24 小時(shí)尿18-羥皮質(zhì)醇含量對(duì)于不同性別腎上腺醛固酮腺瘤患者的診斷價(jià)值

胡志成，卞瑾，婁瑩，周憲梁，張慧敏，蔡軍，馬文君，趙蓓蓓，饒夢(mèng)華，佘旭輝

《中國(guó)心血管健康與疾病報(bào)告》指出目前我國(guó)高血壓患者約2.5億，這其中原發(fā)性醛固酮增多癥（原醛癥）是最為常見(jiàn)的繼發(fā)性高血壓原因之一[1]。難治性高血壓患者中原醛癥患病率高達(dá)17%～23%[2]。原醛癥共分6 種亞型，其中最常見(jiàn)的2 種亞型分別為特發(fā)性醛固酮增多癥（IAH）和腎上腺醛固酮腺瘤（APA），其他4 種亞型甚為罕見(jiàn)[3]。與IAH 的首選藥物治療不同，APA 的一線治療方案為單側(cè)腎上腺切除術(shù)。因此，從原醛癥患者中甄別出APA 尤為重要[4]。目前APA 診斷方法主要為雙側(cè)腎上腺靜脈采血（AVS）和腎上腺CT 掃描。作為金標(biāo)準(zhǔn)的AVS 為有創(chuàng)操作，價(jià)格昂貴，醫(yī)療可及性差，患者接受度低。而腎上腺CT 掃描診斷APA 的效能不佳[5]。作為鹽皮質(zhì)激素的一種，18-羥皮質(zhì)醇（18-OHF）在不同亞型的原醛癥患者中表達(dá)不同，國(guó)際及國(guó)內(nèi)指南中也指出該指標(biāo)有望用于原醛癥的分型鑒別[6-8]。既往研究結(jié)果顯示，女性APA 患者KNCJ5突變比例高于男性，進(jìn)而導(dǎo)致18-OHF 合成較男性患者更多[9]。因此，18-OHF 對(duì)于不同性別APA 患者的診斷效能可能存在差異。在檢測(cè)樣本方面，24 h 尿統(tǒng)計(jì)了人體全天通過(guò)尿液排泄的18-OHF 總量，有效避免了外周血18-OHF 濃度瞬時(shí)波動(dòng)的缺陷，是優(yōu)秀的檢測(cè)樣本[10]。鑒于此，本研究在原醛癥患者中開(kāi)展24 h 尿18-OHF 含量檢測(cè)、評(píng)估該指標(biāo)在不同性別APA 患者中的表達(dá)情況，以期探索該指標(biāo)對(duì)于APA 的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

連續(xù)入選2019年7月至2020年6月于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院高血壓病房住院的經(jīng)AVS 明確亞型的73 例原醛癥患者，其中女性30 例。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）拒絕AVS；（2）AVS 未成功；（3）庫(kù)欣綜合征或亞臨床庫(kù)欣綜合征；（4）其他原因引起的繼發(fā)性高血壓：腎實(shí)質(zhì)性高血壓、腎血管性高血壓、嗜鉻細(xì)胞瘤/副神經(jīng)節(jié)瘤、甲狀腺及甲狀旁腺疾病、主動(dòng)脈疾病等。

1.2 研究方法

收集患者的一般臨床資料，高血壓患者行立位醛固酮與腎素濃度比值（ARR）篩查，立位ARR ≥2.4 (ng/dl)/(mU/L) 且醛固酮濃度≥8 ng/dl（1 ng/dl=27.7 pmol/L）作為初篩陽(yáng)性，進(jìn)一步開(kāi)展卡托普利試驗(yàn)或生理鹽水抑制試驗(yàn)進(jìn)行確診。原醛癥以及原醛癥亞型的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2016年美國(guó)內(nèi)分泌學(xué)會(huì)原醛癥指南[8]。其中，卡托普利試驗(yàn)或生理鹽水抑制試驗(yàn)后2 h 血醛固酮濃度＞11.1 ng/dl 均診斷原醛癥。AVS 采取雙側(cè)非同步無(wú)促腎上腺皮質(zhì)激素刺激的采血法，術(shù)中行皮質(zhì)醇測(cè)定。選擇性指數(shù)≥1.5 提示插管成功，優(yōu)勢(shì)分泌指數(shù)≥2 提示存在單側(cè)優(yōu)勢(shì)分泌，診斷APA。所有入組原醛癥患者收集24 h 尿液檢測(cè)24 h 尿18-OHF 含量。本研究通過(guò)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)：2017-867），入組患者均簽署知情同意書(shū)。

