仿刺參晝夜節(jié)律相關基因的篩查和表達分析

劉曉魯，孫景春，高煥鑫，林承剛*

(1.中國科學院海洋生態(tài)與環(huán)境科學重點實驗室，山東 青島 266071；2.中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島 266003；3.青島海洋科學與技術國家實驗室海洋生態(tài)與環(huán)境科學功能實驗室，山東 青島 266237；4.中國科學院海洋大科學研究中心，山東 青島 266071；5.中國科學院海洋牧場工程實驗室，山東 青島 266071；6.中國科學院大學，北京 100049)

引 言

大多數(shù)生物體內(nèi)都存在生物節(jié)律(biorhythm)，又稱為生物鐘(biological clock)，不論是真菌、細菌亦或是人類，生物鐘都會影響其一生中各項生命活動。生物節(jié)律可按照其循環(huán)周期分為近年節(jié)律(circannual rhythm)和晝夜節(jié)律(circadian rhythm)等[1-2]。近年節(jié)律包括與生物季節(jié)性周期變化相關的行為，如動物的生理行為(魚類洄游、候鳥遷徙)，植物的四季變化(發(fā)芽、開花、結果、落葉)等[2]；晝夜節(jié)律是研究的最為深入生物節(jié)律，包括哺乳動物的睡醒周期、血壓變化等生理活動[3-5]，甚至近年來有研究表明，人體內(nèi)淋巴細胞在血液和淋巴系統(tǒng)中的生理節(jié)律運動與日月交替同步，一天中不同時間點的適應性免疫反應的強度不一樣[6]；在昆蟲中發(fā)現(xiàn)成蟲羽化節(jié)律(adult emergence rhythms)周期約為24 h，果蠅Drosophilapseudoobscura集中在黎明前后羽化，隨著光周期的變化其羽化高峰會發(fā)生轉移[7]；蜜蜂伴隨著太陽升起探采花蜜，蚊蟲在傍晚成群出沒都屬于晝夜節(jié)律運動[8]。

仿刺參(Apostichopusjaponicus，Selenka)又稱為刺參，屬棘皮動物門，海參綱，刺參科[9]，是我國重要的海水養(yǎng)殖品種[10]。仿刺參作為一種底棲動物，長期處于一種黑暗、光照強度較低的環(huán)境中，在白天光照強度較高時，會躲避并棲息于礁石、大型海藻葉片等隱蔽處；而在日落之后直至凌晨天亮之前，活動較為活躍，表現(xiàn)出較為典型的負趨光性特征。張碩等[11]在研究不同光照以及人工礁模型對仿刺參行為影響時發(fā)現(xiàn)，在只有光照沒有人工礁的條件下，大部分的仿刺參會停留在光照強度比較低的區(qū)域但個別仿刺參仍具有活動的現(xiàn)象；在光照和人工礁都存在的條件下，大部分仿刺參會停留并聚集在人工礁內(nèi)或人工礁的陰影區(qū)域，且會長時間保持。由此可見，光照對于刺參來說是一種影響其活動節(jié)律的重要環(huán)境因子，光照周期的變化可能形成了仿刺參的晝夜活動節(jié)律。因其活躍的攝食活動發(fā)生在夜晚所以仿刺參被認為是一種晝伏夜出的動物。孫佳敏等[12]研究表明，給予仿刺參近似于自然光照周期(12L：12D)的條件，在光照階段時其攝食活動比例較低，而在黑暗階段，仿刺參從20:00的攝食活動開始活躍，比例迅速增加，在0—2:00時間段達到攝食高峰，隨后黑暗階段轉入光照條件下時，仿刺參的攝食比例迅速下降，比例幾乎為0，這佐證了仿刺參晝夜活動節(jié)律。光照是否為影響刺參晝夜活動節(jié)律的唯一環(huán)境因子？孫佳敏等[12]發(fā)現(xiàn)在全光照條件下(24 L)，仿刺參仍然會從20:00開始增大攝食比例，到0:00和02:00之間達到峰值(13%)，隨后下降；而在全黑暗條件下(24 D)仿刺參一直處于活躍狀態(tài)，但整體夜晚較白天更為活躍?？梢娫诟淖児庹諚l件下仿刺參仍然能夠保持其晝夜攝食節(jié)律，推測是由于其體內(nèi)的生物鐘所控制的內(nèi)源性節(jié)律。晝夜節(jié)律受相關生物鐘基因的節(jié)律性表達調(diào)控，生物鐘基因編碼的蛋白作為轉錄因子調(diào)控其靶基因的節(jié)律性表達，而形成自主調(diào)控的循環(huán)，其中一小部分被稱為經(jīng)典生物鐘基因(clock gene，CG)，包括CLOCK、TIM、PER、CYC(一種果蠅基因，相當于哺乳動物中的BAML1)等[13]。生物鐘基因與啟動子區(qū)域的特殊位點結合進而通過轉錄—翻譯多反饋環(huán)路彼此之間相互作用，促進蛋白磷酸化形成、構建或破壞二聚體結構等方式形成一個24 h的時鐘環(huán)路[14-15]。本研究將初步探究仿刺參全基因組中的生物鐘基因，并利用不同光照條件下仿刺參觸手的轉錄本數(shù)據(jù)[16]以表征光照對仿刺參生物鐘基因表達變化。

