兩種佐劑對細鱗鮭殺鮭氣單胞菌滅活疫苗免疫效果的影響

文/何亞鵬

為了探究添加弗氏佐劑和蜂膠佐劑后殺鮭氣單胞菌滅活疫苗的免疫效果，分別制備含兩種不同佐劑的殺鮭氣單胞菌滅活疫苗，免疫細鱗鮭，并設(shè)不加佐劑組和對照組，分別于免疫后不同時間采血，檢測血清抗體效價，評價相關(guān)免疫指標和免疫保護率，以期為鮭鱒魚疥瘡病的防控和珍稀水生物種保護提供技術(shù)參考。

殺鮭氣單胞菌屬于氣單胞菌屬的革蘭氏陰性短桿菌，其在淡水與海水環(huán)境中廣泛存在，該菌主要引起16種鮭鱒魚類如大馬哈魚、細鱗鮭、大西洋鮭、虹鱒和河鱒等癤瘡病及潰瘍病，導致幼魚死亡率高，其宿主范圍也在不斷擴大，有引起鯉科魚類潰瘍病和紅皮炎的報道。如果任其流行，不僅會進一步威脅珍稀鮭鱒魚物種的生存，影響救護和繁育工作，還有可能危害我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

為此，本文探究了添加弗氏佐劑和蜂膠佐劑后殺鮭氣單胞菌滅活疫苗的免疫效果，并總結(jié)成文。

一、材料與方法

（一）實驗魚

為本中心馴養(yǎng)車間內(nèi)養(yǎng)殖的同一批次均一細鱗鮭，體長平均為13cm，體重平均14g，魚外觀及活動均正常，按習性在14℃左右水溫正常養(yǎng)殖。

（二）菌種來源

殺鮭氣單胞菌由北京市水生野生動植物救護中心分離鑒定并保存。

（三）滅活疫苗的制備

殺鮭氣單胞菌由-80℃冰箱取出，接種于TSB肉湯培養(yǎng)基活化培養(yǎng)兩代，檢查染色特征及菌體形態(tài)，顯示正常后在TSB肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h，加入終濃度為0.3%的甲醛，混勻，恒溫培養(yǎng)箱37℃放置48h滅活細菌。離心取沉淀的菌體，用無菌生理鹽水反復洗滌菌體3次，去除殘留的培養(yǎng)基和甲醛，最后懸浮于無菌生理鹽水中，接種培養(yǎng)基培養(yǎng)檢測，確認無活菌后，即制得殺鮭氣單胞菌全菌滅活疫苗。采用麥氏比濁法調(diào)整菌濃度為2.0×10CFU/mL，分別加入弗氏佐劑和蜂膠佐劑，混勻，完畢后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

（四）免疫注射和樣品采集

取弗氏佐劑滅活疫苗、蜂膠佐劑滅活疫苗、不加佐劑滅活疫苗和生理鹽水（對照組），分別采用腹腔注射方式免疫細鱗鮭，每尾0.1mL，分別于第1d和注射后第7d、14d、21d、28d、和35d采血。每組隨機取10尾采血，收集血清。

（五）抗體效價等免疫指標測定

抗體效價測定：采用傳統(tǒng)的試管凝集法檢測血清抗體水平，觀察細菌的凝集程度，取每組平均值作為結(jié)果。

溶菌酶（Lysozyme，LZM）是血清中決定吞噬細胞能否殺滅所吞噬的致病菌一種水解酶，酸性磷酸酶（Acid phosphatase，ACP）和巨噬細胞溶酶體活力相關(guān)，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）作為抗氧化酶可清除體內(nèi)自由基，SOD活力的變化能夠表明機體對外來物質(zhì)的清除力，它們和動物機體的免疫力密切相關(guān)，檢測其變化有利于了解免疫后機體抗病力的變化水平。本試驗選用檢測試劑盒，按照操作測定計算各組血清樣品平均的溶菌酶、酸性磷酸酶和超氧化物歧化酶活力。

