添加復(fù)合酶制劑和復(fù)合菌制劑對凡納濱對蝦免疫指標(biāo)、抗病力以及腸道和肝胰腺健康的影響

熊瑩槐,羅曉春,錢雪橋, 黃錦爐,劉緒博,彭書華

(1.廣東海大集團(tuán)股份有限公司畜牧水產(chǎn)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部微生態(tài)資源養(yǎng)殖利用重點實驗室，廣東 廣州 511400；2.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006)

引 言

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)又名南美白對蝦，是中國和世界范圍內(nèi)三大養(yǎng)殖對蝦種類之一[1]，具有鹽度適應(yīng)能力強(0.5～50)，適溫范圍廣(6～39℃)，生長速度快，抗病力強，肉質(zhì)鮮美等特點，深受消費者喜愛。

近幾十年來，隨水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展，作為水生動物飼料主要原料的魚粉開始出現(xiàn)供應(yīng)短缺，價格不斷上漲，在水生生物飼料中用植物蛋白替代魚粉已經(jīng)成為一種流行趨勢[2-3]。相對于動物蛋白，蝦類無法利用植物蛋白存在的諸多抗?fàn)I養(yǎng)因子，如植酸鹽、大豆抗原蛋白等[4-6]。營養(yǎng)攝入不足和殘留餌料對水質(zhì)的污染會持續(xù)損害養(yǎng)殖對蝦的健康，對其免疫功能造成損害。

飼料添加復(fù)合酶制劑可以顯著提高水產(chǎn)動物對飼料植物蛋白的消化吸收能力，甚至在一定程度上可以提高水生動物的免疫能力[7-8]。例如，王國霞等[4]報道飼料添加植酸酶和復(fù)合酶可以提高黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)抗氧化能力和腸道健康狀況。武明欣等[9]發(fā)現(xiàn)飼料中木聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶或其復(fù)合酶的添加可以顯著提高刺參的生長和免疫能力。

此外，復(fù)合菌制劑在對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中也起到重要作用。隨全球?qū)ξr市場的不斷擴大[10]，高密度養(yǎng)殖對蝦模式已經(jīng)被廣泛運用[11-12]，這使蝦持續(xù)暴露在人工次優(yōu)的養(yǎng)殖條件下，水環(huán)境污染嚴(yán)重，大量繁殖的有害微生物會進(jìn)一步影響對蝦的生長、發(fā)育和健康[13]。飼料益生菌的添加可以在一定程度上緩解養(yǎng)殖弊端，可以抑制腸道致病菌過度生長，有助于調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡，進(jìn)一步提高宿主的免疫力[14]。

本實驗通過在飼料中添加復(fù)合酶制劑，復(fù)合菌制劑以及復(fù)合菌酶制劑來研究復(fù)合酶制劑和復(fù)合菌制劑對凡納濱對蝦免疫力，腸道和肝臟健康狀況以及抗病毒能力的影響，以期為凡納濱對蝦健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)計

本實驗分別設(shè)計了1個對照組和3個處理組，其中，A為對照組，基礎(chǔ)飼料(主要成分見表1)；B為基礎(chǔ)飼料+酶制劑(消化酶和非淀粉多糖酶等復(fù)合酶)；C為基礎(chǔ)飼料+復(fù)合菌制劑組(復(fù)合菌由嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母和糞鏈球菌構(gòu)成)；D為基礎(chǔ)飼料+復(fù)合菌酶制劑(主要由嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母和糞鏈球菌復(fù)合菌與消化酶和非淀粉多糖酶等復(fù)合酶)。飼料制劑購于歐科拜克生物有限公司(洛陽，河南，中國)。菌酶制劑通過攪拌的方法與飼料均勻混合，B組酶制劑濃度為150 mg/kg，C組復(fù)合菌濃度為2×109cfu/g，D組菌、酶濃度分別為2×109cfu/g、150 mg/kg；飼料中添加的菌、酶劑量均為25 g/kg。每個處理組分別設(shè)4個重復(fù)，每個重復(fù)分別放養(yǎng)100尾蝦。

表1 基礎(chǔ)飼料的主要成分

本實驗于廣州海鷗島試驗基地進(jìn)行，將實驗用蝦養(yǎng)殖在400 L白色塑料桶中。對蝦購買運回時養(yǎng)殖用水鹽度17。首先進(jìn)行馴化暫養(yǎng)階段，暫養(yǎng)時間為10 d。暫養(yǎng)期間保持合適充氧，定時測定水溫，定時投喂適量基礎(chǔ)飼料，并且將養(yǎng)殖用水的鹽度每天提升2，逐漸馴化直到鹽度升至養(yǎng)殖用水的自然鹽度31。馴化暫養(yǎng)結(jié)束后穩(wěn)定兩天，準(zhǔn)備進(jìn)行正式實驗。

