Hsa_circ_0000128通過miR-623/EIF4A1軸促進人胃腺癌細胞增殖和遷移的機制研究

王亞東，曹碧月，高生寶，王雪君，步雪峰

0 引 言

胃癌在世界常見腫瘤中發(fā)病率居第四位，是癌癥相關死亡的第三大原因，僅次于肺癌和肝癌[1]。胃癌分為早期胃癌和晚期胃癌，腫瘤的分期決定了治療效果和治療決策，如早期胃癌患者行根治性手術，后期同時進行化療治療，術后5年生存率為90%，因此，胃癌的治療效果是可以接受的[2]。但是，如目前常用的癌胚抗原、CA199等腫瘤標記物，在胃癌早期診斷中陽性率較低，因此，需要發(fā)現(xiàn)一種更有效的早期胃癌診斷標志物[3]。環(huán)狀RNA(CircRNAs)是一種特殊非編碼RNA，廣泛存在于生物體內(nèi)[4-5]。不僅與人類許多疾病密切相關，且具有潛在的癌癥診斷與生物治療價值[6]。其本身為閉合環(huán)狀結構，可不受外切酶影響，遂在細胞內(nèi)更加穩(wěn)定[7]。

MicroRNA(miRNAs)是一種小型非編碼RNA，可通過抑制信使RNA(mRNA)翻譯或促進mRNA降解在逆轉后水平上調(diào)控基因表達，正確調(diào)控miRNA的表達是維持平衡生理環(huán)境的必要條件，這些小分子幾乎影響細胞周期檢查點、細胞增殖到細胞凋亡的所有遺傳途徑，其靶基因范圍廣泛，干預著疾病的發(fā)生發(fā)展[8-10]。

本研究篩選出環(huán)狀hsa_circ_0000128暫未有相關研究，該研究探討hsa_circ_0000128在胃癌組織、細胞株中的表達及其對胃癌細胞增殖、遷移及凋亡的機制。探討作為早期診斷標志物及可能作為治療的分子靶點的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 標本來源選取2019年11月至2020年8月至江蘇大學附屬人民醫(yī)院病理科的40份胃腺癌及癌旁組織標本。術前均未接受任何放、化療。其中取距離胃癌組織外緣5 cm的組織作為癌旁組織。病理科收取組織后液氮罐中運輸至實驗室-80 ℃冰箱，已備進一步使用。本研究經(jīng)過江蘇大學附屬人民醫(yī)院倫理委員會批準(批準號：K-20200058-Y)，患者均簽署知情同意書。

1.1.2材料高通量測序(上海歐易生物醫(yī)學技術有限公司)；人胃癌細胞MGC-803、BGC-823、HGC-27(中國科學院上海生科院細胞資源中心)；正常人胃黏膜上皮細胞株GES-1(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；胎牛血清(BI公司)；RPMI 1640、DMEM培養(yǎng)基(BI公司)；Trizol試劑(Ambion life technologies)；小干擾RNA(si-RNA,蘇州吉瑪基因股份有限公司)、miR干預試劑(上海生工生物有限公司)；PCR引物(蘇州吉瑪基因股份有限公司)；逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)；Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (南京厚載生物科技有限公司);過表達質(zhì)粒、hsa_circ_0000128-WT、hsa_circ_0000128-Mut與mimics/miR-NC(湖州河馬生物科技有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(南京福麥斯生物技術有限公司)；兔抗Bcl-2、EIF4A1(杭州華安生物技術有限公司);兔抗 cleaved-caspase-3(CST公司)；兔抗Bax(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.1 環(huán)狀RNA及miR-623的篩選收集5對胃腺癌組織及癌旁組織(距離腫瘤>10 cm),上海歐易生物公司，通過第二代測序技術檢測全基因組序列，使用DE-Seq軟件對樣本檢測結果經(jīng)行處理，進行差異顯著性分析。挑選出表達差異的環(huán)狀RNA hsa_circ_0000128，通過數(shù)據(jù)庫篩選出下游miR-623。

1.2.2細胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清的RPMI 1640、DMEM于飽和濕度的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)胃癌細胞BGC-823、HGC-27以及MGC-803，培養(yǎng)條件為37 ℃，5%CO2。