1 方法

1.1 生物鐘基因的篩查

在KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)搜索哺乳動物(Circadian rhythm，map04710)和果蠅(Circadian rhythm-fly，map04711)的晝夜節(jié)律通路，在KEGG Genes數(shù)據(jù)庫中下載通路中的每一個基因的蛋白序列。在NCBI下載仿刺參的蛋白質(zhì)序列(Genbank accession number: MRZV00000000)，用于仿刺參相關基因的篩查。

1.2 基因同源比對

利用本地Blastp(https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/sra.cgi?view=software.NCBI SRA Toolkit, version 2.7.1)將下載的同源基因序列與仿刺參基因組蛋白序列進行雙向對比，得到刺參中相應的候選同源基因，序列對比的E-value設為1e-10，并選取最小E-value的同源基因認為是最佳仿刺參生物鐘候選同源基因。

1.3 生物鐘基因的表達分析

根據(jù)作者已有不同光照條件下(黑暗對照組，120 lx光照5 min，120 lx光照1 h)仿刺參觸手的RNA-Seq數(shù)據(jù)[16](SRA accession number：PRJNA590004)，分析仿刺參生物鐘基因的表達量變化情況。

具體而言，9只健康的成體仿刺參(體重103.59～120.84 g)，購買于山東東方海洋科技有限公司。實驗前，將仿刺參暫養(yǎng)在循環(huán)儲水桶中適應1周，每天喂食一次，暫養(yǎng)溫度為13.8 ℃至16.5 ℃。實驗開始前，所有仿刺參隨機分為三組，其中一組為黑暗條件對照組(“Dark”)。其他兩組的仿刺參暴露于大約120 lx的光強環(huán)境下，一組暴露5 min(“Lt5m”)，另一組暴露1 h(“Lt1h”)。三組在黑暗條件下的實驗玻璃水缸中適應1 d。實驗開始于早晨8點，在暴露于不同環(huán)境條件后，立即解剖仿刺參并收集觸手樣品，經(jīng)液氮速凍并保存與-80 ℃以用于后續(xù)的RNA提取和測序。從三組仿刺參觸手中提取RNA樣品(3組×3個重復)并進行RNA質(zhì)量檢測。1 ug的total RNA為建庫起始RNA，純化后的cDNA文庫在Illumina Novaseq 6000平臺進行2×150bp paired-end測序。

2 結果

晝夜節(jié)律是一種內(nèi)源性生物鐘，在無外環(huán)境誘導下可大約維持24 h。通過整理KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫中哺乳動物和果蠅的晝夜節(jié)律通路每個基因，共篩選得到參考生物鐘成員基因18個，其中CLOCK、BAML1/CYC和PER基因被認為是兩個通路中共存基因。根據(jù)數(shù)據(jù)庫的記錄，部分基因有多個同工酶或由不同亞基組成，總計篩選得到29個參考基因，其KEGG基因編號列于表1中。Blastp搜索結果發(fā)現(xiàn)，絕大部分晝夜節(jié)律通路成員同源基因在仿刺參基因組中被鑒定出來，包括經(jīng)典生物鐘基因的CLOCK和BMAL1/CYC基因；少數(shù)基因雖然匹配到候選基因，但并非目標同源基因，如RORA(RAR-related orphan receptor alpha)和VRI(Vrille)基因，并且未鑒定出仿刺參中CKI1的epsilon亞基。除此之外，未能鑒定出任何一條DEC、PER基因的同源基因。總的來說，18個生物鐘基因共鑒定出15個同源基因，但均未完全覆蓋任何一種通路。

表1 仿刺參基因組中晝夜節(jié)律通路成員基因的同源性匹配結果

表2 不同光照下仿刺參觸手轉錄本數(shù)據(jù)中部分生物鐘基因表達情況

圖1 仿刺參生物鐘基因在不同光照下的表達模式

重新分析不同光照環(huán)境下仿刺參觸手轉錄本數(shù)據(jù)中上述生物鐘基因的表達變化以初步探究光照條件改變是否影響仿刺參節(jié)律。結果發(fā)現(xiàn)，在此轉錄本數(shù)據(jù)中只有CLOCK基因在Lt1h:Lt5m組具有顯著下調(diào)表達(log2FC=-1.120 9，q-value=0.007 3)，除此之外在Lt1h:Lt5m中還發(fā)現(xiàn)BMAL1/CYC(log2FC=-0.274 74)和TIM(log2FC=-0.792 95)也具有下調(diào)表達趨勢。未發(fā)現(xiàn)有生物鐘基因在Dark:Lt1h或Dark:Lt5m組有顯著差異表達情況。隨后將所有生物鐘基因在不同光照條件下的表達量繪制聚類熱圖以直觀表示光照對生物鐘基因表達量的影響。結果表明，Dark組和Lt5m具有較相似的表達模式；除RBX1和AMPK以外，幾乎所有的生物鐘基因均在Lt5m組上調(diào)表達，在Lt1h組下調(diào)表達，就表達模式而言，光照能夠在一定程度上影響生物鐘基因在仿刺參中的表達量。