馴化暫養(yǎng)結(jié)束后，將實驗用蝦饑餓一天。然后選取規(guī)格相近，無病無傷、健康活潑的凡納濱對蝦分輪次隨機放入16個相同規(guī)格的400 L塑料桶中，每次放入對蝦10尾，共放10輪即每個養(yǎng)殖桶中共放凡納濱對蝦100尾，在放蝦過程中稱量并記錄每個重復(fù)中蝦的總重量。然后進(jìn)行45 d的養(yǎng)殖實驗。養(yǎng)殖過程中，使水溫保持27 ℃左右，溶氧高于5 mg/L，養(yǎng)殖用水鹽度31，酸堿度8.0±0.1。養(yǎng)殖水質(zhì)使用多功能YSI專業(yè)水質(zhì)分析儀進(jìn)行測定(Yellow Spring Instrument Co., Yellow Spring, Ohio, USA)。每天于上午8:30及下午5：00定時投喂，每天的投喂量以對蝦體重3%～5%為準(zhǔn)。每次投喂前分別收集養(yǎng)殖桶底部的殘餌、糞便，同時換水1/3～2/3。每天檢查并記錄對蝦的攝食和死亡情況。在45天養(yǎng)殖實驗結(jié)束后采集對蝦血清和肝臟進(jìn)行指標(biāo)檢測。

養(yǎng)殖實驗結(jié)束后，在養(yǎng)殖條件不變的情況下將取樣后剩余的蝦正常飼喂穩(wěn)定后進(jìn)行攻毒實驗。每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)15尾蝦。穩(wěn)定飼喂3 d后，開始向每個處理組養(yǎng)殖桶中潑灑副溶血弧菌(所用副溶血弧菌來自海大集團(tuán)微生物實驗室)。具體操作如下：將副溶血弧菌經(jīng)活化后接種于營養(yǎng)肉湯(NB)，28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)18～24 h，后將培養(yǎng)菌液8 000 g離心5 min，用海水重懸潑灑到各處理養(yǎng)殖桶，使各處理養(yǎng)殖桶中副溶血弧菌的終濃度為1×108cfu/mL。攻毒實驗持續(xù)兩周，攻毒期間養(yǎng)殖條件不變。每天觀察記錄對蝦的活動、攝食及死亡情況。

1.2 樣品采集與指標(biāo)測定

1.2.1 血清等樣品采集

養(yǎng)殖周期結(jié)束后，對蝦饑餓處理一天。使用一次性無菌注射器(1 mL)在對蝦腹部血竇中緩慢抽取血淋巴置于1.5 mL無菌離心管中，并置于4 ℃的冰箱過夜。次日用無菌針頭搗碎離心管中的血凝塊，在4 ℃環(huán)境下，3 000 r/min的條件下離心10 min，使用滅菌槍頭將血清轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管中，之后需保存到-80 ℃冰箱中備用。

1.2.2 血清非特異免疫酶的測定

血清超氧化物歧化酶(Superoxide dismutse, SOD)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP)、酸性磷酸酶(Acid phosphatase, ACP)、溶菌酶(Lysozyme, LSZ)均通過南京建成生物工程研究所試劑盒進(jìn)行檢測，具體步驟嚴(yán)格按照說明書的要求進(jìn)行。

1.2.3 腸道和肝臟切片制作與觀察

截取凡納濱對蝦腸道和肝臟，用10%中性福爾馬林固定24 h后，紗布包裹組織塊緩水沖洗8 h，用梯度酒精逐步?jīng)_洗組織塊水分。酒精梯度為：70%，2 h；80%，2 h；90%，2 h；95%，1 h；100% Ⅰ，1 h；100% Ⅱ，1 h。然后將組織依次放入1∶1酒精：二甲苯溶液、二甲苯溶液I和二甲苯溶液Ⅱ，分別處理20 min、15 min和15 min。在58 ℃條件下，將處理后的組織依次放入1∶1二甲苯-石蠟混合液、石蠟(軟)、石蠟(硬)中分別處理30 min、1 h和1 h。使用切片機對石蠟進(jìn)行切片，并將切片附著于玻璃板上，于37 ℃烘箱過夜。

