注射恩諾沙星對(duì)中華鱉組織的病理?yè)p傷研究

文/張永剛 丁慧平 王政 李兆新 邢麗紅 吳薇 劉瑩

本文研究了肌肉注射不同劑量恩諾沙星，對(duì)中華鱉肝臟、脾臟、心臟、腎臟、腸道、肌肉、睪丸和精巢的影響。結(jié)果顯示，2.5mg/kg劑量對(duì)各組織器官無(wú)明顯影響，7.5mg/kg劑量組細(xì)胞結(jié)構(gòu)開(kāi)始出現(xiàn)損傷變化，12.5mg/kg劑量組肝細(xì)胞液泡化，脾臟與腎臟組織結(jié)構(gòu)松散，精巢和睪丸生精細(xì)胞凋亡，腸細(xì)胞溶解，心臟淤血，肌纖維間扭曲。由結(jié)果可知，肌肉注射高劑量恩諾沙星可嚴(yán)重影響中華鱉機(jī)體內(nèi)環(huán)境，對(duì)機(jī)體組織造成嚴(yán)重?fù)p傷，在疾病防控時(shí)需嚴(yán)格遵照推薦劑量給藥。

中華鱉（）又名水魚(yú)、團(tuán)魚(yú)，是一種名貴且經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的淡水養(yǎng)殖動(dòng)物，因其具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值等諸多優(yōu)點(diǎn)，被廣泛養(yǎng)殖于亞洲多個(gè)國(guó)家。《2021中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》顯示，2020年我國(guó)鱉的養(yǎng)殖總產(chǎn)量達(dá)到33.3萬(wàn)t，比上一年增長(zhǎng)了2.25%。近年來(lái)，中華鱉養(yǎng)殖迅猛發(fā)展，隨著養(yǎng)殖密度增加，養(yǎng)殖水環(huán)境惡化，細(xì)菌大量繁殖，各種疾病問(wèn)題也接踵而至。中華鱉疾病相關(guān)研究顯示，養(yǎng)殖過(guò)程中最常發(fā)的是細(xì)菌性疾病。病原學(xué)研究表明，其重要致病原達(dá)17余種，如鼠傷寒沙門(mén)氏菌（）、遲緩愛(ài)德華氏菌（）、嗜水氣單胞菌（）、豚鼠氣單胞菌（）等，影響中華鱉養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）屬于第三代喹諾酮類藥物，因其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性、陰性菌具有良好的抑菌殺菌效果，且毒副作用小，與其他抗生素?zé)o交叉耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，在陸生、水生及爬行動(dòng)物的疾病防控過(guò)程中被廣泛應(yīng)用。但在養(yǎng)殖過(guò)程中過(guò)度使用藥物、濫用藥物及殘留藥物的無(wú)效處理，會(huì)對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境安全構(gòu)成潛在威脅。已有研究表明，ENR在一定劑量下具有較強(qiáng)的生殖毒性、細(xì)胞毒性和免疫活性抑制作用，甚至可影響微生物、藻類的生理功能。目前，關(guān)于ENR在虹鱒（）、金頭鯛（）、大西洋鮭魚(yú)（）、海鱸（）等水產(chǎn)動(dòng)物上的藥物代謝動(dòng)力學(xué)或毒性的研究已有較多報(bào)道，但關(guān)于ENR對(duì)中華鱉（兩棲動(dòng)物）的毒性研究鮮有報(bào)道。

抗生素類藥物在臨床使用中通常采用注射、口服、藥浴或拌餌等給藥方式。給藥方式會(huì)影響藥物的吸收速率和生物利用度。一般而言，藥物吸收速率從高到低分別是靜脈注射、肌肉注射、皮下組織注射和口服，吸收速率最低的給藥方式為藥浴。為了保證藥物更好地進(jìn)入機(jī)體，減少誤差，本試驗(yàn)在水溫（26.0±1.0）℃條件下，研究了肌肉注射不同劑量的ENR對(duì)中華鱉肝臟、脾臟等8個(gè)不同組織器官損傷的病理變化，以期了解不同劑量ENR對(duì)機(jī)體的毒性，為中華鱉科學(xué)用藥和疾病防治提供理論基礎(chǔ)。

一、材料與方法

（一）試驗(yàn)動(dòng)物

選取山東省某基地培育的優(yōu)質(zhì)中華鱉，體質(zhì)健壯，行動(dòng)活潑，無(wú)傷殘，無(wú)畸形，每只規(guī)格為（500±50）g。試驗(yàn)前需檢測(cè)確保其體內(nèi)無(wú)ENR藥物殘留，給藥前停飼24h。

