NSCLC患者惡性胸水中H19下調(diào)miR-203對肺癌細胞侵襲能力的影響

劉帥妹,王 妹,杜雨軒,程文亮,李 潔,葛曉軍

0 引 言

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，并且是世界上死亡率最高的癌癥[1-4]。非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)占總體肺癌組織類型的80%～85%[5-6]。NSCLC的早期治療主要以手術(shù)治療為主，但早期無明顯癥狀，大部分患者確診時已是晚期，失去了手術(shù)治療的最佳時機[7-8]，此時，化療成為了治療NSCLC的主要手段，但部分患者對化療的療效并不佳[9-10]。隨著靶向治療的出現(xiàn)，NSCLC的治療取得了一定的進展，患者的生存率及生存質(zhì)量得到了提高[11-12]，但是總體治愈率及生存率仍然很低，尤其在出現(xiàn)癌細胞轉(zhuǎn)移的患者中。

據(jù)統(tǒng)計，15%肺癌患者在就診初期患有惡性胸腔積液(malignantpleuraleffusion,MPE)，多達50%的肺癌患者在疾病過程中發(fā)展為MPE[13]。MPE的癌癥按頻率高低依次為肺癌、乳腺癌、淋巴瘤、泌尿生殖道癌和胃腸道癌等[14]。臨床上，MPE的預后較差，中位生存期為3到12個月，具體取決于腫瘤的組織學類型。NSCLC導致的MPE在臨床上很常見，其伴有MPE中的癌細胞多為轉(zhuǎn)移癌細胞，與原發(fā)灶來源的癌細胞相同且易于獲取。

長非編碼RNA(LncRNA)是一組長度大于200nt的RNA，位于細胞核或細胞質(zhì)中[15]。雖然lncRNA不具有編碼蛋白質(zhì)的功能，但它的發(fā)現(xiàn)促進了非編碼RNA領域的研究進展[16]。H19是一種受C-MYC調(diào)控的LncRNA[17]。在肺癌、乳腺癌、膀胱癌等中H19表達明顯升高起促癌作用，而抑制H19的表達能限制腫瘤的進展[18-20]。Lv等[21]研究表明H19的表達可通過與miR-29b-3p結(jié)合介導BC膀胱癌細胞增殖、遷移，并促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生；Yang等[22]表明H19的高表達抑制結(jié)腸癌細胞中miR-138的表達而促進HMGA1蛋白表達介導細胞發(fā)生遷移。H19的高表達抑制了miR-200a的功能，從而上調(diào)了miR-200a的靶基因ZEB1和ZEB2，從而增強了肺癌的增殖和轉(zhuǎn)移[23]。本研究旨在探究NSCLC患者惡性胸水中H19的表達水平及其與miR-203的調(diào)控關系，以探究NSCLC致病的分子機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象收集2019年6至2021年5月遵義醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院檢驗科132例NSCLC胸水標本。平均年齡(59.8±14.2)歲，男78例，女54例。納入標準：所有研究對象均無心、肝、腎等器官合并癥及其他感染，無糖尿病、自身免疫相關性或免疫性疾病，3個月內(nèi)未用過免疫抑制劑及激素等藥物。排出標準：①合并嚴重基礎疾病或器官功能不全者；②失訪患者。惡性胸水診斷標準：通過體查及影像學檢測確診胸水，引流穿刺取胸水，行脫落細胞學和病理學檢測見腫瘤細胞，免疫組化檢測確定為癌細胞，并結(jié)合臨床診斷為腫瘤。在樣本采集時，所有患者均未接受任何抗結(jié)核、抗癌、皮質(zhì)類固醇或其他非甾體抗炎藥等藥物的治療，且患者在住院前3個月內(nèi)沒有接受過任何直接進入胸膜腔的侵入性手術(shù)或遭受胸部創(chuàng)傷。收集胸水標本放入冰箱中保存。本研究得到了遵義醫(yī)科大學倫理委員會的批準(批準號：20200525)，患者均簽署知情同意書。

1.2主要試劑與儀器RPMI-1640、胎牛血清購自德國SigmaAldrich公司；普通光學顯微鏡購自日本Nikon Corporation公司；TRIzol試劑、玻璃特氟隆均質(zhì)器、ABI 7500系統(tǒng)購自美國Invitrogen 公司；PCR引物購自深圳市華大基因科技服務有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自武漢博斯特生物科技有限公司；CCK-8試劑購自武漢生物有限公司；酶標儀購自美國Bio-Rad公司；Matrigel Transwell室購自美國Corning Incorporated公司；免疫一抗和二抗購自英國Abcam公司；化學發(fā)光試劑盒購自美國Cell Signaling Technology公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒美國Promega Corporation公司。