選用H.E染色法對切片進(jìn)行染色，染色溫度為35 ℃，染色液為蘇木素-伊紅染液。染色前，先對切片進(jìn)行脫臘處理。具體方法詳見楊乾等[15]。將制作好的組織切片放于顯微鏡下觀察，并拍照保存。

1.3 數(shù)據(jù)計算與統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±S.E.)表示。利用SPSS 22.0對凡納濱對蝦以上各指標(biāo)的變化作單因子方差分析(e-Way ANOVA)和Duncan’s多重比較檢驗，并以P<0.05作為差異顯著水平。

2 結(jié)果

2.1 血清免疫指標(biāo)

如圖1—圖4所示，飼料復(fù)合酶制劑和菌制劑顯著提高了凡納濱對蝦血清SOD酶、AKP酶、ACP酶和LSZ酶的活性(P< 0.05)，其中飼料單一添加復(fù)合菌制劑(C組)的促進(jìn)效果顯著優(yōu)于單一添加酶制劑(B組)(P< 0.05)。飼料中同時添加復(fù)合菌酶制劑(D組)對凡納濱對蝦血清超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶的促進(jìn)效果最好，顯著高于單一飼料制劑添加組(P< 0.05)。

圖1 不同處理凡納濱對蝦血清超氧化物歧化酶含量情況

圖2 不同處理凡納濱對蝦血清堿性磷酸酶含量情況

圖3 不同處理凡納濱對蝦血清酸性磷酸酶含量情況

圖4 不同處理凡納濱對蝦血清溶菌酶含量情況

2.2 攻毒后死亡情況

在對凡納濱對蝦進(jìn)行副溶血弧菌攻毒試驗后，對蝦死亡率在0～8 d逐步上升，在第8天基本穩(wěn)定。穩(wěn)定后，對照組A組的死亡率為80%，飼料添加復(fù)合酶制劑、菌制劑和菌酶制劑均能降低攻毒后對蝦的死亡率，B、C、D組的死亡率分別為61%，45%和28%(圖5)。

圖5 不同處理凡納濱對蝦攻毒后累計死亡率情況

2.3 腸道和肝臟切片

由組織切片可觀察到本實驗?zāi)c道和肝臟切片染色整體效果較好。相比于對照組(A)和復(fù)合酶制劑組(B)，復(fù)合菌制劑組(C)和復(fù)合菌酶制劑組(D)凡納濱對蝦腸道結(jié)構(gòu)完整，腸道上皮層與基膜緊密連接，細(xì)胞游離面的微絨毛排列更為整齊、緊密。復(fù)合酶制劑組(B)凡納濱對蝦腸道部分上皮層與基膜浮離，個別上皮細(xì)胞脫落；對照組(A)凡納濱對蝦腸道結(jié)構(gòu)疏松，腸上皮層與基膜全部浮離，上皮細(xì)胞脫落(圖6)。

對照組A組凡納濱對蝦肝胰腺部分肝小管壞死或基膜破損，部分B細(xì)胞體積增大，數(shù)量減少，出現(xiàn)大量R細(xì)胞。飼料添加酶制劑和菌制劑均可以改善凡納濱對蝦肝胰腺的健康狀態(tài)。飼料同時添加菌酶制劑時(D組)，凡納濱對蝦肝小管排列較為整齊，較為緊密，B細(xì)胞與R細(xì)胞數(shù)量均較為豐富(圖7)。

圖7 不同處理凡納濱對蝦肝臟切片

3 討論

添加酶制劑和菌制劑可以顯著提高水產(chǎn)動物的生產(chǎn)性能和健康水平已經(jīng)被廣泛報道[13-14，16-17]。本實驗結(jié)果也表明飼料中添加復(fù)合酶制劑(消化酶和非淀粉多糖酶)和復(fù)合菌制劑(嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母和糞鏈球菌)可顯著提高凡納濱對蝦的生長性能和免疫能力。飼料菌制劑和酶制劑的添加均可以提高凡納濱對蝦的特定生長率，同時添加菌酶制劑比單獨添加酶制劑效果好。

在不良環(huán)境下，水生動物會受到刺激產(chǎn)生大量活性氧，如果過量的活性氧未能被機體及時清除，則會嚴(yán)重?fù)p害機體的健康，造成免疫損傷[18-20]。水生動物主要依靠SOD等抗氧化酶來分解活性氧[21]。本實驗發(fā)現(xiàn)，飼料中酶制劑和菌制劑的添加均可以顯著提高凡納濱對蝦的SOD酶活性，表明了飼料制劑的添加可以提高對蝦的抗氧化能力，且添加菌制劑效果優(yōu)于酶制劑，同時添加效果最好。

