隔藥餅灸對高脂血癥兔IGF-1/Sp1 蛋白及基因表達的影響

李 芊，歐陽里知，劉惠娟，彭 涵，劉紅華，葛君蕓，常小榮，劉邁蘭*

（1.湖南中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學護理學院，湖南 長沙 410208）

高脂血癥（hyperlipidemia, HLP）是因機體脂質(zhì)轉(zhuǎn)運或代謝異常而引起的血液中甘油三酯（riglyceride,TG）水平和（或）總膽固醇（total cholesterol, TC）水平、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C）過高，和（或）高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol, HDL-C）水平過低的一種病癥，是動脈粥樣硬化等心血管事件的重要危險因素。隔藥餅灸是通過艾灸與中藥的結(jié)合，共同刺激腧穴治療疾病的針灸特色療法。 臨床試驗與基礎實驗研究表明，隔藥餅灸能降低LDL-C、升高HDL-C 和升高高密度脂蛋白與膽固醇的比值，肯定了隔藥餅灸的降脂調(diào)脂效果[1-2]。 膽固醇逆轉(zhuǎn)運（reverse cholesterol transport，RCT）是參與調(diào)節(jié)HLP的重要的機制之一[3]，而胰島素樣生長因子1（insulinlike growth factor 1, IGF-1）、特異性蛋白1（specificity protein 1, Sp1）在RCT 過程中起著重要的調(diào)控作用[4-5]。IGF-1 是防止LDL-C 水平升高的一個保護因素，保持一定的IGF-1 水平可以調(diào)節(jié)血液LDL-C 濃度[6]。下調(diào)IGF-1 的mRNA 表達，可介導RCT，對HLP 起到治療作用[4]。Sp1 通過增強肝細胞代謝體內(nèi)膽固醇的能力，促進RCT 過程，調(diào)節(jié)血液中LDL-C 與HDL-C的水平[5]。本次研究以HLP 兔為研究對象，運用隔藥餅灸干預治療，探討隔藥餅灸的血脂調(diào)節(jié)機制是否通過IGF-1/Sp1 通路，調(diào)節(jié)RCT 和HLP 進程。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

雄性新西蘭兔36 只，體質(zhì)量1.5～2.5 kg，購自湖南太平生物有限公司[普通級，許可證號：SCXK(湘)2020-0005]，單籠兔圈養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心，飲水不限，喂食定量。 飼養(yǎng)環(huán)境以明暗燈光模擬晝夜交替過程，濕度50%～70%，溫度20～25 ℃。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 主要儀器 臺式高速冷凍離心機（型號：75007685，美國賽默飛世爾科技公司）；全自動生化分析儀（型號：Chemray 120，深圳雷杜生命科學股份有限公司）；高速低溫離心機（型號：D3024R，SCILOGBX公司）；GloMax 酶標儀（型號：GM3030，Promega 公司）；振蕩儀（型號：10RTEX-5，海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；超微量分光光度計（型號：NanoVue Plus, NannoVue 公司）；基因擴增儀（型號：ETC811，蘇州東勝興業(yè)科學儀器有限公司）。

1.2.2 主要試劑 TG 檢測試劑盒（批號：20200507）、LDL-C 檢測試劑盒（批號：20200619）、TC 檢 測 試 劑盒（批號：20200526）均來自深圳雷杜生命科學股份有限公司；蛋白酶抑制劑（批號：04693132001，Roche）；磷酸酶抑制劑（批號：04906837001，Roche公司）；RNA 提取試劑盒（批號：RN03，艾德萊生物技術有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：FSQ-101，TOYOBO）；IGF-1 ELISA 試劑盒 （批號：JL17113，上海江萊生物科技有限公司）；Sp1 ELISA 試劑盒（批號：SY-00967，上海雙贏生物科技有限公司）。

