少腹逐瘀湯改善高胰島素血癥小鼠子宮內(nèi)膜容受性的機制研究

諶澤芳，李澤潞，李涵宇，李艷軍，余曦明，張 偉，賀 冰*

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙410005）

近年來，子宮內(nèi)膜容受性的改善日益成為生殖領(lǐng)域的熱點。有報道稱，在體外受精中胚胎因素占植入失敗原因的1/3，而子宮內(nèi)膜容受性因素作用占2/3[1]。 子宮內(nèi)膜容受性是指子宮內(nèi)膜容許胚胎進行定位、黏附、侵入內(nèi)膜的能力[2]。 良好的子宮內(nèi)膜容受性是成功妊娠的重要條件[3]。 研究表明，高胰島素血癥會使得體內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運減少，細胞葡萄糖利用異常，最終導致子宮內(nèi)膜容受性下降[4]。 同時體內(nèi)糖代謝異常，血糖長期過高也會引起血液流變學改變，更容易發(fā)生瘀滯[5]。 不孕癥患者一般病程較長，中醫(yī)學有“久病入絡”“久病則瘀”之說，而活血祛瘀法在提高子宮內(nèi)膜容受性上具有一定的理論和實踐基礎，其代表方之一就是少腹逐瘀湯，臨床治療不孕癥療效良好[6]，但其作用于子宮內(nèi)膜容受性的機制有待進一步探索。本研究在中醫(yī)活血化瘀理論指導下，探討少腹逐瘀湯是否通過調(diào)節(jié)糖代謝，影響子宮內(nèi)膜整合素αvβ3 mRNA 和環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase-2,COX-2）、白血病抑制因子（leuke-mia inhibitory, LIF）、溶血磷脂酸受體3（lysophosphatidic acid receptor 3,LPAR3）蛋白的表達，從而改善高胰島素血癥小鼠子宮內(nèi)膜容受性的作用。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF 級6 周齡雌性昆明小鼠70 只，體質(zhì)量（22.5±2.5） g，由湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供（實驗動物質(zhì)量合格證號：110727201100782834）；SPF 級8 周齡雄性昆明小鼠35 只，體質(zhì)量（30±5） g，由湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供（實驗動物質(zhì)量合格證號：1107272011004221）。 實驗動物許可證號：SCXK（湘）2020-0005。 動物均飼養(yǎng)在湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心，晝夜交替各12 h，溫度21～26 ℃，濕度40%～50%。本實驗研究通過湖南中醫(yī)藥大學動物倫理委員會審核（審批號：2020061701）。

1.2 主要藥物與試劑

少腹逐瘀湯（炒小茴香1.5 g，炒干姜3 g，延胡索3 g，沒藥6 g，當歸9 g，川芎9 g，肉桂3 g，赤芍6 g，生蒲黃9 g，炒五靈脂6 g），所有中藥飲片均購自湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，制成濃度0.8 g/mL的提取液。 阿司匹林腸溶片（規(guī)格為50 mg/片，北京舒泰神生物制藥股份有限公司，批號：180902）；戊酸雌二醇片（規(guī)格為1 mg/片，拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，批號：130208）；甘精胰島素注射液（規(guī)格為3 mL∶300 IU，北京賽諾菲制藥有限公司，批號：S2014004）。LIF 抗體（批號：46u3290）、COX-2 抗體（批號：86f4760）均購自美國Affinity biosciences公司；LPAR3 抗體（批號：AF12237836）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；HRP-羊抗兔二抗（批號：SA00001-1）購自美國Proteintech 公司；小鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號：3CMESFA5UL）。

1.3 主要儀器

血糖檢測儀（江蘇魚躍醫(yī)療設備股份有限公司，型號：590）；組織切片機、熒光定量PCR 儀均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司（型號分別為HM325、PIKOREAL96）；顯微鏡（廈門麥克奧迪電氣股份有限公司，型號：BA410E）；臺式冷凍離心機（湖南湘儀科技有限公司，型號：H1650R）；搖床（江蘇其林貝爾儀器制造有限公司，型號：TS-1）；電泳儀、水平瓊脂糖電泳槽均購自北京六一生物科技有限公司（型號分別為DYY-2C、DYCP-31DN）；掃描電鏡（日本日立公司，型號：S-3400N）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥方法