1.3 尿18-OHF 的檢測(cè)

樣本前處理過(guò)程：取50 μl 患者24 h 尿液樣本于離心管中（校正曲線和質(zhì)控樣本同步處理），加入100 μl 18-OHF-d4 內(nèi)標(biāo)工作液、渦旋混勻 5 min，離心5 min（25℃，10 000 rpm，德國(guó)Eppendorf 5427R高速冷凍離心機(jī)）；加入350 μl 去離子水，渦旋混勻5 min；再次離心5 min（25℃，10 000 rpm）；取上清液待測(cè)。

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分析：本實(shí)驗(yàn)使用島津LC-20AD XR 高效液相色譜儀和AB SCIEX TRIPLE QUAD 4500 三重四極桿質(zhì)譜儀對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。采用 Sigma Asentis Express C18 色譜柱（50 mm×2.1 mm，2.7 μm）色譜柱進(jìn)行色譜分離，流動(dòng)相為水和甲醇均含有0.2%甲酸，流速為0.4 ml/min，梯度洗脫。采用電噴霧電離（ESI）源，選擇正離子模式下多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）掃描模式。18-OHF 及內(nèi)標(biāo)離子對(duì)分別為379.2/267.2 和383.3/271.2。

方法驗(yàn)證結(jié)果：參照《化學(xué)藥物臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》對(duì)自建LC-MS/MS 方法進(jìn)行基本分析性能驗(yàn)證。18-OHF 檢測(cè)方法在17.13～8 772.00 nmol/L 范圍內(nèi)峰面積與質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好（r2=0.9995），定量限為4.285 nmol/L；批內(nèi)精密度1.5%～1.7%，批間精密度1.3%～2.2%，加標(biāo)回收率在97.8%～109.2%。方法選擇性良好，空白基質(zhì)在待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間處沒(méi)有干擾，不存在基質(zhì)效應(yīng)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用R 語(yǔ)言進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)（P25，P75）表示，兩組間比較采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或百分率（%）表示，組間比較采用 χ2檢驗(yàn)。單因素Logistic 回歸分析探索疾病診斷的預(yù)測(cè)因素。診斷試驗(yàn)的評(píng)價(jià)采用ROC 曲線分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 73 例患者的一般臨床資料（表1）

表1 73 例原發(fā)性醛固酮增多癥患者的一般臨床資料（）

表1 73 例原發(fā)性醛固酮增多癥患者的一般臨床資料（）

注：IAH：特發(fā)性醛固酮增多癥；APA：腎上腺醛固酮腺瘤；AST：天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；ALT：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；；18-OHF：18-羥皮質(zhì)醇。*: 用中位數(shù)（P25，P75）表示。1 mmHg=0.133 kPa

73 例（100%）患者行卡托普利試驗(yàn)，59 例（80.8%）患者行生理鹽水輸注試驗(yàn)。在女性患者中，14 例確診為IAH，16 例確診為APA。在男性原醛癥患者中，11 例確診為IAH，32 例確診為APA。在女性、男性中IAH 患者與APA 患者年齡、體重指數(shù)（BMI）、血壓、肝功能、腎功能等指標(biāo)的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