（六）免疫保護率測定和臨床應(yīng)用

將四組生長狀況一致的魚苗分別注射兩種滅活疫苗、不加佐劑滅活疫苗和生理鹽水，28d后，各組魚隨機取30尾攻毒，腹腔注射0.1mL殺鮭氣單胞菌活菌液（1.0×10CFU/mL），觀察死亡情況，計算免疫保護率。免疫保護率=［1-（免疫組死亡率/對照組死亡率）］×100%。

將制備的疫苗在中心養(yǎng)殖車間（試驗點1）和玉渡山養(yǎng)殖基地（試驗點2）進行應(yīng)用，各試驗點分為弗氏佐劑免疫組、蜂膠佐劑免疫組和對照組，每尾0.1mL，注射后均正常養(yǎng)殖，2個月后統(tǒng)計各組存活率。

二、結(jié)果

（一）抗體效價等免疫指標檢測結(jié)果

采用傳統(tǒng)的試管凝集法，測得試驗組的平均抗體效價呈上升趨勢，弗氏佐劑組和蜂膠佐劑組均在第1d～28d快速上升，第28d達到峰值，分別為1:460.8、1:508.5，隨后緩慢下降；不加佐劑組在第21d達到峰值1:281.6，隨后緩慢下降；對照組無明顯變化（見表1）。

表1 各組魚血清凝集抗體效價的檢測結(jié)果

血清中免疫相關(guān)的三種酶活力檢測結(jié)果見表2，兩種滅活疫苗免疫后，免疫組血清溶菌酶、酸性磷酸酶活力和超氧化物歧化酶活力于免疫后明顯上升，高于不加佐劑組，蜂膠佐劑組優(yōu)于弗氏佐劑組，隨后活力逐漸下降，但一直保持在高于對照組的水平，對照組各時間點的指標變化不顯著。

表2 各組魚LZM、ACP和SOD活力檢測結(jié)果

（二）免疫保護率測定

攻毒試驗記錄的四組死亡數(shù)如圖1。攻毒10d后，弗氏佐劑組、蜂膠佐劑組、不加佐劑組的死亡率分別為13.3%、10%、20%，明顯低于對照組的76.7%，蜂膠佐劑組最低；弗氏佐劑組、蜂膠佐劑、不加佐劑組的相對免疫保護率分別為82.7%、87.0%、73.9%（見表3）。

表3 活菌攻毒后各組的死亡率和免疫保護力

圖1 活菌攻毒后各組的累計死亡數(shù)

（三）臨床應(yīng)用效果

將制備的疫苗于試驗點的細鱗鮭魚苗中應(yīng)用，分弗氏佐劑免疫、蜂膠佐劑免疫組和對照組，免疫后均正常養(yǎng)殖，2個月后統(tǒng)計各組存活數(shù)，結(jié)果顯示與對照組相比，在試驗點1應(yīng)用疫苗后可提高存活率10%以上，試驗點2可提高存活率16%以上，可以減少該病造成的損失（見表4）。

表4 臨床應(yīng)用結(jié)果

三、討論

殺鮭氣單胞菌廣泛存在于水體環(huán)境中，該病原引起的疥瘡病和潰瘍病每年都會造成相關(guān)水生生物損失嚴重，對冷水魚養(yǎng)殖行業(yè)和珍稀水生動物保護有較大的威脅。

魚類疫苗發(fā)展較畜禽疫苗晚，在生產(chǎn)中應(yīng)用較多的仍是滅活疫苗。本研究以殺鮭氣單胞菌為研究對象，制備不同佐劑的殺鮭氣單胞菌全菌滅活疫苗，弗氏佐劑組、蜂膠佐劑組和不加佐劑組血清平均抗體效價于免疫后呈上升趨勢，蜂膠佐劑組的抗體效價更高。隨后進行免疫保護實驗，結(jié)果表明弗氏佐劑全菌滅活疫苗保護效果可達到82.7%，蜂膠佐劑全菌滅活疫苗保護效果可達到87.0%，加入佐劑后的疫苗產(chǎn)生更強更持久的免疫力，蜂膠佐劑全菌滅活疫苗更優(yōu)。將制備的疫苗于試驗點的細鱗鮭魚苗中應(yīng)用，均可以提高其存活率，降低損失，蜂膠佐劑效果更好。本實驗比較了兩種佐劑的免疫效果，有助于相關(guān)疫苗的進一步研發(fā)和應(yīng)用。