雌性小鼠適應性喂養(yǎng)2 周，同時記錄其動情周期。參照文獻[7]，建立高胰島素不孕小鼠模型。將健康未孕的雌性小鼠隨機分為正常組和高胰島素組。每天早上8:00 開始注射， 正常組注射生理鹽水，高胰島素組注射重組人胰島素，使用長時間梯度劑量皮下注射法：一開始持續(xù)皮下注射0.5 μL，從第17天起逐漸加大劑量，至第23 天時，注射量為8.0 μL，妊娠后每天持續(xù)皮下注射2.0 μL。 造模結(jié)束后，于晚上8:00 左右，所有小鼠按照1 只正常性成熟雄鼠和2 只動情周期正常的雌鼠分組合籠進行交配，次日早7:00 查看合籠雌鼠陰道栓。若雌鼠陰道內(nèi)發(fā)現(xiàn)乳白色的陰道栓則記為交配日后第1 天。 將妊娠的高胰島素組小鼠隨機分為模型組、阿司匹林組（7.500 mg/kg）、戊酸雌二醇組（0.104 mg/kg）、少腹逐瘀湯正常劑量組（7.500 g/kg，相當于臨床等效劑量）、少腹逐瘀湯高劑量組（15.000 g/kg，相當于臨床2 倍劑量），每組10只。 阿司匹林與戊酸雌二醇在灌胃前，均用PBS溶成混懸液，正常組和模型組小鼠每天灌胃與自身體積相對應的蒸餾水，藥物組灌胃相應的藥物。

2.2 指標觀察與檢測

2.2.1 監(jiān)測血糖 小鼠造模結(jié)束后及交配日后第5天、第10 天，收集尾靜脈取血血液，采用血糖儀監(jiān)測血糖。

2.2.2 ELISA 法測定血清胰島素水平 各組小鼠分別在交配日后第5 天、第10 天進行眼球取血，靜置2 h，3000 r/min，離心半徑8 cm 持續(xù)離心10 min，吸出上層清亮液體，具體操作按ELISA 試劑盒進行。 采用穩(wěn)態(tài)模型法計算胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment of insulin resistance, HOMA-IR），HOMA-IR=血糖×血清胰島素/22.5[4]。

2.2.3 HE 染色觀察子宮內(nèi)膜厚度及結(jié)構(gòu) 各組小鼠分別在交配日后第5 天、第10 天取子宮，放入4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切片，蘇木素伊紅染色，在顯微鏡下觀察子宮內(nèi)膜厚度及結(jié)構(gòu)，拍照并記錄。

2.2.4 免疫組化法檢測子宮內(nèi)膜COX-2、LIF、LPAR3蛋白表達 各組小鼠分別在交配日后第5 天、第10天取子宮組織，進行石蠟切片脫蠟，抗原修復，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉，加一抗和二抗，DAB顯色，陽性為棕黃色，蘇木素復染細胞核，脫水封片。拍照，計算機圖像處理軟件半定量測定各組COX-2、LIF、LPAR3 蛋白的含量，采用平均積分光密度值表示各指標的表達量，進行測量處理并記錄。

2.2.5 掃描電鏡觀察子宮內(nèi)膜胞飲突 各組小鼠分別在交配日后第5 天、第10 天取子宮組織，用眼科剪剪開剛?cè)〕龅淖訉m，將其裁剪為5 mm×8 mm，立即夾起組織放入PBS 中超聲震蕩清洗3 次，每次10 min。接著，按序固定于2.5%戊二醛、鋨酸溶液中，時間分別為24 h 和2 h。在雙蒸水中蕩滌3 次，每次10 min。按序在50%、70%、90%、100%的丙酮溶液中脫水，每次10 min。 再于50%、70%、90%、100%的醋酸異戊酯溶液中進行置換，每次10 min。 最后采用臨界點干燥法干燥，真空噴鍍金膜，獲取樣本圖像。

2.2.6 實時熒光定量PCR 法檢測整合素αvβ3 mRNA 表達 各組小鼠分別在交配日后第5 天、第10天取子宮組織，TRIzol 法提取組織總RNA，采取紫外分光光度計對RNA 濃度進行檢測。以組織總mRNA為模板，進行逆轉(zhuǎn)錄互補DNA，逆轉(zhuǎn)錄反應及實時熒光定量PCR 檢測步驟按照說明書進行。采取2-△△Ct法對mRNA 相對表達量進行分析計算。 引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列信息見表1。

表1 各基因引物信息表

2.2.7 顯微鏡觀察胚胎著床位點數(shù) 雌鼠陰道口發(fā)現(xiàn)陰栓記為交配日后第1 天，交配日后第10 天將各組小鼠斷頭處死并取出子宮[8]。 將取出的子宮去除周圍軟組織后，用生理鹽水多次沖洗，置于冰上觀察并記錄胚胎著床位點數(shù)。

