七氟烷代謝產(chǎn)物游離六氟異丙醇對(duì)大鼠蘇醒期的影響

曹 銳，周 濤，張 敏，林芷萱，楊小霖

0 引 言

七氟烷因其味道芳香、血/氣分配系數(shù)小、誘導(dǎo)及蘇醒迅速等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于臨床麻醉。進(jìn)入體內(nèi)的七氟烷，大部分以原型經(jīng)呼吸道排出體外，少部分(2%～5%)可在體內(nèi)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，生成六氟異丙醇(hexafluoro-isopropanol, HFIP)，約85%的HFIP很快與葡萄糖醛酸基團(tuán)結(jié)合成為無(wú)活性的結(jié)合型HFIP并經(jīng)腎排出，而剩余15%的HFIP則以游離形式存在于體內(nèi)，且具有生物活性[1]，可能影響七氟烷的麻醉效能。HFIP在SD大鼠的最低肺泡有效濃度(minimum alveolar concentration，MAC)為0.004 4%，表明其具有強(qiáng)大的麻醉效能[2]，可能對(duì)麻醉恢復(fù)質(zhì)量產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)使用2.32%濃度的七氟烷對(duì)SD大鼠進(jìn)行麻醉，檢測(cè)麻醉不同時(shí)長(zhǎng)后大鼠血中游離HFIP的生成情況，并觀察其對(duì)大鼠蘇醒時(shí)間和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力恢復(fù)時(shí)間的影響，為七氟烷的相關(guān)研究及臨床使用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取8～10周齡，體重220～250 g的成年雄性清潔級(jí)SD大鼠52只，由川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SYXK(川)2018-076。SD大鼠飼養(yǎng)在溫度20～26 ℃，濕度50%～60%，12 h光照/12 h黑暗的SPF級(jí)動(dòng)物房中，麻醉前自由攝取水和食物。

1.2儀器與試劑SPB-3全自動(dòng)空氣源(北京中惠普分析技術(shù)研究所)；SPH-300A氫氣發(fā)生器(北京中惠普)；Technologies 7890A氣相色譜儀；7A-23D電動(dòng)吸引器(江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備公司)；CP323C電子天平(奧豪斯儀器有限公司)；Ugo動(dòng)物麻醉機(jī)(Ugo Basile，意大利)；七氟烷專用蒸發(fā)器(Vaor 2000，德國(guó))；轉(zhuǎn)棒疲勞儀(ZH-300B，安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司),麻醉箱、溫度檢測(cè)儀、光照強(qiáng)度監(jiān)測(cè)儀等。上述實(shí)驗(yàn)設(shè)備均由川北醫(yī)學(xué)院麻醉實(shí)驗(yàn)中心提供。七氟烷，120 mL/瓶，購(gòu)置于上海恒瑞醫(yī)藥有限公司；六氟異丙醇，10 mL/瓶，購(gòu)置于Sigma aldrich公司。

1.3氣相色譜儀配置及參數(shù)六通閥；250 μL定量環(huán)；氣相色譜儀毛細(xì)管柱(型號(hào)HP-5)325 ℃，30.00 m × 320.00 μm × 0.25 μm；柱箱溫度：45 ℃；氫離子火焰檢測(cè)器溫度：200 ℃；后進(jìn)樣口溫度：100 ℃；氫氣流速30 mL/min；空氣流速400 mL/min，氮?dú)饬魉?0 mL/min。

1.4建立七氟烷和HFIP標(biāo)準(zhǔn)曲線配制已知濃度的HFIP或七氟烷標(biāo)準(zhǔn)氣體，與本小組前期實(shí)驗(yàn)方法相同采用倍比稀釋法建立峰面積和濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，用于血液中HFIP濃度的測(cè)定以及七氟烷揮發(fā)罐的校正[3]。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程需滿足R2>0.999和其濃度范圍需涵蓋待測(cè)物質(zhì)的濃度兩個(gè)條件。

1.5大鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力訓(xùn)練參照Gong等[4]大鼠訓(xùn)練方法，在麻醉前1 d、麻醉前1 h使用上述轉(zhuǎn)棒疲勞儀對(duì)大鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)平衡能力訓(xùn)練。打開(kāi)儀器，設(shè)置轉(zhuǎn)速為20 r/min，將大鼠置于轉(zhuǎn)棒式疲勞儀上，記錄大鼠在儀器上行走時(shí)間，若大鼠在儀器上行走時(shí)間<5 min就發(fā)生掉落，則讓大鼠休息5～10 min后，再進(jìn)行下一次訓(xùn)練；每天大鼠有5次機(jī)會(huì)進(jìn)行訓(xùn)練，若大鼠能在儀器上連續(xù)行走5 min不掉落，則當(dāng)天訓(xùn)練結(jié)束。選取能通過(guò)該訓(xùn)練的大鼠進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.6大鼠分組及麻醉后實(shí)驗(yàn)將通過(guò)訓(xùn)練的48只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成3組(0.5 h組、1 h組、1.5 h組)，每組16只。3組大鼠分別接受2.32%濃度的七氟烷麻醉0.5 h、1.0 h及1.5 h。

