數(shù)字全息波前聚焦算法在生物成像中應(yīng)用

匡青云，趙志雄，楊 鴻

（1.重慶城市職業(yè)管理學(xué)院，重慶 400054；2.重慶機(jī)電職業(yè)技術(shù)大學(xué)，重慶 400054；3.重慶電子工程職業(yè)學(xué)院，重慶 400054）

引言

隨著生物醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)的快速發(fā)展，定性、平面和非實(shí)時(shí)觀測(cè)培養(yǎng)液中的生物細(xì)胞已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代化研究需求。為了觀察細(xì)胞的結(jié)構(gòu)形態(tài)、生理參數(shù)、藥物對(duì)細(xì)胞的作用機(jī)理及細(xì)胞間相互作用等動(dòng)態(tài)特性，對(duì)觀測(cè)提出了定量、三維和實(shí)時(shí)響應(yīng)的要求。數(shù)字全息術(shù)是把全息圖記錄下來(lái)后儲(chǔ)存于電腦中，利用光電子元件CCD(或CMOS)作為介質(zhì)，利用衍射傳播理論對(duì)目標(biāo)的光波復(fù)原及傳輸進(jìn)行仿真。物光波傳輸經(jīng)過(guò)不同折射率或厚度不同的目標(biāo)物體或目標(biāo)物體受到溫度變化等環(huán)境影響發(fā)生熱物理性質(zhì)改變時(shí)，它的實(shí)際距離是難以精確測(cè)量的。在數(shù)字全息重現(xiàn)過(guò)程中，重現(xiàn)距離直接受到真實(shí)記錄距離的影響，當(dāng)重現(xiàn)距離與真實(shí)記錄距離出現(xiàn)較大偏差時(shí)，物體的重現(xiàn)就像是模糊不清，信噪比降低，觀測(cè)精度下降。數(shù)字全息運(yùn)用菲涅爾- 基爾霍夫衍射理論數(shù)字重建物體波前[1]，該數(shù)值化過(guò)程可采用聚焦函數(shù)和聚焦算法來(lái)確定最佳再現(xiàn)距離，使最佳聚焦位置處的再現(xiàn)像清晰，信噪比提升，有利于高精度測(cè)量。

目前，聚焦算法中廣泛運(yùn)用物體波前的振幅信息[2-3]。沿光軸重建出的一系列再現(xiàn)像，聚焦函數(shù)在最大或最小值等函數(shù)特征點(diǎn)時(shí)再現(xiàn)像銳利度最高，最清晰。常用熵[4]，方差[5]，頻譜[3]以及使用相關(guān)系數(shù)法作為聚焦函數(shù)的評(píng)價(jià)參數(shù)來(lái)確定重建像的最佳聚焦位置。

在介紹全息理論基礎(chǔ)之上，作為聚焦算法獲得最佳聚焦位置的基本原理，分析利用物體振幅信息的相關(guān)系數(shù)法。介紹物體相位信息的相關(guān)系數(shù)法，在對(duì)纏繞相位信息進(jìn)行解包處理后，作為判別焦平面過(guò)程的聚焦算法。將含有尺寸大小不同的圓形顆粒標(biāo)準(zhǔn)靶面作為目標(biāo)物體分析從物體振幅和相位信息聚焦算法中所得最佳聚焦距離的加權(quán)結(jié)果對(duì)比結(jié)果。將洋蔥表皮生物細(xì)胞標(biāo)本為目標(biāo)觀測(cè)物體，分析不同聚焦算法即振幅信息的聚焦算法，相位信息的聚焦算法，波前信息的聚焦算法所得重建像銳利度，觀測(cè)生物細(xì)胞標(biāo)本的三維形貌。