1.3 HLP 模型制備與評定

采用外源性高膽固醇、高脂飲食誘導法[7]制備HLP 模型，高膽固醇和高脂飲食飼料配方為84%基礎飼料（實驗兔專用）、10%蛋黃粉、5%豬油、1%膽固醇。 造模期間每只實驗兔單籠飼養(yǎng)，飲水不限，飼料喂養(yǎng)120～150 g/只，連續(xù)8 周（56 d）。

HLP 模型制備：適應性喂養(yǎng)1 周后，各組實驗兔行耳中動脈采血，檢測造模前各組血脂水平（血清TC、TG、LDL-C），記錄正常血脂水平并評估各組間的造模前基線。 自第2 周起，各模型制備組以高膽固醇、高脂飼料喂養(yǎng)，正常組以普通實驗兔專用基礎飼料喂養(yǎng)，在造模8 周后行耳中動脈采血，造模后測各組血脂水平，對比造模前與造模8 周后組間血脂水平及各組造模8 周血脂變化。

模型評定：新西蘭兔正常血清TC含量為1～2 mmol/L，當造模各組血清TC 值高于此值（或正常組TC值）3倍以上，血清TG 和LDL-C 含量與正常組相較升高（P＜0.05），則判定HLP 模型成立[7]。

1.4 干預方法

所有實驗兔在適應性喂養(yǎng)1 周后，分為正常組、模型組、隔藥餅灸組，每組12 只。 除正常組喂食基礎飼料外，其余2 組每天喂食高膽固醇、高脂飼料，持續(xù)8 周，制備HLP 兔模型。造模成功后，各組均喂食普通飼料。 每天上午7:00，正常組和模型組予以單純捆綁操作；隔藥餅灸組在捆綁固定于兔臺后予以隔藥餅灸操作，干預30 min。 各組干預持續(xù)8 周，各實驗兔每天總食量120～150 g/只。 分別在造模前（適應性喂養(yǎng)1 周后）、造模8 周后經(jīng)兔耳中動脈采血，干預8 周后腹主動脈采血，4 ℃靜置2 h 后以3000 r/min，半徑168 mm，離心10 min，取上清，檢測血脂水平。

隔藥餅灸操作：模型制備成功后，實驗兔腧穴部位剃毛處理，固定于兔臺，取穴定位，局部聚維酮碘消毒，涂抹凡士林，在穴位敷上新制作的藥餅，醫(yī)用鑷子夾持中等強度艾炷點燃，放置于藥餅上方施灸，每穴需連灸4 壯，每壯需徹底燃燒后再更換，兩組穴位交替施灸，每天1 組穴位，連灸8 周，每灸6 d 休息1 d。 施灸穴位分為腹背2 組：腹組取“巨闕”和雙側(cè)“天樞”“豐隆”；背組取雙側(cè)“脾俞”“肝俞”“心俞”。取穴方法參考余曙光、徐斌主編的《實驗針灸學》[8]及擬人比照法制定。 藥餅制作方法：選取大黃、澤瀉、郁金、山楂、丹參，按1∶1 打磨機粉碎為末；在每次施灸之前，將粉末以醋調(diào)成糊狀，捏壓成直徑1 cm 左右、厚約5 mm 的藥餅。

1.5 指標采集與檢測

1.5.1 指標采集 20%烏拉坦耳緣靜脈注射4 mL/kg麻醉實驗兔，腹主動脈取血5 mL，3000 r/min 離心15 min，取上清。 剪取主動脈一段，取3 mm×3 mm×5 mm 肝組織分別在無菌培養(yǎng)皿內(nèi)PBS 沖洗血液后，放入凍存管。 上述標本均于-80 ℃冰箱保存待測。