AKP和ACP酶是兩種能夠?qū)?yīng)底物去磷酸化的酶，對鈣質(zhì)和磷酸鈣的形成起到重要作用，是水生動物不可缺少的酶類[22]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼料菌制劑和酶制劑的添加可以顯著提高凡納濱對蝦AKP和ACP酶的活性，且同時添加效果最好。此外，盧彤巖等[23]認(rèn)為ACP和AKP會參與機體代謝和蛋白質(zhì)的合成，在生物營養(yǎng)吸收上起到重要作用。同樣地，本實驗也發(fā)現(xiàn)ACP和AKP活性高的組凡納濱對蝦的生長性能更好。

LZM是水生動物重要的非特異性免疫因子，主要來源于巨噬細(xì)胞，對外源性物質(zhì)具有相關(guān)性破壞作用，可以用來指示水生動物的免疫能力和對寄生蟲、細(xì)菌以及病毒的抵抗能力[24]。相似地，本研究發(fā)現(xiàn)，飼料中菌制劑和酶制劑的添加均可以顯著提高凡納濱對蝦的LZM活性，表明飼料制劑的添加顯著增強了對蝦的免疫性能。通過對凡納濱對蝦的副溶血弧菌攻毒實驗進(jìn)一步印證了此效果：飼料酶制劑和菌制劑的添加均顯著提高了凡納濱對蝦在受到副溶血弧菌攻毒后的存活率，且同時添加菌酶制劑效果最好。

組織石蠟切片是組織學(xué)常規(guī)制片技術(shù)中最為廣泛應(yīng)用的方法，是病理學(xué)用以研究、觀察及判斷細(xì)胞組織的形態(tài)變化的主要方法。本實驗通過制作凡納濱對蝦腸道石蠟切片觀察到相比于對照組和復(fù)合酶制劑組，復(fù)合菌制劑組和復(fù)合菌酶制劑組凡納濱對蝦腸道細(xì)胞與底膜連接緊密，腸細(xì)胞形態(tài)更為完整，細(xì)胞排列整齊緊密，細(xì)胞核飽滿，說明凡納濱對蝦飼料中添加復(fù)合菌制劑和復(fù)合菌酶制劑可以促進(jìn)對蝦腸道的發(fā)育和健康。這種腸道促進(jìn)作用可能是來源于飼料中添加的微生物，因為研究結(jié)果表明腸道有益菌可以與病菌爭奪腸道表面吸附位點、營養(yǎng)物質(zhì)和能量，還可以通過改變腸道微環(huán)境來抑制病菌增長，從而維持腸道平衡和健康[17]。此外，本實驗通過制作凡納濱對蝦肝胰腺石蠟切片觀察到，對照組A組凡納濱對蝦肝胰腺部分肝小管壞死或基膜破損，部分B細(xì)胞體積增大，數(shù)量減少，出現(xiàn)大量R細(xì)胞。而B、C組基膜相對A組較為完整，說明飼料添加酶制劑和菌制劑均可以改善凡納濱對蝦肝胰腺的健康狀態(tài)。另外，切片結(jié)果顯示，飼料同時添加菌酶制劑時(D組)，凡納濱對蝦肝小管排列最為整齊、緊密，B細(xì)胞與R細(xì)胞數(shù)量均較為豐富。結(jié)合攻毒實驗結(jié)果來看，D組的存活率最高，而A組最低，說明肝胰腺對凡納濱對蝦生長和健康至關(guān)重要，其主要功能是分泌膽汁，進(jìn)行蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物的異化和同化，儲存、解毒、產(chǎn)生抗體等[25]。當(dāng)肝組織出現(xiàn)異常時，這些功能就會受影響甚至喪失。本實驗發(fā)現(xiàn)，飼料酶制劑和菌制劑可以提高凡納濱對蝦在本養(yǎng)殖條件下肝臟的健康程度，且同時添加具有協(xié)同作用，效果更好。

4 結(jié)論

本實驗發(fā)現(xiàn)在飼料中添加復(fù)合酶制劑，復(fù)合菌制劑可以顯著提高凡納濱對蝦的生長性能、免疫水平和抗副溶血弧菌能力。且研究結(jié)果表明，凡納濱對蝦飼料中酶制劑和菌制劑起到協(xié)同作用，同時添加效果最好。