1 基本原理

1.1 相關(guān)系數(shù)法的基本原理

相關(guān)系數(shù)法（CC）計(jì)算以該平面為中心光軸左右對(duì)稱兩側(cè)重建像的相似程度作為評(píng)價(jià)參量，相關(guān)系數(shù)法（CC）計(jì)算以該平面為中心光軸左右對(duì)稱兩側(cè)重建像的相似程度作為評(píng)價(jià)參量，在CC 值為1，代表兩個(gè)平面形象完全相似，該目標(biāo)的中心面為最優(yōu)的重構(gòu)造。在0 時(shí)，通過(guò)對(duì)某一步驟的步長(zhǎng)分析，進(jìn)一步計(jì)算出目標(biāo)平面，而目標(biāo)平面左右對(duì)稱平面沒(méi)有相似性，無(wú)法確定最優(yōu)聚焦位置。將光軸切片地重建物體的強(qiáng)度重構(gòu)象沿著?z 固定步長(zhǎng)，?CZ/2 為左右對(duì)稱平面與中心平面之間的距離，并利用該相關(guān)因子的峰值來(lái)判定焦平面的位置在光軸上的重構(gòu)象對(duì)稱的兩面圖像之間的關(guān)聯(lián)性。

在CC 值為1，代表兩個(gè)平面形象完全相似，該目標(biāo)的中心面為最優(yōu)的重構(gòu)造。在0 時(shí)，通過(guò)對(duì)某一步驟的步長(zhǎng)分析，進(jìn)一步計(jì)算出目標(biāo)平面，而目標(biāo)平面左右對(duì)稱平面沒(méi)有相似性，無(wú)法確定最優(yōu)聚焦位置。將光軸切片地重建物體的強(qiáng)度重構(gòu)象沿著?z 固定步長(zhǎng)，?CZ/2 為左右對(duì)稱平面與中心平面之間的距離，并利用該相關(guān)因子的峰值來(lái)判定焦平面的位置在光軸上的重構(gòu)象對(duì)稱的兩面圖像之間的關(guān)聯(lián)性。

1.2 振幅和相位的焦平面方法

利用測(cè)量方法可以大致測(cè)量出目標(biāo)的記錄距離，但是由于光相干成像技術(shù)的傳輸特性和目標(biāo)對(duì)象的動(dòng)力學(xué)特性，導(dǎo)致了目標(biāo)的熱物理性質(zhì)會(huì)引起目標(biāo)的表面變形或位移，當(dāng)外部因素的影響時(shí)，目標(biāo)的熱物理性質(zhì)就無(wú)法精確地測(cè)量出實(shí)時(shí)光學(xué)系統(tǒng)中目標(biāo)的記錄距離。復(fù)建離焦圖像模糊物體信息不失去，復(fù)建圖像清晰物體焦平面在理想狀態(tài)下不失去。合理的自動(dòng)聚焦算法在數(shù)字全息的數(shù)字化重建過(guò)程中通過(guò)聚焦函數(shù)準(zhǔn)確判斷最佳焦平面位置，在高精度測(cè)定中，例如MEMS 故障檢測(cè)等具有重要意義。物體波前表示為E（x，y）=a（x，y）exp[iφ（x，y）]，a（x，y）為物體振幅信息，φ（x，y）為物體相位信息，a（x，y）或φ（x，y）只是物體波前信息中的某部分信息，將a（x，y）和φ（x，y）同時(shí)運(yùn)用于聚焦算法中，準(zhǔn)確確定再現(xiàn)距離，提高焦平面定位精度。

物體波前的相位信息被包裹在2π 中，當(dāng)物體的相位信息大于一個(gè)波長(zhǎng)時(shí)。通過(guò)對(duì)解包裹后的相位信息進(jìn)行計(jì)算，可以得到目標(biāo)的相位信息，這是由于相位解包裹方法的發(fā)展而產(chǎn)生的。采用相關(guān)系數(shù)方法，采用解包后的相位信息作為評(píng)估參數(shù)，能夠準(zhǔn)確地判定目標(biāo)的焦平面最優(yōu)的位置。通過(guò)理論和試驗(yàn)，證明了該聚焦算法在焦平面上的最大聚焦函數(shù)曲線中，得到的曲線呈現(xiàn)出對(duì)稱的分布，兩側(cè)對(duì)稱圖像的相似性較高或一致。沿著光軸分析目標(biāo)物體重建像，得到用相位信息作為參量的相關(guān)系數(shù)法聚焦函數(shù)曲線，最高峰值處為最佳聚焦位置。