1.5.2 血脂檢測 使用全自動生化儀Rayto-Chemray120 測實驗兔血清中TC、TG 和LDL-C 的含量。

1.5.3 ELISA 法檢測血清中IGF-1、Sp1 的含量 （1）取出血清樣品，置于冰上融化，待融化完畢后，震蕩搖勻。 （2）將IGF-1、Sp1 標準品于10 000 r/min 下離心1 min，然后加入標準品1 mL 稀釋液于標準管中，旋緊管蓋，靜置10 min，上下顛倒數(shù)次，使其充分溶解混勻后，配制成不同濃度的標準品。 然后根據(jù)需要進行2 倍比稀釋，配制出不同濃度的標準品。 （3）取不同濃度標準品50 μL 加入標準孔，另加入其他孔50 μL 待測樣品。 用封板膜封后放置于37 ℃烘箱中培育90 min。 棄液，甩干，于每孔中加入100 μL 生物素化抗體工作液，混勻，再以封板膜封后置于37 ℃烘箱中培育60 min。 甩盡孔內(nèi)液體，于每孔加350 μL洗滌液，浸泡1～2 min，甩掉酶標板內(nèi)的液體，重復洗板步驟5 次。 每孔加100 μL 酶結(jié)合物工作液，加上覆膜，用封板膜封后置于37 ℃烘箱中培育30 min。棄液，甩干，洗板5 次。 每孔加底物溶液三甲基苯90 μL，用封板膜封后置于37 ℃烘箱中培育15 min。每孔加50 μL 終止液，終止反應。 （4）在450 nm 波長下測量各孔的吸光度（OD 值）。在加終止液后15 min以內(nèi)進行測定。最后根據(jù)所得標準曲線，計算每個組織指標含量。

1.5.4 RT-PCR 法測主動脈IGF-1 的mRNA 表達量和肝組織IGF-1、Sp1 的mRNA 表達量 （1）β-actin、IGF-1 和SP1 共3 對RT-PCR 引物的設計（見表1）。（2）RNA 提?。悍謩e取主動脈、肝臟樣品100 mg 加液氮研磨；取Trizol 1 mL 室溫下裂解5 min，在4 ℃、12 000 r/min 下離心10 min；取上清，每1 mL 裂解液中加入氯仿0.2 mL，震蕩15 s，室溫孵育3 min，于4 ℃、12 000 r/min 下離心10 min，樣品分3 層后，取最上層，記錄其水相體積；加與水相體積一半的乙醇，混勻轉(zhuǎn)移至吸附柱，以12 000 r/min 離心45 s；加去蛋白液500 μL 再以12 000 r/min 離心45 s，加500 μL 漂洗液洗兩次，12 000 r/min 離心45 s；用100 μL 水洗脫RNA，微量酶標儀測定RNA 濃度。（3）RNA 逆轉(zhuǎn)錄：每個樣品取1 μg 進行逆轉(zhuǎn)錄，配制逆轉(zhuǎn)錄體系。（4）RT-PCR 上機檢測進行程序擴增。瓊脂糖凝膠電泳檢測：分別于每個樣品中取1.5 μL在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳10 min，使用凝膠成像儀成像。

表1 β-actin、IGF-1 和Sp1 引物信息表

1.6 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)在SPSS 25.0 中進行統(tǒng)計分析。 RTPCR 檢驗統(tǒng)計方法為多組One-way ANOVA 法。 當計量資料不滿足正態(tài)分布時，多組間比較選擇非參數(shù)秩和檢驗—K 個獨立樣本Kruskal Wallis 檢驗，以“M（IQR）”表示，當組間差異有統(tǒng)計學意義時則行多重比較，以“±s”表示。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組實驗兔血清中TC、TG、LDL-C 的含量比較

造模前，各組血清中TC、TG、LDL-C 含量水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。造模后，模型組與隔藥餅灸組的TC 值均高于正常組（P＜0.05），表明造模成功。 造模后，正常組因腹瀉死亡1 只，隔藥餅組因骨折后感染死亡1 只。干預后，模型組因腹瀉死亡1 只、體表脂肪瘤破潰感染死亡1 只，隔藥餅灸組因捆縛固定致傷口感染死亡2 只。