（二）試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以2.5mg/kg為基準(zhǔn)，同時(shí)設(shè)置3倍劑量（7.5mg/kg）和5倍劑量（12.5mg/kg）試驗(yàn)組及1個(gè)對(duì)照組，每組均設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行10只中華鱉。試驗(yàn)組采用肌肉注射給藥方式，用注射器在大腿外側(cè)肌肉注射藥液0.5mL，對(duì)照組肌肉注射同等體積的無(wú)菌生理鹽水。試驗(yàn)共進(jìn)行3d，肌肉注射1次/d，試驗(yàn)期間水溫保持（26.0±1.0）℃。

（三）樣品采集與組織切片處理

參照青島市漁業(yè)技術(shù)推廣站劉瑩等的方法，在停藥24h后采樣，從每個(gè)試驗(yàn)組及對(duì)照組隨機(jī)取3只中華鱉于冰盤(pán)上解剖，分離出肝臟、脾臟、心臟、腎臟、肌肉、睪丸和精巢等組織，固定于Davidson’s固定液中，24h后將固定液更換為70%乙醇溶液。然后經(jīng)無(wú)水乙醇梯度脫水（70%、85%、95%）、二甲苯透明（3次）、浸蠟（63℃）、包埋、切片（5μm）、展片、烤片，最后參照Bancroft的方法，將切片用蘇木精-伊紅（H.E.）染色后，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)分析。

二、試驗(yàn)結(jié)果

（一）腸組織結(jié)構(gòu)觀察

對(duì)照組與1倍劑量組（圖1A、1B）腸絨毛結(jié)構(gòu)清晰，黏膜下層和肌層完整無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)病理特征；隨著注射劑量的增加，3倍劑量組（圖1C）腸絨毛結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，部分絨毛破碎，杯狀細(xì)胞H.E.染色加深，有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；5倍劑量組（圖1D）腸組織結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞溶解，腸絨毛廣泛受損，大多數(shù)腸上皮細(xì)胞已脫離，游離于腸腔。

圖1 恩諾沙星對(duì)中華鱉腸組織的影響

（二）肝組織結(jié)構(gòu)觀察

對(duì)照組（圖2A）肝小葉輪廓清晰，肝細(xì)胞核大而圓，未見(jiàn)病理特征；而1倍劑量組（圖2B）小間葉動(dòng)脈管壁增厚，中央靜脈中有部分細(xì)胞脫落；隨著注射劑量的增加，3倍劑量組（圖2C）肝細(xì)胞液泡化，細(xì)胞質(zhì)松弛，肝門(mén)血管內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝竇輕微擴(kuò)張；而5倍劑量組（圖2D）肝板結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，細(xì)胞排列紊亂，大量紅細(xì)胞積聚。

圖2 恩諾沙星對(duì)中華鱉肝組織的影響

（三）脾組織結(jié)構(gòu)觀察

對(duì)照組與1倍劑量組（圖3A、3B）脾組織紅髓和白髓分區(qū)明顯，細(xì)胞排列緊密，未見(jiàn)病理特征。與對(duì)照組相比，3倍與5倍劑量組（圖3C、3D）脾組織結(jié)構(gòu)松散，受損嚴(yán)重，中央動(dòng)脈擴(kuò)張、充血、大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，小梁出血，動(dòng)脈周圍淋巴鞘腫脹。

圖3 恩諾沙星對(duì)中華鱉脾組織的影響

（四）腎組織結(jié)構(gòu)觀察

對(duì)照組與1倍劑量組（圖4A、4B）腎臟遠(yuǎn)端小管與近端小管結(jié)構(gòu)明顯，各細(xì)胞間界限清晰，細(xì)胞核完整，未見(jiàn)組織病變；隨著注射劑量的增加，3倍劑量組（圖4C）細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散，腎小管管腔內(nèi)有血鐵紅素沉積；5倍劑量組（圖4D）細(xì)胞界限不清，近曲小管管腔變小，有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖4 恩諾沙星對(duì)中華鱉腎組織的影響

（五）心組織結(jié)構(gòu)觀察

對(duì)照組與1倍劑量組（圖5A、5B）心肌纖維縱橫交叉，排列有序，未有病理變化；隨著注射劑量的增加，3倍劑量組（圖5C）肌纖維束出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，并伴有紅細(xì)胞浸潤(rùn)；而5倍劑量組（圖5D）心臟內(nèi)大面積淤血，肌纖維束排列紊亂。