2.3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件對所有數(shù)據(jù)進行計算和處理。 計量資料以“±s”表示，符合正態(tài)分布及方差齊性，多組間比較選取單因素方差分析，兩兩比較采用SNK/LSD 檢驗，方差不齊時用Kruskal-Wallis H檢驗。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠糖代謝水平比較

造模后，與正常組比較，高胰島素組小鼠血糖、血清胰島素水平和HOMA-IR 均明顯高于正常組（P＜0.05）。 詳見表2。

表2 高胰島素對小鼠糖代謝的影響（±s，n=10）

表2 高胰島素對小鼠糖代謝的影響（±s，n=10）

注：與正常組比較，*P＜0.05。

組別正常組高胰島素組血糖/(mmol·L-1)7.87±0.21 11.23±0.85*血清胰島素/(mU·L-1)13.25±1.91 24.17±0.88*HOMA-IR 4.43±0.56 12.05±0.47*

交配日后第5 天，阿司匹林組、戊酸雌二醇組、少腹逐瘀湯正常劑量組、少腹逐瘀湯高劑量組血糖、血清胰島素水平均明顯低于模型組（P＜0.05，P＜0.01），少腹逐瘀湯正常劑量組、少腹逐瘀湯高劑量組血清胰島素水平均明顯低于阿司匹林組（P＜0.01），少腹逐瘀湯高劑量組血清胰島素水平明顯低于戊酸雌二醇組（P＜0.05）。 交配日后第10 天，少腹逐瘀湯正常劑量組、少腹逐瘀湯高劑量組血糖均明顯低于模型組（P＜0.05），阿司匹林組、戊酸雌二醇組、少腹逐瘀湯正常劑量組、少腹逐瘀湯高劑量組血清胰島素水平均明顯低于模型組（P＜0.05，P＜0.01），少腹逐瘀湯正常劑量組、少腹逐瘀湯高劑量組血清胰島素水平均明顯低于阿司匹林組（P＜0.05）。 交配日后第5 天和第10 天，少腹逐瘀湯高劑量組血糖、血清胰島素水平均低于少腹逐瘀湯正常劑量組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。 詳見圖1-2。

圖1 交配日后第5 天、第10 天各組小鼠血糖水平

3.2 各組小鼠平均胚胎著床位點數(shù)比較

模型組小鼠胚胎著床位點數(shù)明顯低于正常組（P＜0.05）。 阿司匹林組、戊酸雌二醇組、少腹逐瘀湯正常劑量組、少腹逐瘀湯高劑量組胚胎著床位點數(shù)均明顯高于模型組（P＜0.05）。 各藥物組間胚胎著床位點數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。少腹逐瘀湯正常劑量組胚胎著床位點數(shù)略高于少腹逐瘀湯高劑量組，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。 詳見表3。

表3 各組小鼠平均胚胎著床位點數(shù)比較（±s，n=5）

表3 各組小鼠平均胚胎著床位點數(shù)比較（±s，n=5）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別正常組模型組阿司匹林組戊酸雌二醇組少腹逐瘀湯正常劑量組少腹逐瘀湯高劑量組平均胚胎著床位點數(shù)/個4.6±1.85 1.2±1.17*5.6±2.33△8.4±2.41*△10.0±2.83*△9.2±1.87*△

3.3 各組小鼠子宮內(nèi)膜胞飲突表達比較

正常組胞飲突個大圓潤，內(nèi)膜表面絨毛細密；與正常組比較，模型組的胞飲突小且皺縮，絨毛稀少；各藥物組的胞飲突較多，表面光滑飽滿，表達成熟，大小均一，且均優(yōu)于模型組。 詳見圖3。

圖3 各組小鼠子宮內(nèi)膜胞飲突表達（掃描電鏡，×5000，bar=10 μm）

3.4 各組小鼠子宮內(nèi)膜厚度及形態(tài)比較

交配日后第5 天，正常組小鼠子宮內(nèi)膜厚度增加，腺體數(shù)量增多，血管較多；模型組的子宮內(nèi)膜生長遲緩，子宮內(nèi)膜間質(zhì)變得更加致密，腺體減少，血管數(shù)量少；阿司匹林組、戊酸雌二醇組子宮內(nèi)膜厚度較模型組增加，腺體及血管數(shù)量均增多。少腹逐瘀湯正常劑量組、少腹逐瘀湯高劑量組子宮內(nèi)膜形態(tài)近似于正常組，子宮內(nèi)膜腺體、血管均較模型組豐富。與交配日后第5 天相比，第10 天模型組的子宮內(nèi)膜變化更為明顯，內(nèi)膜間質(zhì)更加稀疏，腺體更多；阿司匹林組、戊酸雌二醇組及少腹逐瘀湯正常劑量組、少腹逐瘀湯高劑量組子宮內(nèi)膜、子宮腺體、子宮血管也較前明顯改變。 詳見圖4。