造模后，模型組、隔藥餅灸組與正常組比較，血清中TC、TG、LDL-C 含量升高（P＜0.05）；隔藥餅灸組與模型組比較，組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。干預后，模型組、隔藥餅灸組與正常組比較，血清中TC、TG、LDL-C 含量升高（P＜0.05）；與模型組比較，隔藥餅灸組血清中TC、TG、LDL-C 含量降低（P＜0.05）。詳見表2。

表2 各組實驗兔造模前、造模后、干預后TC、TG、LDL-C 含量比較[M（IQR），mmol/L]

2.2 各組實驗兔血清中IGF-1、Sp1 蛋白含量比較

干預后，與正常組比較，模型組血清中IGF-1、Sp1 含量上升（P＜0.01）；與模型組比較，隔藥餅灸組血清中IGF-1、Sp1 含量下降（P＜0.01）。 詳見表3。

表3 各組實驗兔血清中IGF-1、Sp1 蛋白含量比較（±s）

表3 各組實驗兔血清中IGF-1、Sp1 蛋白含量比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

分組正常組模型組隔藥餅灸組n 11 10 9 IGF-1/（pg/mL）91.86±37.24 212.40±61.56**127.66±18.42##Sp1/（μg/mL）2.91±0.75 5.73±2.25**3.72±0.71##

2.3 各組測實驗兔主動脈IGF-1 的mRNA 表達量比較

與正常組比較，模型組主動脈IGF-1 的mRNA表達量明顯上升（P＜0.001）；與模型組比較，隔藥餅灸組IGF-1 的mRNA 表達量明顯下降（P＜0.01）。 詳見表4。

表4 各組實驗兔主動脈IGF-1 的mRNA 表達量比較（±s）

表4 各組實驗兔主動脈IGF-1 的mRNA 表達量比較（±s）

注：與正常組比較，***P＜0.001；與模型組比較，##P＜0.01。

分組正常組模型組隔藥餅灸組n 11 10 9 IGF-1/（pg/mL）1.00±0.06 2.69±0.15***2.07±0.27##

2.4 各組實驗兔肝組織IGF-1、Sp1 的mRNA 表達量的比較

與正常組比較，模型組肝組織IGF-1、Sp1 的mRNA 表達量顯著上升（P＜0.001、P＜0.01）；與模型組比較，隔藥餅灸組IGF-1、Sp1 的mRNA 表達量均明顯下降（P＜0.01）。 詳見表5。

表5 各組實驗兔肝組織IGF-1、Sp1 的mRNA表達量比較（±s）

表5 各組實驗兔肝組織IGF-1、Sp1 的mRNA表達量比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型組比較，##P＜0.01。

分組正常組模型組隔藥餅灸組n 11 10 9 IGF-1/（pg/mL）1.00±0.14 3.34±0.19***2.13±0.18##Sp1/（μg/mL）1.00±0.34 2.16±0.26**1.05±0.18##

3 討論

HLP 是由于體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂導致脂質(zhì)水平異常的代謝性疾病。 血脂的異常明顯受飲食及生活方式的影響，飲食治療和生活方式的改善是治療血脂異常的基礎措施[9]。故本研究在高脂飲食造HLP兔模型成功后，將模型組和隔藥餅灸組更換為普通飼料喂養(yǎng)，觀察飲食方式的改變對HLP 模型兔的影響。 更換為普食后，與高脂飲食造模后相比，模型組與隔藥餅灸組TC、LDL-C 水平均有下降，雖然差異無統(tǒng)計學意義，但可繼續(xù)關注飲食生活方式對血脂異常的影響，做進一步的研究。 隔藥餅灸能夠?qū)⒀ㄎ淮碳ぷ饔谩?中藥藥理作用和艾灸溫熱作用結(jié)合，是課題組臨床試驗與基礎研究多年的成果，其選取心俞、脾俞、肝俞和巨闕、天樞、豐隆作為主要施灸穴位[10-11]。 巨闕，為心之募穴，理氣寬胸止痛。 心俞，主強心通脈活血。 豐隆、脾俞、肝俞和天樞4 穴共用，為辨證配穴，旨在健脾疏肝暢胃腸。 上述6 穴共用，起到活血逐瘀、疏肝理氣及健脾祛痰之效。 課題組前期關于RCT 機制研究表明， 隔藥餅灸可通過增加肝過氧化酶體增殖物激活型受體（peroxisome proliferator-activated receptors, PPAR）γ 的表達、誘導清道夫受體B 類1 型（scavenger receptor class B member 1, SR-B1）表達[12]；可抑制拉斯同源家族成員A/RhoA 相關螺旋激酶1（ras homolog family member A/Rho associated coiled-coil containing protein kinase 1, RhoA/ROCK1）mRNA 表達，激發(fā)肝臟X 受體（liver X recepter, LXR）mRNA 表達[13]；可 能 增 強肝臟RCT 核受體LXRα 的表達[14]，從而促進RCT，調(diào)節(jié)血脂發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用。