圖5 恩諾沙星對(duì)中華鱉心組織的影響

（六）睪丸組織結(jié)構(gòu)觀察

對(duì)照組與1倍劑量組（圖6A、6B）睪丸切片未見(jiàn)組織結(jié)構(gòu)改變，由曲細(xì)精管和間質(zhì)結(jié)締組織組成生，曲細(xì)精管排列規(guī)則，其內(nèi)充斥著不同分化階段的生精細(xì)胞（精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞）；隨著注射劑量的增加，3倍劑量組（圖6C）曲細(xì)精管輕度扭曲，生殖細(xì)胞輕微脫落（萎縮），精子細(xì)胞開(kāi)始減少；而5倍劑量（圖6D）組血管充血明顯，睪丸實(shí)質(zhì)內(nèi)精子細(xì)胞大量減少，精子發(fā)生明顯改變，出現(xiàn)空腔現(xiàn)象。

圖6 恩諾沙星對(duì)中華鱉睪丸組織的影響

（七）精巢組織結(jié)構(gòu)觀察

對(duì)照組與1倍劑量組（圖7A、7B）無(wú)明顯組織形態(tài)學(xué)差異，生精小管結(jié)構(gòu)完整，小管內(nèi)充斥著大量活躍的精子；隨著注射劑量的增加，3倍與5倍劑量組（圖7C、7D）間質(zhì)疏松結(jié)締組織充血，生精小管內(nèi)生殖細(xì)胞嚴(yán)重萎縮、減少，出現(xiàn)空腔現(xiàn)象。

圖7 恩諾沙星對(duì)中華鱉精巢組織的影響

（八）肌肉組織結(jié)構(gòu)觀察

對(duì)照組、1倍和3倍劑量組（圖8A、8B、8C）肌肉縱切面形態(tài)正常，肌纖維平行排列，沒(méi)有扭曲和斷開(kāi)現(xiàn)象；與對(duì)照組相比，5倍劑量組（圖8D）骨骼肌出現(xiàn)輕微的形態(tài)學(xué)變化，肌纖維間扭曲、斷開(kāi)，縱向間隙變大。

圖8 恩諾沙星對(duì)中華鱉肌肉組織的影響

三、討論

組織病理學(xué)可以直接準(zhǔn)確地反映組織和細(xì)胞的病理變化，為疾病診斷和臨床治療提供可靠的依據(jù)。本試驗(yàn)以肌肉注射的給藥方式，探究了注射不同劑量ENR（1倍、3倍、5倍試驗(yàn)基準(zhǔn)劑量）對(duì)中華鱉組織器官損傷的情況。

組織病理學(xué)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，中華鱉肌肉注射中、高劑量（7.5mg/kg和12.5mg/kg）的ENR，可對(duì)機(jī)體的肝臟、脾臟、腎臟造成不同程度的損傷，其中高劑量組最為嚴(yán)重。主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞液泡化、大面積凋亡或壞死，脾臟與腎臟組織結(jié)構(gòu)松散、大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，ENR可誘導(dǎo)草魚(yú)的肝細(xì)胞凋亡，并具有顯著的劑量依賴性。章宇思等研究表明，連續(xù)肌注恩諾沙星對(duì)中華草龜具有明顯的肝毒性，同時(shí)出現(xiàn)腎臟、肌肉壞死，且劑量效應(yīng)顯著。本試驗(yàn)與上述研究結(jié)果相一致，但肌肉損傷情況較輕。

卵巢、精巢是動(dòng)物的性器官，化學(xué)藥物能在其中積累，可改變其組織結(jié)構(gòu)，進(jìn)而對(duì)其造成遺傳毒性。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高劑量肌肉注射ENR對(duì)中華鱉的精巢和睪丸組織學(xué)有負(fù)面影響，ENR對(duì)中華鱉產(chǎn)生了生殖毒性。

四、結(jié)論

綜上所述，在正常注射劑量下，ENR對(duì)中華鱉各組織器官無(wú)顯著影響，但在中、高注射劑量下，ENR對(duì)中華鱉腸道、肝臟、脾臟、心臟、腎臟、肌肉、睪丸和精巢均可產(chǎn)生較強(qiáng)的毒性作用，其中以消化、排泄、造血及生殖器官最為嚴(yán)重。與已報(bào)道的研究相比，肌肉注射較口服造成的組織損傷輕。因此，在實(shí)際養(yǎng)殖過(guò)程中，預(yù)防和治療水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌性疾病時(shí)，需要根據(jù)動(dòng)物機(jī)體的實(shí)際情況選擇合適的給藥方式，以及合理的給藥劑量，以免過(guò)度使用藥物對(duì)動(dòng)物機(jī)體造成損傷。