乙酸異戊酯，PK2新生成了乙酸異丁酯、乙酸異戊酯和水楊酸甲酯，PK3新生成了丙酮酸乙酯，乙酸異丁酯和乙酸異戊酯的OAV均＞1，是PK1和PK2酒樣的主要香氣，增強了葡萄酒的香蕉等水果香氣。在檢出的16種酯類物質(zhì)中共有8種物質(zhì)OAV＞1，為葡萄酒的主要貢獻香氣，其含量在混合發(fā)酵酒樣中表現(xiàn)為上升，增強了葡萄酒花果類香氣強度。

葡萄酒中的酸類物質(zhì)主要來源于葡萄果實和酒精發(fā)酵代謝，其中脂肪酸是主要的酸類物質(zhì)，當脂肪酸氣味活度值＜1時，可以增加葡萄酒風味復(fù)雜性[25]。由表2可知，在酒樣中共檢測出7種酸類物質(zhì)，其中SC酒樣5種，PK1酒樣7種，PK2和PK3酒樣6種，從酸類物質(zhì)總含量角度單菌發(fā)酵和混合發(fā)酵差異不顯著，但混合發(fā)酵也具有一定的降酸作用。但相較于SC酒樣，混合發(fā)酵酒樣新生成了丙酮酸和硬脂酸，多樣的酸類物質(zhì)是有利于葡萄酒的平衡。在檢出的酸類物質(zhì)中，只有辛酸的OAV＞1，是葡萄酒的的主要酸類香氣物質(zhì)，會給葡萄酒帶來酸敗的味道，而PK1酒樣降低了辛酸的含量，對葡萄酒風味具有積極的作用。

葡萄酒中的醛類物質(zhì)主要來源于酒精發(fā)酵過程氨基酸在酶的作用下產(chǎn)生的醛。由表2可知，在4個酒樣中共檢出9種醛類物質(zhì)，相較于SC酒樣（46.84 μg/L），PK1（122.54 μg/L）和PK2（96.00 μg/L）中的醛類物質(zhì)顯著提升（P＜0.05），其中壬醛和葵醛的OAV＞1，是主要的醛類香氣物質(zhì)，在PK1和PK2中的含量均顯著提升（P＜0.05），增加了葡萄酒的脂蠟香和甜橙香氣。在其他香氣物質(zhì)中，共檢出3種萜烯類和2種酮類，其中PK2酒樣新生成了2-辛酮，增加了葡萄酒蘋果香氣；在PK1和PK2酒樣中檢出β-大馬士酮，能夠貢獻葡萄酒中的甜香、花香和蜂蜜香[26]。PK2酒樣香茅醇含量顯著提升，賦予葡萄酒新鮮玫瑰類香氣。同時PK1和PK3酒樣新生成了橙花醇，增加了葡萄酒中的玫瑰和橙花的香氣。

2.2.2 主要香氣成分主成分分析

為了進一步比較非釀酒酵母菌對葡萄酒香氣的影響，選取OAV＞0.1的22種香氣化合物進行主成分分析，結(jié)果見圖2。由圖2可知，兩個主成分PC1和PC2的方差貢獻率分別為55.1%和26.7%，累計方差貢獻率為81.8%。4個酒樣在載荷圖中分別位于四個象限中且距離較遠，說明酒樣之間存在顯著差異。

圖2 不同菌株發(fā)酵干紅葡萄酒樣品中OAV＞0.1的香氣化合物主成分分析結(jié)果Fig.2 Results of principal component analysis of aroma compounds with OAV＞0.1 in dry red wine samples fermented by different yeast strains

釀酒酵母單菌發(fā)酵酒樣SC主要貢獻香氣有庚酸乙酯、正己醇、辛酸和香茅醇；混合發(fā)酵PK1酒樣主要貢獻香氣為辛酸乙酯、葵酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸異丁酯、壬酸乙酯、2-苯乙醇和壬醛；PK2酒樣主要貢獻香氣為丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯、1-辛醇、1-壬醇、異丁酸、葵醛和β-大馬士酮；PK3酒樣主要貢獻香氣為異丁醇和異戊醇。其中PK1和PK2混合發(fā)酵酒樣的OAV較高，對葡萄酒的風味更具有積極正面的影響。

3 結(jié)論

通過對3株自選優(yōu)質(zhì)非釀酒酵母與商業(yè)釀酒酵母混合發(fā)酵赤霞珠葡萄酒的揮發(fā)性香氣物質(zhì)進行檢測分析，共檢出56種揮發(fā)性香氣物質(zhì)，其中包括16種酯類、19種醇類、9種醛類、7種酸類、2種酮類和3種萜烯類。與商業(yè)酵母單菌發(fā)酵相比，畢赤克魯維酵母HSX-5和戴爾有孢圓酵母YQX-8能夠顯著增加葡萄酒酯類香氣物質(zhì)（P＜0.05），主要是辛酸乙酯、己酸乙酯和乙酸乙酯，增強葡萄酒花果類香氣；混合發(fā)酵酒樣中的醇類物質(zhì)均高于釀酒酵母單菌發(fā)酵，表現(xiàn)為2-苯乙醇和異戊醇等高級醇含量的上升，賦予葡萄酒厚重的口感和玫瑰類香氣。同時混合發(fā)酵各組均產(chǎn)生了新物質(zhì)，增加了葡萄酒風味體系的豐度。主成分分析結(jié)果表明，4個酒樣間存在顯著差異，其中畢赤克魯維酵母HSX-5和戴爾有孢圓酵母YQX-8發(fā)酵酒樣主要貢獻香氣種類較多且氣味活度值較高，對葡萄酒香氣的影響顯著。結(jié)果表明，菌株HSX-5和YQX-8更具有增香釀造潛力，后續(xù)工作可進一步探索促進香氣的機理以及和釀酒酵母的協(xié)同作用機理。