圖2 交配日后第5 天、第10 天各組小鼠血清胰島素水平

圖4 各組小鼠子宮內(nèi)膜厚度及形態(tài)（HE，×100，bar=100 μm）

交配日后第5 天和第10 天，模型組子宮內(nèi)膜厚度均薄于正常組（P＜0.01），阿司匹林組、戊酸雌二醇組及少腹逐瘀湯正常劑量組、少腹逐瘀湯高劑量組子宮內(nèi)膜均厚于模型組（P＜0.05，P＜0.01）。詳見圖5。

圖5 各組小鼠子宮內(nèi)膜厚度

3.5 各組小鼠子宮內(nèi)膜COX-2、LIF、LPAR3 蛋白表達水平比較

交配日后第5 天和第10 天，模型組子宮內(nèi)膜COX-2、LIF、LPAR3 蛋白表達水平均明顯低于正常組（P＜0.01），阿司匹林組、戊酸雌二醇組、少腹逐瘀湯正常劑量組、少腹逐瘀湯高劑量組子宮內(nèi)膜COX-2、LIF、LPAR3 蛋白表達水平均明顯高于模型組（P＜0.05）。交配日后第10 天，少腹逐瘀湯高劑量組COX-2蛋白表達水平均明顯高于阿司匹林組、戊酸雌二醇組、少腹逐瘀湯正常劑量組（P＜0.05，P＜0.01），少腹逐瘀湯高劑量組LPAR3 蛋白表達水平明顯高于戊酸雌二醇組（P＜0.05）。 詳見圖6-7。

圖6 第5 天各組小鼠子宮內(nèi)膜COX-2、LIF、LPAR3 蛋白表達情況（免疫組化，×200，bar=100 μm）

3.6 各組小鼠子宮內(nèi)膜整合素αvβ3 mRNA 表達水平比較

圖7 第10 天各組小鼠子宮內(nèi)膜COX-2、LIF、LPAR3 蛋白表達情況（免疫組化，×200，bar=100 μm）

交配日后第5 天和第10 天，模型組整合素αv、整合素β3 mRNA 表達水平均明顯低于正常組（P＜0.01）。 交配日后第5 天，阿司匹林組和少腹逐瘀湯高劑量組整合素αv、整合素β3 mRNA 表達水平均明顯高于模型組（P＜0.01）；戊酸雌二醇組、少腹逐瘀湯正常劑量組整合素αv mRNA 表達水平均明顯低于阿司匹林組（P＜0.01）；戊酸雌二醇組、少腹逐瘀湯正常劑量組、少腹逐瘀湯高劑量組整合素β3 mRNA表達水平均明顯低于阿司匹林組（P＜0.01）。 交配日后第10 天，阿司匹林組整合素αv mRNA 表達水平明顯高于模型組（P＜0.01）；戊酸雌二醇組整合素αv mRNA 表達水平明顯低于阿司匹林組（P＜0.01）。 詳見圖8-9。

圖8 第5 天各組小鼠子宮內(nèi)膜整合素αvβ3 mRNA 表達情況

4 討論

近年來，不孕癥的患者日益增多，全球約有8000萬對夫婦患病，發(fā)展中國家的患病率高達30%[9]。 子宮內(nèi)膜容受性可以表示子宮內(nèi)膜在一個特殊時期的狀態(tài)，這是胚胎是否移植成功的重要前提[10-11]。 研究表明，大多數(shù)患有高胰島素血癥的女性，子宮內(nèi)膜容受性發(fā)生改變，更容易不孕或流產(chǎn)[12]。中醫(yī)學認為腎主生殖，腎氣充盛、陰陽氣血調(diào)和方能有孕，子宮內(nèi)膜為胚胎生長發(fā)育提供基本條件，血液充養(yǎng)是維持其生理功能的物質(zhì)基礎。 若血液運行不暢而致血瘀，則會阻滯胞脈，胚胎失于濡養(yǎng)，無法正常種植于子宮[13]。少腹逐瘀湯被譽為“種子第一方”，君藥為五靈脂、蒲黃，具有活血化瘀的作用；臣藥為延胡索、川芎、當歸、沒藥、赤芍，具有養(yǎng)血活血的作用；干姜、肉桂為佐藥，具有溫經(jīng)散寒之功效；全方以活血化瘀、溫陽散寒、舒經(jīng)通絡為治法，在不孕不育患者中取得良好療效[14]。