1.3細胞培養(yǎng)

1.3.1 胸水中腫瘤細胞的培養(yǎng)收集NSCLC患者的胸水，1200 r/min離心5 min，離心半徑為10 cm,吸取紅細胞上層灰白色細胞于細胞培養(yǎng)瓶中，并加入含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2天更換一次培養(yǎng)液，待細胞達到80%～90%融合時傳代培養(yǎng)。用普通光學顯微鏡觀察到細胞貼壁后使用PBS沖洗，去掉紅細胞及其他懸浮細胞后進行培養(yǎng)。

1.3.2細胞純化待所培養(yǎng)細胞狀態(tài)穩(wěn)定后收集細胞制成細胞懸液，用異硫氰酸標記的CD133抗體孵育，進行流式分選，將CD133陽性的細胞進行培養(yǎng)。

1.4方法

1.4.1 Western blot檢測細胞內(nèi)蛋白表達將純化后的細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，提取細胞RNA進行qRT-PCR檢測細胞內(nèi)H19及miR-203的表達，提取細胞蛋白通過Western blot檢測細胞內(nèi)CDH1、SNAL1和Vimentin蛋白表達。根據(jù)H19的相對表達水平，將患者分為H19高表達組(腫瘤/對照≥1.5)和H19低表達組(腫瘤/對照<1.5)，健康供者為對照組。 根據(jù)miR-203的相對表達水平，將患者分為miR-203高表達組(腫瘤/對照≥2.0)和miR-203低表達組(腫瘤/對照≤2.0)。在螢光素酶檢測分析中，健康供者為空白對照組，未加入miR-203激活劑和miR-203抑制劑為陰性對照組，加入miR-203激活劑為miR-203激活劑組，加入miR-203抑制劑為miR-203抑制劑組。在EMT標記蛋白的變化分析，未加入miR-203抑制劑和H19抑制劑為陰性組，加入miR-203抑制劑和H19抑制劑為miR-203抑制劑+H19抑制劑組，加入miR-203抑制劑為miR-203抑制劑組。

1.4.2CCK-8檢測細胞增殖能力采用胰蛋白酶消化細胞后1200 r/min離心5 min，離心半徑為10 cm,去上清，加入培養(yǎng)基將細胞稀釋至2×103/孔接種于96孔板中，于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱孵育。在接種135 d后每種細胞選取3孔，加入CCK-8混合液(基礎培養(yǎng)基：CCK-8溶液為10∶1)200 μL/孔，孵育3 h后，用全波長酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度值，繪制細胞生長曲線。

1.4.3Transwell檢測細胞侵襲能力在冰浴下將Matrigel基質(zhì)膠用基礎培養(yǎng)基稀釋至300～400 μg/mL，在transwell小室中加入100 μL/孔，于37 ℃培養(yǎng)箱撫育過夜。收集細胞，用基礎培養(yǎng)基稀釋至5×105個/mL后加入含基質(zhì)膠的transwell小室上層每孔200 μL，下層加入500 μL含10%FBS培養(yǎng)基，37 ℃孵育24 h，用棉簽擦去上室細胞，將小室浸泡于甲醇中固定30 min，風干后加入1%結(jié)晶紫染色20 min，用PBS清洗3遍，在400倍顯微鏡下隨機拍攝10個視野并計數(shù)細胞。

1.4.4流式細胞術(shù)檢測細胞周期及凋亡收集細胞，PBS清洗后棄上清，用1mL預冷PBS重懸細胞沉淀，緩慢加入至3 mL預冷的無水乙醇中，吹打混勻，4 ℃固定過夜。1200 r/min離心5 min，離心半徑為10 cm,棄上清，加PBS靜置15 min，棄上清，加入周期檢測試劑，應用流式細胞儀檢測樣本熒光強度，檢測細胞周期。收集細胞，PBS清洗后棄上清，進行細胞計數(shù)(1×105～1×106個)按說明書加入凋亡檢測試劑染色后30 min內(nèi)完成細胞凋亡檢測。