本實驗在高脂高膽固醇飲食造模8 周后，與正常組比，模型組與隔藥餅組血清TC、TG、LDL-C 含量均升高，并且TC 值高于正常組TC 值3 倍以上，血清TG 和LDL-C 含量與正常組相較升高，說明HLP模型造模成功。 隔藥餅灸干預8 周后，與模型組比較，隔藥餅灸組TC、TG、LDL 含量均下降，其中TG含量下降至正常值水平，與前期研究一致[1]，肯定了隔藥餅灸的降脂療效。本研究發(fā)現(xiàn)，隔藥餅灸組與模型組比較，下調(diào)了HLP 兔血清中IGF-1、Sp1 的蛋白含量，下調(diào)了主動脈IGF-1 的mRNA 和肝組織IGF-1、Sp1 的mRNA 表達量。

IGF-1 結(jié)構與胰島素相似，是由70 多個氨基酸組成的單鏈多肽，參與體內(nèi)蛋白、糖、脂質(zhì)等代謝，可以在生物體內(nèi)的心臟、肝臟等多組織器官中檢測到[4]。 IGF-1 通過特異性結(jié)合靶細胞表面IGF-1 受體而發(fā)揮生物學效應，促進肝臟及肌肉對外源性氨基酸和葡萄糖的攝取，促進脂肪動員[15]。 IGF-1 是防止LDL-C 水平升高的一個保護因素，保持一定的IGF-1水平可以調(diào)節(jié)血清LDL-C 濃度[6]。 IGF-1 缺陷的小鼠表現(xiàn)出脂質(zhì)代謝相關基因和參與肝臟中膽固醇合成酶的表達失調(diào)[16]。 IGF-1 潛在的促動脈粥樣硬化作用能增強LDL 的攝取和膽固醇酯化[17]。 有研究發(fā)現(xiàn)，TC、LDL-C、HDL-C 和TG 隨著IGF-1 皮質(zhì)醇水平的上升而增加[18]。電針豐隆穴能通過下調(diào)IGF-I的mRNA 表達，從而介導RCT[4]。 RCT 是通過LDL-C 將其攜帶的膽固醇轉(zhuǎn)運到外周組織細胞，通過HDL-C將其攜帶的膽固醇從外周組織細胞轉(zhuǎn)運回肝臟進行消除的過程[19]。 低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor, LDL-R）負責RCT 介導HDL-C和LDL-C 分別從血液中攝取[20]。 本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，隔藥餅灸組下調(diào)了HLP 兔血清中IGF-1 的含量，下調(diào)了主動脈、肝組織IGF-1 的mRNA表達量。故推測隔藥餅灸通過下調(diào)血清中IGF-1 的含量，下調(diào)組織中IGF-1 的mRNA 表達量，調(diào)節(jié)對LDL-C的攝取，從而參與RCT 過程，發(fā)揮血脂調(diào)節(jié)作用。FRIEDRICH等[21]提出血清IGF-1是多發(fā)性硬化發(fā)展的風險預測因素。 更有研究表明血清IGF-1 和心血管疾病之間存在U 型關系，高和低水平IGF-1 均可預測心血管疾病死亡率[22]。 因現(xiàn)有研究關于IGF-1 與人類代謝疾病關系存有爭議與矛盾，故根據(jù)“U型關系理論”，IGF-1 水平過低或過高均可預測心血管疾病死亡率，推測隔藥餅灸通過將IGF-1 水平下調(diào)至生理最優(yōu)區(qū)間水平，從而起到調(diào)節(jié)血脂代謝的作用。