1.2.3RNA的提取及對hsa_circ_0000128、miR_623、EIF4A1相對表達量的檢測采用Trizol試劑提取胃癌及癌旁組織、胃癌細胞株、干預后胃癌細胞株及正常胃黏膜上皮細胞中總RNA.使用Nanodrop2000微量分光光度計檢測總RNA 濃度及純度。按照TAKARI逆轉錄試劑盒加樣步驟將RNA逆轉錄為cDNA,后按照試劑盒說明書配置20 μL PCR反應體系，反應體系配置方法為：10 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，環(huán)狀RNA上、下引物各0.4 μL，8.2 μL DEPC水以及1 μL cDNA。RT-PCR實驗程序為：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 5 s，62 ℃退火 30 s，40次循環(huán)，獨立樣本均設置3個復孔。在CFX96熒光定量PCR儀中進行RT-PCR反應，以2-ΔΔCt法反映hsa_circ_0000128、miR-623、EIF4A1的相對表達水平。Hsa_circ_0000128上游引物：5′-TCAGACACGACTTATCACCCAG-3′，下游引物：5′-GCAGATGGCACAAGCAAAG -3′，內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-CCCACTTCTCTCTAAGGAGAAT-3′下游引物：5′-TACACGAAAGCAATGCTATCAC-3′。miR_623上游引物：5′-GCCGAGTGGGTTGTCGGGGACG -3′，下游引物：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT -3′,U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT -3′，下游引物：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC -3′,EIF4A1上游引物：5′-CATCCAGCAGCGAGCCATTCTAC -3′，下游引物：5′-ACCAACCAGATGCCACTCTACCC -3′。根據(jù)RT-PCR在胃癌細胞株及胃上皮粘膜細胞中的結果選取表達量最多及最少的細胞系繼續(xù)后續(xù)實驗。

1.2.4細胞轉染將HGC-27、MGC-803細胞株分別接種于兩塊細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)板中設置相應的circRNA組別：Si-NC組(Si-NC轉染胃腺癌細胞)、Si-circ組(si-hsa_circ_0000128轉染胃腺癌細胞)、Si-EIF4A1組(Si-EIF4A1轉染胃腺癌細胞)、miR-NC組(miR-623-NC轉染胃腺癌細胞)、miR-mimics 組(miR-623-mimics轉染胃腺癌細胞)、miR-inh組(miR-623-inhibitors轉染胃腺癌細胞)、Si-circ +miR-NC組(Si-circ、miR-NC轉染胃腺癌細胞)、Si-circ +miR-inh組(Si-circ、miR-inh轉染胃腺癌細胞)。每孔接種細胞5×105個，溫箱培養(yǎng)12 h后待細胞貼壁。將按比例配置完全的干擾試劑通過LipofectamineTM 2000轉染于相對于的細胞孔中，更換無血清1640培養(yǎng)基培養(yǎng)4～6 h后重新?lián)Q至10%FBS 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后，提取相對應的RNA并進行RT-PCR驗證其轉染效率，轉染48 h后提取蛋白并進行目的蛋白的蛋白印跡實驗驗證其表達水平。同期進行相對應的細胞功能學實驗。

1.2.5細胞功能學實驗①克隆形成實驗：將轉染相對應干擾的MGC-803、HGC-27細胞分別接種在6孔板中(500個/孔)，每組設置3個復孔，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14 d，每3～5 d換液一次，經(jīng)常觀察，待平板中出現(xiàn)肉眼可觀察到的克隆團時終止培養(yǎng)，去除上清，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，加入4%甲醛溶液后置于4 ℃冰箱內(nèi)固定細胞15 min，再次使用PBS清洗3次，加入結晶紫溶液(1 mL/孔)染色，時長20 min，使用PBS清洗染色劑，空氣干燥。計數(shù)細胞的克隆數(shù)，公式如下：

克隆形成率(%)=(克隆數(shù)/接種細胞總數(shù))×100%

②TRANSWELL實驗：將轉染完成后的MGC-803、HGC-27貼壁細胞消化離心后置于無血清培養(yǎng)基中，于24孔板中加入600 μL 10%BI血清的培養(yǎng)液，后放置TRANSWELL小室，加入細胞數(shù)為1×104個的細胞懸液，于37 ℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)24 h后，棄置培養(yǎng)液，使用PBS清洗兩次，后4%甲醛溶液固定30 min，適當風干，后0.1%結晶紫溶液染色20 min，棉簽擦去上室中未遷移的細胞，再次使用PBS清洗3次，顯微鏡隨機挑選六個視野觀察，計數(shù)。