1.4.5H19及miR-203表達調(diào)控通過轉(zhuǎn)染miRNA下調(diào)細胞內(nèi)H19的表達后，提取細胞RNA進行qRT-PCR檢測細胞內(nèi)H19及miR-203的表達，提取細胞蛋白通過Western-blot檢測細胞內(nèi)CDH1、SNAL1和Vimentin表達，通過CCK-8檢測細胞增值能力，transwell檢測細胞侵襲能力，流式細胞術(shù)檢測細胞周期及凋亡。通過RNA高表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染上調(diào)細胞內(nèi)miR-203的表達，提取細胞RNA進行q-RT-PCR檢測細胞內(nèi)miR-203的表達，細胞提取細胞蛋白并檢測CDH1、SNAL1和Vimentin的表達，檢測細胞增殖能力、細胞侵襲能力、細胞周期及凋亡。通過構(gòu)建野生型和突變型H19 3′-UTR結(jié)合序列的熒光素酶報告和分析TCGA(https://cancergenome.nih.gov/))的公開數(shù)據(jù)集，探討H19與miR-203之間的關系。

2 結(jié) 果

2.1 H19高表達對NSCLC細胞增殖及侵襲的影響與對照組(2.46±1.31)比較，H19高表達組在轉(zhuǎn)染細胞的H19表達水平(13.36±4.18)明顯升高(P<0.05)；與對照組細胞增殖速度比較，H19高表達組在培養(yǎng)72 h后增殖明顯加快。見圖1。H19高表達組的細胞侵襲能力(45.76±11.86)較對照組(13.90±5.76)明顯增強(P<0.05)。見圖2。

與對照組比較，*P<0.05

a:對照組; b:H19低表達組; c:H19高表達組

2.2H19和EMT表達的相關性與對照組比較，H19高表達組細胞轉(zhuǎn)移相關的間質(zhì)細胞表面標記物N-cadherin及Vimentin蛋白的表達明顯升高，而與黏附相關的上皮細胞表面標記物CDH1蛋白表達卻降低，提示H19表達升高與腫瘤細胞EMT相關。見圖3。

2.3H19和miR-203表達的相關性H19高表達組的生存時間[(59.22±20.97)個月]較H19低表達組[ (85.70±13.12)個月]明顯縮短(P<0.05)，即H19高表達與NSCLC的預后不良相關。見圖4。而miR-203高表達組生存時間[(64.15±25.89)個月]較miR-203低表達組生存時間[(55.44±26.65)個月]明顯延長(P<0.05)。見圖5,表1。H19與miR-203的表達呈負相關(r=-0.66,P<0.01)。通過分析TCGA(https://cancergenome.nih.gov/))的公開數(shù)據(jù)集，證實H19和miR-203的表達呈負相關 (r=-0.13,P<0.05)。與H19低表達組比較，H19高表達組導致肺腺癌患者的累積生存率顯著降低(P<0.05)。見圖5。然而，與miR-203低表達組比較，miR-203高表達組肺腺癌患者的累積生存率顯著提高(P<0.05)。見圖5。因此，H19高表達可能通過抑制miR-203的表達直接或間接影響疾病的進程。

圖 4 H19表達高低的總體生存率

圖 5 公共數(shù)據(jù)集TCGA進行H19及miR-203表達的生存分析

2.4H19高表達通過下調(diào)miR-203促進腫瘤細胞的EMT與H19突變型比較，H19野生型的熒光素酶活性受到miR-203 激活劑顯著抑制(P<0.05)；且miR-203抑制劑組較空白對照組能顯著提高H19細胞的熒光素酶活性(P<0.05)。見表1。此外，與陰性組比較，miR-203抑制劑組能抑制上皮標志物CDH1的表達，并促進間質(zhì)標志物SNAI1和Vimentin的表達(P<0.05)，見表2。然而，與陰性組比較，miR-203抑制劑+H19抑制劑組能促進上皮標志物CDH1的表達，且抑制間質(zhì)標志物SNAI1和Vimentin的表達(P<0.05)，見表2,圖6。因此，H19高表達可通過下調(diào)miR-203促進腫瘤細胞的EMT。

表 1 螢光素酶檢測miR-203與H19直接結(jié)合作用分析

表 2 miR-203或H19調(diào)控后細胞中EMT標記蛋白的變化分析

1: 陰性組; 2: miR-203 抑制劑+H19 抑制劑組； 3:miR-203抑制劑組

3 討 論

世界衛(wèi)生組織2018年公布的腫瘤發(fā)病及死亡情況表明，每年全球新增肺癌患者約209.4萬例, 死亡約176.1萬例, 分別占全部惡性腫瘤的11.6%和18.4%[24]。目前，肺癌的發(fā)病年齡逐漸趨于年輕化，且隨著年齡增長和環(huán)境污染等因素日趨嚴重，肺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢[25]。NSCLC的發(fā)病率占肺癌發(fā)病率的 80%[26]。NSCLC是目前全世界范圍內(nèi)發(fā)病率與致死率均居前列的惡性腫瘤[27]。NSCLC進展速度較快，大多數(shù)患者確診時已是中晚期，失去了手術(shù)治療的機會?；熕幬锏某霈F(xiàn)很大程度上的改善了患者生存期，然而，經(jīng)過一段時間的治療后絕大多數(shù)NSCLC患者出現(xiàn)了耐藥現(xiàn)象和復發(fā)現(xiàn)象，使化療效果大打折扣，縮短了患者的生存期[28-29]。目前根本性的治療NSCLC原發(fā)灶存在重大困難，因此，從MPE中尋找新型的靶向特異性分子以降低肺癌細胞的侵襲能力可能成為NSCLC治療的新方向。