圖9 第10 天各組小鼠子宮內(nèi)膜整合素αvβ3 mRNA 表達情況

胰島素水平過高不僅會導致子宮內(nèi)膜容受性下降，而且影響早期胚胎發(fā)育，增加流產(chǎn)風險[15]。 本實驗采取長效胰島素持續(xù)梯度注射法建立小鼠高胰島素血癥模型。 結(jié)果表明，高胰島素組平均血清胰島素及血糖高于正常組（P＜0.05）。高胰島素組HOMAIR 大于正常組（P＜0.05），模型成功建立。 相比交配日后第5 天，第10 天血糖及血清胰島素均下降；與模型組比，少腹逐瘀湯組血糖及血清胰島素均明顯降低（P＜0.05），且少腹逐瘀湯高劑量組稍優(yōu)于正常劑量組，這提示少腹逐瘀湯可以通過調(diào)控糖脂代謝改善內(nèi)環(huán)境，增加子宮內(nèi)膜容受性，從而提高妊娠率，同時長時間、高劑量療效更佳。

子宮內(nèi)膜容受性的標志性因子包括胞飲突、整合素、LIF、COX-2、LPAR3 等。 大量研究認為，成熟的胞飲突是子宮內(nèi)膜容受性的特異性標志物[16]。 本實驗發(fā)現(xiàn)，高胰島素血癥會導致小鼠子宮內(nèi)膜增生異常、內(nèi)膜絨毛退化、胞飲突小且表面皺縮；少腹逐瘀湯能改善這種損傷，使得子宮內(nèi)膜接近未受損狀態(tài)，促進胞飲突成熟表面光滑。 LIF 表達與胚胎著床時間基本一樣，是判斷子宮內(nèi)膜能否容納囊胚的重要指標[17]。 COX-2 可以很好反映子宮內(nèi)膜容受性，對于胚胎植入和早期妊娠維持至關(guān)重要[18]。 LPAR3 促進子宮內(nèi)膜蛻膜化和血管化， 改善子宮內(nèi)膜容受性，最終建立適于胚胎種植的子宮內(nèi)膜環(huán)境[19]。研究表明，整合素αvβ3 mRNA 能夠作為判斷子宮內(nèi)膜容受性高低的根據(jù)[20]。 本研究發(fā)現(xiàn)，交配日后第5天、第10 天，與正常組比，模型組COX-2、LIF、LPAR3、整合素αvβ3 mRNA 的表達均明顯下降（P＜0.05），表明高胰島素血癥會使得子宮內(nèi)膜厚度減少，腺體數(shù)量下降，并降低子宮內(nèi)膜COX-2、LIF、LPAR3、整合素αvβ3 mRNA 的表達量，使得內(nèi)膜容受性低下，從而受孕率降低。牛雯穎等[21]研究表明少腹逐瘀湯具有降脂、降低血液黏度作用。 在本次研究中，交配日后第5 天、第10 天，與模型組比，少腹逐瘀湯正常、高劑量組小鼠子宮內(nèi)膜COX-2、LIF、LPAR3 蛋白表達水平均明顯增高（P＜0.05）。交配日后第5 天，與模型組比，少腹逐瘀湯高劑量組整合素αvβ3 表達水平明顯增高（P＜0.05）。 這提示少腹逐瘀湯可能通過調(diào)控整合素αvβ3 進而提高COX-2、LIF、LPAR3 表達，改善子宮內(nèi)膜容受性，促進胚胎著床。

綜上所述，少腹逐瘀湯能夠提高高胰島素血癥小鼠 子 宮 內(nèi) 膜COX-2、LIF、LPAR3 及 整 合 素αvβ3 mRNA 表達，表明少腹逐瘀湯可能通過調(diào)節(jié)糖代謝水平，影響子宮內(nèi)膜整合素αvβ3 mRNA 的表達，調(diào)控COX-2、LIF、LPAR3 釋放，來改善子宮內(nèi)膜容受性受損的情況，從而使臨床妊娠率不斷上升。