Sp1 屬于Sp 蛋白家族(Sp1～Sp9)，能通過結(jié)合這些基因調(diào)控區(qū)的GC/GT 區(qū)以及通過磷酸化、糖基化、甲基化、乙酰化等多種翻譯后修飾，發(fā)揮對基因轉(zhuǎn)錄的促進/抑制作用和調(diào)控編碼蛋白活性的作用[23]。Sp1 轉(zhuǎn)錄因子在與脂肪酸合成相關的基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要作用[24]，而這些基因?qū)τ诰S持脂肪組織的穩(wěn)態(tài)具有重要意義[25-26]。LDL-C 水平的升高會促進Sp1磷酸化來增加RCT 過程中的關鍵蛋白SR-B1 在肝臟中的表達，從而加速血漿中HDL-C 攝取進入肝細胞的RCT 過程[19]。 同時，Sp1 和SR-B1 協(xié)同激活LDL-R 啟動子，上調(diào)肝細胞中LDL-R，降低血液LDL-C水平[27]。前期研究表明，隔藥餅灸可以通過誘導SRB1 表達，促進RCT 調(diào)節(jié)血脂[12]。本研究中，與模型組比較，隔藥餅灸組下調(diào)了HLP 兔血清中Sp1 的含量，下調(diào)了肝組織Sp1 的mRNA表達量。 故推測隔藥餅灸能夠下調(diào)HLP 模型兔Sp1 含量與表達，協(xié)同激活SR-B1，調(diào)控肝細胞中LDL-R，降低血液LDL-C 水平，促進RCT。富含GC 的區(qū)域內(nèi)的Sp1 位點可能是IGF-1 受體信號傳導的靶標[28]。 胰島素增加了Sp1與IGF-1 基因啟動子的結(jié)合[29]。Sp1 結(jié)合活性升高誘導IGF-1 增強了酪酪肽轉(zhuǎn)錄，介導熱量營養(yǎng)的攝入；IGF-1 增加了Sp1 蛋白水平，而用IGF-1 受體抗體阻斷IGF-1 受體后可抑制Sp1 蛋白水平的升高[30]。所以Sp1 可通過結(jié)合IGF-1 受體基因調(diào)控區(qū)的GC/GT 區(qū)，激活IGF-1 信號通路。 Sp1 轉(zhuǎn)錄因子是IGF-1作用的一個關鍵介質(zhì)，它通過激活P450 側(cè)鏈裂解酶（P450scc）基因的表達[31]，介導類固醇生成作用[32]。 故Sp1 轉(zhuǎn)錄因子通過介導IGF-1 誘導P450scc 基因的表達介導類固醇物質(zhì)的生成[33]，激活IGF-1/Sp1 信號通路，從而調(diào)節(jié)膽固醇物質(zhì)的生成與轉(zhuǎn)化。

綜上所述，隔藥餅灸通過下調(diào)血清中IGF-1 的含量，下調(diào)組織中IGF-1 的mRNA 表達量，調(diào)節(jié)對LDL-C 的攝??；通過下調(diào)Sp1 含量與表達，調(diào)控肝細胞中LDL-R，降低血液LDL-C 水平，促進RCT。所以IGF-1 和Sp1 通過調(diào)節(jié)對LDL-C 的攝取，參與RCT 過程。 故推測隔藥餅灸影響IGF-1/Sp1 信號通路，通過RCT 環(huán)節(jié)，調(diào)節(jié)LDL-C 的攝取和轉(zhuǎn)運，從而緩解HLP。