1.2.6檢測EIF4A1基因在胃癌中的表達及干預胃癌細胞株后相應的表達取干預后的MGC-803、HGC-27細胞，按1.2.2提取細胞RNA，后同前RT-qPCR驗證。

1.2.7蛋白印跡實驗檢測胃癌細胞株中相關凋亡蛋白及EIF4A1蛋白表達水平取干預后胃癌細胞MGC-803、HGC-27，在6孔板中加入每孔1 mL/孔配置完全的RIPA裂解液，冰上裂解15 min后，使用蛋白刮沿板孔壁反復刮取完全，后吸入1mL EP管中，100 ℃水浴鍋加熱5 min，煮沸完全后4000 rcf/min,離心5 min，取上清，按照BCA蛋白定量測定試劑盒操作步驟測定蛋白濃度，后按3∶1比例加入配置均勻的4×上樣緩沖液。

配置10% SDS-PAGE凝膠，80 V 電泳30 min，110 V電泳60 min，將蛋白按mark標識分子量大小切膠分離，350 mA轉膜110 min。觀察PVDF膜上是否存在mark條帶，存在則使用牛血清白蛋白常溫封閉條帶1.5 h，配置相關一抗按1∶1000稀釋后分別予條帶敷兔抗cleaved-caspase-3,Bcl-2, Bax,EIF4A1，兔多抗β-actin及GAPDH,4 ℃冰箱敷于育過夜，次日TBST洗膜3次，每次15 min，潔凈濾紙吸出殘留TBST后敷二抗，再次使用TBST洗膜3次，每次10分鐘。使用增強型化學發(fā)光試劑(ECL)顯影。Image J對蛋白條帶吸光度進行定量分析。

1.2.8熒光素酶驗證結合位點通過數(shù)據(jù)庫篩選出下游miR-623,通過熒光素酶實驗驗證結合位點。在24孔板內(nèi)培養(yǎng)胃癌細胞，將hsa_circ_0000128-WT、hsa_circ_0000128-Mut與mimics/miR-NC轉染至HGC-27和MGC-803細胞中，溫箱培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)基棄置，PBS緩慢洗滌2次，每孔中加入100 μL的1×Passive Lysis Buffer(由5×Passive Lysis Buffer加雙蒸水稀釋得到)，搖床震蕩30 min。吸取裂解產(chǎn)物，15 000 rfc/min,離心10 min，取20 μL上清至標記好的離心管，熒光素酶檢測儀檢測熒光值。

2 結 果

2.1 hsa_circ_0000128的篩選使用五組胃腺癌組織、癌旁組織進行高通量測序，篩選出相對表達量相對較大且尚未被研究的環(huán)狀RNA：hsa_circ_0000128，見圖1。

圖 1 高通量測序結果

2.2胃腺癌組織及胃癌細胞株中has_circ_0000128、miR-623的表達通過高通量測序篩選出環(huán)狀RNA(hsa_circ_0000128)，在胃腺癌組織和正常組織中的相對表達量。40例胃癌組織中hsa_circ_0000128的相對表達量顯著高于正常組織(P<0.05)。hsa_circ_0000128在3種胃癌細胞MGC-803、HGC-27以及BGC-823中的相對表達量均高于正常人胃黏膜上皮細胞GES-1(P<0.05)。通過數(shù)據(jù)庫分析預測circRNA下游具有表達差異的miRNA為miR-623，通過樣本PCR驗證miR-623在40例胃癌組織中含量均小于癌旁組織(P<0.05)，在胃癌細胞株中含量均低于正常胃正常粘膜上皮細胞(P<0.05)。結果所示在HGC-27與MGC-803中差異最明顯，后續(xù)挑選此兩種細胞株進行實驗研究。見圖2。