2.2 全部患者及不同性別患者的24 h 尿18-OHF 含量分析

在全部患者中，APA 患者中24 h 尿18-OHF含量有高于IAH 患者的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[385（242，582）nmol/d vs.225（150，288）nmol/d，P＞0.05]。女性APA患者24h尿18-OHF含量高于IAH患者[450（260，779）nmol/d vs.220（123，276）nmol/d，P＜0.05]，但男性患者中，APA 患者與IAH 患者24 h 尿18-OHF 含量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[376（242，537）nmol/d vs.251（168，384）nmol/d，P＞0.05]。

2.3 24 h 尿18-OHF 含量與APA 的相關(guān)性分析（表2）

單因素Logistic 回歸分析顯示，在全部患者中，24 h 尿18-OHF 含量＞293 nmol/d 是診斷APA 的預(yù)測(cè)因素（P＜0.01）。在女性患者中，24 h 尿18-OHF含量＞ 298 nmol/d是診斷APA的預(yù)測(cè)因素（P=0.01），在男性患者中，24 h 尿18-OHF 含量＞ 205 nmol/d是診斷APA 的預(yù)測(cè)因素（P=0.03）。

2.4 ROC 曲線分析24 h 尿18-OHF 含量對(duì)女性患者APA 的診斷價(jià)值（圖1）

圖1 ROC 曲線分析全部患者及不同性別患者中24 h 尿18-OHF 含量對(duì)APA 的診斷價(jià)值

在全部患者中，當(dāng)取24 h 尿18-OHF 含量＞ 293 nmol/d 為診斷APA 臨界值時(shí)，ROC 曲線分析的AUC為0.71（95%CI: 0.58～0.84，P＜0.01），靈敏度和特異度分別為66.7%和76.0%，約登指數(shù)有最大值，為0.43。在女性患者中，以24 h 尿18-OHF 含量＞ 298 nmol/d為診斷APA 的臨界值，則ROC 曲線分析的AUC 為0.74（95%CI: 0.55～0.93，P＜0.05），靈敏度和特異度分別為68.8%和85.7%，約登指數(shù)有最大值，為0.55。在男性患者中，以24 h 尿18-OHF 含量＞ 205 nmol/d 為診斷APA 的臨界值，則ROC 曲線分析的AUC 為0.67（95%CI: 0.48～0.87，P＞0.05），靈敏度和特異度分別為87.5%和45.5%，約登指數(shù)有最大值，為0.33。

3 討論

本研究結(jié)果提示：女性APA 患者24 h 尿18-OHF 含量高于IAH 患者。男性APA 患者與IAH 患者24 h 尿18-OHF 含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)24 h尿18-OHF 含量預(yù)測(cè)女性APA 診斷的特異度較高。

APA 相對(duì)于IAH 發(fā)病機(jī)制更為復(fù)雜，臨床表現(xiàn)更為嚴(yán)重[11-12]，及時(shí)明確診斷并盡快給予患者手術(shù)治療意義重大。目前，APA 的診斷金標(biāo)準(zhǔn)為AVS，然而我國(guó)能常規(guī)開(kāi)展該檢查的醫(yī)院匱乏且均集中于大型醫(yī)療中心，可及性差，此外該方法為有創(chuàng)操作、且費(fèi)用相對(duì)昂貴，患者接受度低。因此，能否通過(guò)檢驗(yàn)學(xué)指標(biāo)對(duì)APA 進(jìn)行簡(jiǎn)單、快捷、有效的診斷一直是臨床上亟待解決的問(wèn)題。