近年來，LncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及耐藥中的作用是現(xiàn)在的研究熱點[30]。LncRNA不僅在細胞中充當中間載體的輔助性角色，而且承擔著調(diào)控功能，如X染色體沉默、基因組印記、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄途徑的激活和干擾、核內(nèi)運輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程[31]。H19是一種在腫瘤中差異表達的長非編碼RNA[32]。有體外研究發(fā)現(xiàn)H19的高表達促進了腫瘤的增殖，增加了腫瘤細胞的遷移和侵襲，降低了對化療的敏感性，表明H19在腫瘤的發(fā)生和癌癥的發(fā)展中起著重要的作用[33]，分析結(jié)果與上述結(jié)果一致，即H19高表達可導致NSCLC細胞的增殖及侵襲增強相符合，原因是因為H19可通過激活多條下游通路，導致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及免疫逃逸[34]。同時其也在是預后不良及療效較差通路的交匯中心發(fā)揮重要作用。本研究通過對總體生存分析發(fā)現(xiàn)，H19的高表達與NSCLC患者預后不良有關，提示H19作為NSCLC預后生物標志物具有潛在的應用價值。

研究表明，在各種癌癥中，lncRNA H19通過作為miRNAs的海綿來介導EMT[35-38]。最近有報道，miR-203在EMT核心網(wǎng)絡中發(fā)揮重要作用，該核心網(wǎng)絡在腫瘤進展過程中作為控制上皮細胞可塑性的開關而發(fā)揮作用[39]。已有報道，H19通過miR-484及ROCK2途徑導致肺癌細胞侵襲及遷移能力增強，并誘導了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生[40]。正如本研究結(jié)果示：上皮標志物CDH1表達降低同時伴隨間充質(zhì)標志物SNAI1和Vimentin表達增加以及H19表達增強都提示EMT在促進細胞侵襲中起中介作用。由于上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)在腫瘤的轉(zhuǎn)移及耐藥中的作用已經(jīng)得到越來越多的認可[41]，表現(xiàn)為上皮基因表達降低，間質(zhì)細胞基因表達升高，導致腫瘤細胞表型發(fā)生了改變，如細胞形態(tài)改變、粘附力喪失及干細胞樣特征[42]。EMT還參與了細胞的其他病理過程，包括腫瘤的轉(zhuǎn)移及耐藥。

既往的研究表明，發(fā)現(xiàn)miR-203表達降低與轉(zhuǎn)移性腫瘤有關[43]。而且，miR-203在各種癌細胞系中的高表達導致EMT過程的抑制，如細胞增殖、遷移、侵襲和腫瘤轉(zhuǎn)移[44]。這本研究結(jié)果一致，即H19負調(diào)控miR-203，H19可減弱miR-203誘導的EMT過程，EMT標記蛋白Vimentin、SNAI1表達增加，上皮標記蛋白CD1表達降低。通過抑制H19的表達降低腫瘤的增殖、侵襲及增加miR-203的表達，使腫瘤細胞凋亡增多。由于miR-203在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起負調(diào)控作用，即miR-203在大部分腫瘤患者中表達降低，且miR-203高表達后腫瘤細胞趨于凋亡[45]；另有研究表明miR-203通過下調(diào)RGS17抑制NSCLC的細胞增殖、侵襲和遷移[33]。通過調(diào)控H19的高表達會使細胞內(nèi)miR-203表達降低及間質(zhì)細胞表面抗原的表達升高，說明H19的高表達通過負向調(diào)控miR-203基因從而使腫瘤產(chǎn)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化介導腫瘤轉(zhuǎn)移。

綜上所述，H19高表達可誘導肺癌細胞發(fā)生EMT，促進肺癌細胞的侵襲。miR-203與H19在EMT過程中的直接結(jié)合效應表明，H19介導的EMT改變中可能是一個潛在的調(diào)控網(wǎng)絡。因此，H19有望成為NSCLC的治療靶點，對指導臨床用藥具有潛在的應用價值。