與GES-1比較，*P<0.05；與癌旁組織比較，#P<0.05

2.3hsa_circ_0000128的敲減效率及miR-623對應表達情況胃癌細胞轉染相應的si-circ-000128及si-NC 48h后，RT-qPCR法檢測胃癌細胞HGC-27、MGC-803中hsa_circ_0000128的表達水平，SI-circ組的相對表達量明顯低于SI-NC組(P<0.05)。轉染si-circ-0000128后miR-623的含量明顯升高，加入miRNA inhibitor后，SI-circ+miR-inh組較SI-circ+miR-NC組miR-623含量下降(P<0.05)。結果說明通過si-circ-0000128可明顯降低hsa_circ_0000128在在胃癌中的相對表達量，hsa_circ_0000128可作為miR-623的海綿，影響其表達。見圖3。

*P<0.05

2.4敲減hsa_circ_0000128對細胞凋亡的影響取干預后的胃癌細胞株提取對應蛋白進行Western-blot實驗結果顯示，SI-circ組Cleaved-caspase-3、Bax相對表達量較SI-NC組增加(P<0.05)；SI-circ組Bcl-2相對表達量較SI-NC組下降(P<0.05)，見圖4，表1。miR-623 inhibitor加入減緩了凋亡蛋白的表達，間接說明促進了細胞的凋亡，見圖5，表2。

1、2：分別為HGC-27細胞Si-NC組、Si-circ組； 3、4：分別為MGC-803細胞Si-NC組、Si-circ組

1、2：分別為HGC-27細胞SI-circ+miR-NC組、Si-circ+miR-inh組； 3、4：分別為MGC-803細胞SI-circ+miR-NC組、Si-circ+miR-inh組

表 1 敲減環(huán)狀RNA后細胞中凋亡蛋白表達情況

表 2 敲減環(huán)狀RNA加入miRNA抑制劑后細胞中凋亡蛋白表達情況

2.5敲減hsa_circ_0000128對細胞增殖的影響轉染相對應干擾48 h后，克隆形成實驗顯示，HGC-27和MGC-803中Si-circ組的克隆形成率[(11.57±1.724)%、(12.47±2.401)%]明顯低于Si-NC組[(32.53±3.250)%、(25.07±1.557)%]。加入miR-623 inhibitor后可逆轉抑制現(xiàn)象，SI-circ+miR-NC組克隆形成率為[(10.43±1.305)%、(12.50±1.400)%]明顯低于Si-circ+miR-inh組[(25.03±1.665)%、(19.63±1.955)%]，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。說明低表達的hsa_circ_0000128可抑制細胞增殖，敲低miR-623可挽救circRNA被敲減的情況進而增加細胞功能。

2.6敲減hsa_circ_0000128對細胞遷移的影響通過Transwell實驗表明，SI-circ組較SI-NC組遷移明顯降低(P<0.05)。miRNA inhibitor干預后可減輕影響，說明轉染si-circ-0000128可明顯降低胃癌細胞株的遷移能力，敲低miR-623可減輕相應表現(xiàn)。見圖6，表3。

圖 6 敲減環(huán)狀RNA hsa_circ_0000128將降低胃癌細胞遷移能力

表 3 不同干預組的胃癌細胞遷移數(shù)據(jù)比較

2.7熒光素酶結合靶點驗證將hsa_circ_0000128-WT熒光素酶報告質(zhì)粒轉染到miRNA的mimics中，與miR-NC相比，可顯著降低相對熒光素酶活性。Hsa_circ_000128-WT可以抑制miR-623熒光素酶活性，而突變型hsa_circ_0000128-Mut則對miR-623熒光素酶活性無明顯影響，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖7，表4。

圖 7 hsa_circ_0000128與miR-623靶點預測

表 4 熒光素酶驗證靶點驗證hsa_circ_0000128與miR-623關系

2.8hsa_circ_0000128通過miR-623靶向調(diào)節(jié)EIF4A1的表達通過Targetscan等數(shù)據(jù)庫預測簡單miR-623下游靶基因EIF4A1，見圖8。通過PCR驗證EIF4A1在40對胃癌組織(7.627±2.146)及胃癌細胞株HGC-27、MGC-803(2.757±0.211、1.967±0.130)表達較癌旁組織(5.343±1.507)、正常胃黏膜上皮細胞GES-1(1.020±0.125)中呈高表達，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。miR-623含量的增多會抑制EIF4A1的表達，見表5。使用蛋白免疫印跡實驗顯示當敲減hsa_circ_0000128時，EIF4A1的含量下降，當加入miR-623 inhibitor逆轉敲減circRNA情況時，EIF4A1的表達含量上升(P<0.01)，見圖9。綜上，hsa_circ_0000128通過競爭性結合miR-623促進胃腺癌細胞中EIF4A1的表達。