早在上世紀(jì)八十年初，Chu 等[13]就從原醛癥患者尿液中首次檢測(cè)出18-OHF。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)僅在以APA 為代表的部分原醛癥亞型中合成增多[11,14]。上世紀(jì)九十年代初，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)APA 患者尿中18-OHF 含量明顯高于IAH 患者[15]。隨后，意大利學(xué)者在81 例原醛癥患者中分別測(cè)量了血清和24 h 尿液中三種類固醇的濃度和含量得出了APA 患者24 h 尿和血18-OHF 含量均明顯高于IAH 患者、且24 h 尿18-OHF 含量對(duì)于APA 診斷價(jià)值更高的結(jié)論[7]。Satoh 等[16]分析了 234 例經(jīng) AVS 分型診斷明確的 PA 患者外周血類固醇水平，血清18-OHF濃度在 APA 患者中明顯升高，ROC 曲線分析顯示18-OHF 濃度能夠有效地識(shí)別出APA（靈敏度62%，特異度96%）。隨后Eisenhofer 等[17]在外周和腎上腺靜脈血中測(cè)量了15 種類固醇，并發(fā)現(xiàn)以18-OHF為代表的類固醇可以對(duì)APA 和IAH 進(jìn)行有效的鑒別診斷。綜上，各項(xiàng)研究均得出了血清18-OHF 對(duì)APA 具有診斷價(jià)值的一致結(jié)論。鑒于此，探討通過(guò)測(cè)量18-OHF 對(duì)APA 進(jìn)行診斷成為了近年來(lái)原醛癥研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。

選擇合適的樣本來(lái)開(kāi)展18-OHF 檢測(cè)也是需要考慮的問(wèn)題。腎上腺靜脈血需要行AVS，與尋找簡(jiǎn)便有效診斷指標(biāo)的初衷相悖。而既往研究表明，外周血18-OHF 濃度具有類似于皮質(zhì)醇的晝夜變化[18]。此外，體位變化也導(dǎo)致外周血18-OHF 濃度在短時(shí)間內(nèi)大幅波動(dòng)[10]。考慮到外周血18-OHF 濃度僅能體現(xiàn)采血即刻水平，因此其對(duì)于APA 診斷價(jià)值存疑。而24 h 尿18-OHF 含量這一指標(biāo)通過(guò)收集全天尿液排泄的18-OHF，避免了外周血18-OHF 濃度短時(shí)間內(nèi)大幅波動(dòng)的缺點(diǎn)，是較為優(yōu)秀的檢測(cè)載體。

18-OHF 在APA 患者中合成增多相關(guān)于KCNJ5基因突變[19-20]。KCNJ5基因突變導(dǎo)致11-脫氧皮質(zhì)醇的利用率增加，最終導(dǎo)致18-OHF 合成增多[21-22]。既往多項(xiàng)研究結(jié)果均顯示，女性患者KCNJ5基因突變的比例高于男性患者[23]，而這種情況在東亞人群中更為顯著[24-26]。通常情況下合并KCNJ5的女性APA 患者通常情況下更年輕，腎上腺腫瘤更大，原醛癥的癥狀也更為典型[27]。因此18-OHF 對(duì)于不同性別的APA 患者可能存在診斷價(jià)值的差異。遺憾的是，大多數(shù)既往研究未評(píng)估18-OHF 對(duì)于不同性別APA 患者的診斷價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)，女性APA 患者 24 h 尿18-OHF 含量高于女性IAH 患者，男性患者之間的差異未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但無(wú)論在女性或男性原醛癥患者中，Logistic 回歸分析均提示高24 h尿18-OHF 含量與APA 診斷相關(guān)。

本研究在中國(guó)原醛癥患者中開(kāi)展24 h 尿18-OHF檢測(cè)，力圖為無(wú)創(chuàng)、便捷、高效的APA 診斷方案提供線索并評(píng)價(jià)了24 h 尿18-OHF 含量對(duì)于不同性別患者APA 的診斷價(jià)值。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，24 h 尿18-OHF 對(duì)于女性APA 具有一定診斷價(jià)值，診斷特異度高，為臨床APA 的診斷優(yōu)化提供了新的思路。但本文也存在局限性：樣本量較小、且該指標(biāo)未在另一個(gè)患者群中進(jìn)行驗(yàn)證。未來(lái)可以繼續(xù)探索以24 h尿18-OHF 含量為基礎(chǔ)的APA 診斷模式，進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行多中心研究，努力提高該指標(biāo)對(duì)于APA 診斷的準(zhǔn)確性和便利性。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突