設(shè)置室溫為25 ℃，打開(kāi)氧氣瓶及麻醉機(jī)，調(diào)節(jié)氧流量為2 L/min，開(kāi)啟麻醉?yè)]發(fā)罐至校正刻度，待5 min后麻醉箱內(nèi)七氟烷濃度穩(wěn)定在2.32%時(shí)，將大鼠放入麻醉箱中，并開(kāi)始計(jì)時(shí)。每組大鼠麻醉至對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)后隨機(jī)選取8只開(kāi)腹經(jīng)腹主動(dòng)脈采血5～10 mL，參照本小組前期實(shí)驗(yàn)方法，在37 ℃下采用頂空二次平衡法測(cè)定SD大鼠血中游離HFIP含量和血/氣分配系數(shù)[5-6]。剩余8只大鼠到達(dá)麻醉時(shí)間后迅速將其轉(zhuǎn)移至另一通氣良好的透明箱中，置于仰臥位，觀察大鼠從停止麻醉到翻正反射恢復(fù)的時(shí)間，并記錄為蘇醒時(shí)間。大鼠翻正反射恢復(fù)判斷標(biāo)準(zhǔn)為：處于仰臥位的大鼠能夠恢復(fù)正常體位，即四腳同時(shí)著地的狀態(tài)[7]。當(dāng)大鼠翻正反射恢復(fù)后，以1.5 min作為間隔時(shí)間，在每個(gè)間隔時(shí)間段中進(jìn)行1次運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力測(cè)試。測(cè)試時(shí)將大鼠置于轉(zhuǎn)速為20 r/min的轉(zhuǎn)棒疲勞儀上，觀察大鼠在儀器上的行走時(shí)間，當(dāng)大鼠能在儀器上連續(xù)行走1 min不發(fā)生掉落時(shí)結(jié)束實(shí)驗(yàn)。觀察大鼠從翻正反射恢復(fù)到通過(guò)轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)測(cè)試的時(shí)間，并記錄為麻醉后大鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力恢復(fù)時(shí)間。在麻醉及蘇醒過(guò)程中監(jiān)測(cè)大鼠肛溫。控制大鼠蘇醒時(shí)的環(huán)境噪音在40～60分貝、光照強(qiáng)度在200～260勒克斯。完成實(shí)驗(yàn)后使用水合氯醛麻醉，并行頸部脫臼處死大鼠。

2 結(jié) 果

本次研究共使用52只SD大鼠在麻醉前進(jìn)行運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力訓(xùn)練，最終48只通過(guò)該訓(xùn)練，通過(guò)率約為92%。在37 ℃條件下測(cè)得SD大鼠HFIP血/氣分配系數(shù)為453.18±74.20。

3組大鼠在使用1 MAC濃度的七氟烷麻醉后翻正反射均消失，經(jīng)不同時(shí)間麻醉后血中游離HFIP含量、蘇醒時(shí)間、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力恢復(fù)時(shí)間見(jiàn)表1。結(jié)果顯示1 h組大鼠體內(nèi)游離HFIP含量明顯高于0.5 h組和1.5 h組(P<0.01)；0.5 h組大鼠麻醉后意識(shí)恢復(fù)時(shí)間最長(zhǎng)，較1 h及1.5 h組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但1 h和1.5 h兩組間比較，大鼠麻醉后意識(shí)恢復(fù)時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組大鼠麻醉后運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力恢復(fù)時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表 1 各組大鼠麻醉后血中游離HFIP含量、蘇醒時(shí)間、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力恢復(fù)時(shí)間比較

3 討 論

本小組前期研究發(fā)現(xiàn)，使用七氟烷麻醉后，少部分七氟烷經(jīng)肝生物轉(zhuǎn)化生成的游離HFIP在血中的含量與七氟烷麻醉時(shí)間及使用濃度密切相關(guān)。李明[8]等研究表明，在正常肝功能患者中，使用1 MAC濃度的七氟烷麻醉后，血中游離HFIP在1 h時(shí)達(dá)峰值(0.065%)，而后隨著麻醉時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低。Feng等[6]使用0.5 MAC、1 MAC、1.5 MAC濃度的七氟烷對(duì)患者進(jìn)行麻醉后，觀察到使用1 MAC濃度的七氟烷麻醉后生成的HFIP含量最高，且同樣在麻醉后1 h時(shí)測(cè)得患者血中游離HFIP濃度最大(0.081%)，但當(dāng)七氟烷麻醉濃度升高至1.5 MAC時(shí)，游離HFIP的生成反而受到抑制。盡管HFIP本身具有麻醉作用，但HFIP麻醉作用的體現(xiàn)與其生成量在腦中的分壓密切相關(guān)。故本實(shí)驗(yàn)選擇在前期實(shí)驗(yàn)中生成HFIP最大含量的1 MAC七氟烷濃度(大鼠為2.32%)對(duì)大鼠進(jìn)行0.5 h、1 h、1.5 h麻醉[9]，旨在探討其代謝產(chǎn)物游離HFIP對(duì)大鼠蘇醒及運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力恢復(fù)的潛在影響。