圖 8 miR-623與EIF4A1預測位點

表 5 胃癌細胞中miR-623含量對EIF4A1表達的影響

*P<0.05

3 討 論

盡管在胃癌相關研究方面有許多重大的進展，胃癌的發(fā)病已經(jīng)下降，尤其在發(fā)達國家，但胃癌仍是世界上最普遍的癌癥之一[11]。胃癌具有起病隱匿、早期易漏診、易轉移等特點[12]。為了改善胃癌治療的預后，迫切需要敏感、較特異的分子標志物及相關治療靶點，以獲得更好的診療效果[13]。circRNA是一種新的非編碼RNA，以往的眾多研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在眾多癌癥當中發(fā)揮相關作用，但其生物學機制仍不清楚，如hsa_circ_0000096與胃癌細胞增殖、遷移相關[14-15]。不同的circRNA在不同的腫瘤中含量也不同，通過過表達或者敲減相關circRNA導致不同腫瘤的生物學特性發(fā)生改變，從而影響其發(fā)生增殖、凋亡等不同變化，如hsa_circ_0001649 在胃癌細胞中表達下調(diào)，與胃癌病理分化程度顯著相關[16-18]。本實驗通過對5組胃癌標本及其相對應癌旁組織進行高通量測序，篩選出中高表達的hsa_circ_0000128進行研究。通過預實驗也可證實hsa_circ_0000128在胃癌組織及相關胃癌細胞株中高表達。由此表明環(huán)狀RNA hsa_circ_0000128在胃癌中可能發(fā)揮的是原癌基因的作用。

Zhang等[19]發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA CircNRIP1在胃癌中上調(diào)AKT1蛋白從而增強胃癌細胞增殖的能力，通過siRNA敲減CicrRNA后，導致胃癌細胞株的增殖、遷移及侵襲能力下降。Xie等[20]發(fā)現(xiàn)外泌體中環(huán)狀RNA CircSHKBP1通過影響熱休克蛋白HSP90從而影響胃癌細胞的生物學特性。本研究使用小干擾RNA干擾環(huán)狀RNA hsa_circ_0000128使其含量變化從而影響胃癌細胞株HGC-27、MGC-803的生物學特性的變化。下調(diào)環(huán)狀RNA后可明顯觀察到胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲等能力下降，同時促進細胞的凋亡。由此可見，hsa_circ_0000128可能成為胃癌的診斷及治療新的靶點，但其機制需進一步研究。

近年來，多數(shù)研究證明了circRNA與miRNA存在競爭性抑制關系，circRNA可以充當miRNA海綿的作用[21]。Shi等[22]發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA LPAR3海綿miRNA-198促進食管癌侵襲和轉移。Shang等[23]發(fā)現(xiàn)外泌體中circPACRGL通過miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1軸促進結直腸癌進展。本實驗預測hsa_circ_0000128可能影響miRNA的靶點及其相對應的蛋白EIF4A1。

EIF4A1為真核翻譯起始因子4A1,EIF4A1基因在胃癌細胞株中明顯高表達于正常胃上皮細胞，調(diào)控細胞的生長，在胃癌中存在促瘤效應，EIF4A1的減少將導致胃癌細胞的凋亡[24]。結果發(fā)現(xiàn)敲減hsa_circ_0000128后胃癌細胞內(nèi)EIF4A1含量也隨之下降，導致凋亡相關蛋白BCL-2及Bax的含量改變，其可能是導致胃癌凋亡的關鍵因素。

因此，本研究說明hsa_circ_0000128的高表達可能促進胃癌細胞的增殖、遷移及侵襲，抑制細胞的凋亡。其通過競爭性抑制miR-623上調(diào)EIF4A1影響胃癌的發(fā)生發(fā)展，降低環(huán)狀RNA的含量，胃癌細胞株HGC-27、MGC-803的細胞生物學效應也發(fā)生改變。本文尚可加大研究患者樣本數(shù)量，分類研究，同時還可以檢測術前、術后、及術后隨訪患者血清中環(huán)狀RNA的變化，完善hsa_circ_0000128在胃癌發(fā)生發(fā)展中所起到調(diào)控的作用,發(fā)掘其成為新的胃癌診療標志物的潛力。