利用波長(zhǎng)632.8 nm 激光，CCD 分辨率2 048×2 048，7.4 um×7.4 um，以不同尺寸各顆粒徑標(biāo)準(zhǔn)靶面上為觀察對(duì)象來(lái)驗(yàn)證相位信息運(yùn)用于聚焦算法的可行性，并對(duì)比分析振幅聚焦函數(shù)，相位聚焦函數(shù)，波前信息聚焦函數(shù)。靶面圖像及相應(yīng)的全息圖見(jiàn)圖1。將振幅信息和相位信息運(yùn)用于相關(guān)系數(shù)法聚焦函數(shù)，函數(shù)曲線及對(duì)應(yīng)峰值重建像見(jiàn)圖2。振幅信息和相位信息的聚焦函數(shù)峰值確定的最佳聚焦位置為181.47 mm和181.20 mm。運(yùn)用線性加權(quán)原理，將振幅信息和相位信息加權(quán)作為定焦算子，最終得到的最佳重建位置為181.335 mm。加權(quán)后的最佳聚焦位置同時(shí)將物體振幅和位相作為聚焦參量，完成物體波前信息作為參量的聚焦。

圖1

圖2

2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

通過(guò)波長(zhǎng)632.8 nm 激光，CCD 分辨率36642748，像元大小1.67 um×1.67 um 為實(shí)驗(yàn)儀器，洋蔥表皮細(xì)胞制成的生物標(biāo)本為觀測(cè)對(duì)象，建立了數(shù)字化全息成像體系，并對(duì)其進(jìn)行了試驗(yàn)和分析。洋蔥表皮細(xì)胞因生長(zhǎng)周期不同而不同，且受到外界環(huán)境影響，一般為微米量級(jí)。在洋蔥表皮細(xì)胞成像后，利用有關(guān)系數(shù)聚焦曲線和重建強(qiáng)度，對(duì)其幅度和解包裹相位進(jìn)行了分析。振幅和相位曲線峰值確定的最佳重建位置為151.25 mm 和152.95 mm，物體波前信息判定的最佳重建位置為152.1 mm。位相分布圖及位相局部分布放大圖分別見(jiàn)圖3 和圖4。

圖3 不同重建方法位相分布結(jié)果

圖4 放大圖

3 結(jié)論

振幅，相位和波前聚焦算法的洋蔥表皮細(xì)胞強(qiáng)度重建像中，相位聚焦確定的最佳聚焦位置邊緣處對(duì)比清晰，振幅確定的焦平面邊緣較相位模糊，但表皮細(xì)胞的重建像相對(duì)清晰。波前信息重建結(jié)果較好，對(duì)比度高。洋蔥表皮細(xì)胞相位重建結(jié)果進(jìn)行分布，將相位信息作為聚焦算法參量的分布，邊緣銳化明顯，明顯區(qū)別于載玻片，但是在表皮邊緣內(nèi)部的細(xì)胞則銳利度不高與背景的區(qū)分不明顯。觀察振幅信息作為聚焦算法參量的位相分布，表皮區(qū)域內(nèi)細(xì)胞清晰度高形態(tài)可見(jiàn)，但是表皮周邊細(xì)胞模糊，形態(tài)不明顯。同時(shí)物體振幅和相位即目標(biāo)物體整體波前信息作為聚焦算法參量的位相分布放大圖，表皮邊緣細(xì)胞清晰度高于運(yùn)用振幅信息作參量進(jìn)行聚焦重建像，且表皮內(nèi)部的細(xì)胞形貌清晰可見(jiàn)，優(yōu)于將相位信息作為參量的聚焦重建像。從目標(biāo)觀測(cè)物體的強(qiáng)度和位相分布中的對(duì)比分析，將物體振幅和相位作為相關(guān)系數(shù)法聚焦參量的聚焦算法具有優(yōu)越性，能提高單一聚焦參量的聚焦算法最佳重建像的質(zhì)量。