大量研究將翻正反射恢復(fù)作為嚙齒類動(dòng)物使用麻醉藥物后蘇醒的指標(biāo)[10-13]。轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)可用于嚙齒類動(dòng)物運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力的相關(guān)研究[14]，故本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察大鼠麻醉后通過(guò)轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)的時(shí)間作為麻醉后運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力恢復(fù)的時(shí)間[15]。在對(duì)儀器轉(zhuǎn)數(shù)設(shè)置時(shí)，需綜合考慮大鼠重量、旋轉(zhuǎn)棒直徑及摩擦力、訓(xùn)練周期長(zhǎng)短等因素。前期本課題組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)本實(shí)驗(yàn)所用儀器轉(zhuǎn)速設(shè)置為20 r/min時(shí)，大鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力訓(xùn)練通過(guò)率為90%，與Gong等[5]研究的通過(guò)率相似，故選擇該轉(zhuǎn)速對(duì)大鼠進(jìn)行訓(xùn)練并對(duì)其運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力恢復(fù)情況進(jìn)行評(píng)估。由于環(huán)境溫度、噪音分貝、光照強(qiáng)度等環(huán)境因素均可對(duì)動(dòng)物覺(jué)醒、運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生影響[16-17]。因此，本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格參照實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)環(huán)境要求進(jìn)行，控制環(huán)境溫度為25.5～26.5 ℃、環(huán)境噪音在40～60分貝之間、光照強(qiáng)度在200～260勒克斯之間。另因晝夜節(jié)律可能會(huì)對(duì)麻醉后翻正反射產(chǎn)生影響[18]，故該實(shí)驗(yàn)均安排在上午完成且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，避免給予大鼠任何傷害性操作。

本研究發(fā)現(xiàn)，使用2.32%濃度的七氟烷麻醉大鼠不同時(shí)長(zhǎng)后，血中游離HFIP生成量在麻醉1 h時(shí)最高，但并未導(dǎo)致大鼠麻醉后恢復(fù)時(shí)間明顯延長(zhǎng)。推測(cè)盡管HFIP有著潛在的麻醉作用，但因其組織/氣分配系數(shù)很大(本研究測(cè)得血/氣分配系數(shù)為453.18)，較低濃度的游離HFIP在腦組織中所產(chǎn)生的分壓尚不足以對(duì)麻醉后恢復(fù)產(chǎn)生明顯影響，這一結(jié)論與前期本小組實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似[6，8]。本研究結(jié)果顯示，使用2.32%濃度的七氟烷麻醉大鼠0.5 h后蘇醒時(shí)間略長(zhǎng)于麻醉1 h及1.5 h。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是由于在吸入麻醉初期以藥物攝入為主，組織攝入藥物速率大于排出速率[19]。麻醉0.5 h后停止使用七氟烷，其在大鼠體內(nèi)可能尚未達(dá)到飽和，七氟烷在組織中的排出速率較達(dá)到飽和時(shí)的速率緩慢，從而導(dǎo)致0.5 h組大鼠停止麻醉后蘇醒時(shí)間比1 h、1.5 h組略長(zhǎng)。該結(jié)果可能具有一定的臨床意義，推測(cè)在臨床上1 h以內(nèi)的短小手術(shù)單獨(dú)使用七氟烷麻醉，患者的蘇醒可能會(huì)受到暫時(shí)的影響，但尚需臨床試驗(yàn)加以證實(shí)。同時(shí)本研究結(jié)果顯示，使用2.32%的七氟烷麻醉大鼠0.5 h、1 h及1.5 h后，3組運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力恢復(fù)時(shí)間比較無(wú)明顯差別，推測(cè)3組大鼠反正反射恢復(fù)后靶器官(腦和脊髓)中麻醉氣體分壓相似，藥物排除速率相同，從而導(dǎo)致3組大鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力恢復(fù)情況無(wú)顯著性差異。但在臨床麻醉實(shí)踐中，高濃度、長(zhǎng)時(shí)間使用七氟烷麻醉后，即使患者意識(shí)已經(jīng)恢復(fù)，仍需密切觀察患者運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力恢復(fù)情況，避免因蓄積在脂肪、肌肉等組織中的麻醉藥物再次轉(zhuǎn)移到血液及腦組織中，而引起呼吸抑制等不良事件的發(fā)生。

綜上所述，在1.5h內(nèi)使用2.32%濃度的七氟烷麻醉大鼠后運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力恢復(fù)時(shí)間不受麻醉時(shí)長(zhǎng)的影響，但1 h以內(nèi)的麻醉可使其麻醉恢復(fù)時(shí)間相對(duì)延長(zhǎng)。血中七氟烷代謝產(chǎn)物游離六氟異丙醇含量對(duì)大鼠蘇醒期無(wú)明顯影響。