3 討論

生物節(jié)律普遍存在于生物的各級水平，是生命科學的重大基礎理論問題[17]。生物節(jié)律由機體的內(nèi)源性生物鐘驅動和調(diào)控，生物鐘不停地自激振蕩，同時根據(jù)接收到的外界環(huán)境周期性變化的信號來調(diào)控自振激蕩，使機體生命活動的節(jié)律與環(huán)境同步，隨外界環(huán)境的晝夜變化有節(jié)奏地、協(xié)調(diào)地進行[18]。生物鐘存在機體的幾乎所有細胞中，其在細胞功能中產(chǎn)生節(jié)律，使生物過程24 h與環(huán)境保持一致[2,19]。生物體的光受體接受光-暗周期信號，通過一系列生物鐘基因表達變化，調(diào)節(jié)效應器的活動并與環(huán)境周期保持同步，是不同生物的生物鐘運作的普遍分子機制[17,20]。盡管不同生物的生物鐘基因的表達調(diào)控模式有所區(qū)別，但目前研究表明，從果蠅到哺乳動物的生物鐘基因具有同源性[21-22]，分化性[23]，結構多態(tài)性[24-25]，基因結構保守性[26]。本研究結果也表明，針對哺乳動物和果蠅的晝夜節(jié)律通路成員基因，在仿刺參基因組中找到了絕大多數(shù)的同源基因，支持了仿刺參的晝伏夜出的習性是其內(nèi)源性生物鐘調(diào)控結果，但大多數(shù)模式生物為晝行性晝夜節(jié)律，且PER等關鍵基因未能匹配到同源基因說明仍需要對仿刺參的晝夜節(jié)律調(diào)控機制進行深入探究。

在果蠅中，CLOCK和CYC均為轉錄因子，通常以異二聚體形式發(fā)揮正性調(diào)節(jié)作用。PER和TIM兩種基因啟動子的E-框是其作用的目標靶。CLOCK：CYC異二聚體能夠激活PER和TIM基因轉錄生成相應蛋白，而且也激活VRI、PDF、CCG等基因生成蛋白質(zhì)或引起相應生物學效應[27]。昆蟲的行為節(jié)律受光周期制約，而在這種制約機制中光周期所起的作用是給內(nèi)源性行為節(jié)律提供所需的時間信號[8]。轉錄本數(shù)據(jù)表明，在Lt1h:Lt5m組，CLOCK表達量顯著下調(diào)，BMAL1/CYC也具有下調(diào)的趨勢，CLOCK:CYC異二聚體下調(diào)表達可能會減弱這種正向調(diào)節(jié)作用，除了未檢索到的PER同源基因，CLOCK:CYC異二聚體激活的TIM在Lt1h:Lt5m也具有下調(diào)趨勢。上述生物鐘基因下調(diào)表達能夠減弱生物體的生物學效應，說明人為施加光源刺激能夠在一定程度上干擾仿刺參節(jié)律，減弱其活動。仿刺參本是一種晝伏夜出的生物，在白天光照充足下活動較弱，棲息于自然界中光強較低的陰影處。孫佳敏等[12]的行為學實驗也表明非正常的自然光照能夠影響仿刺參攝食節(jié)律，結合轉錄本數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，生物鐘基因在光照后5 min先上調(diào)表達，在光照1 h又下調(diào)表達，推測可能是仿刺參對突如其來的非常規(guī)光照刺激的一種應激表達現(xiàn)象；但是在5 min到1 h之間，生物鐘基因受光照刺激后恢復正常的調(diào)控表達模式，下調(diào)表達以給予機體減弱活動的信號。

因目前尚未有任何關于仿刺參晝夜節(jié)律基因的研究，且大多數(shù)關于仿刺參自然狀態(tài)下的行為研究集中于攝食活動與光照影響的行為特征，關于晝夜節(jié)律參考較少。本研究仍存在一定局限性，參考了人和果蠅晝夜節(jié)律通路，兩者與仿刺參親緣性仍較遠，是否存在仿刺參特有晝夜節(jié)律基因仍需要系統(tǒng)和全面的研究；本文選取的為仿刺參觸手只是仿刺參的局部組織，其它重要組織如體壁、管足等是否為重要的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)組織仍待考究，且本實驗未進行生理實驗驗證，需要更全面和更深入的進一步探究，以填補經(jīng)典生物鐘基因的空白部分，闡明仿刺參的晝夜節(jié)律。